Гаплоидный партеногенез in vitro у сахарной свеклы (Beta vulgaris L.): факторы и диагностические признаки

Современный отечественный генофонд сахарной свеклы достаточен для создания сортов с требуемыми свойствами, однако традиционное получение инбредных линий и гибридизация длительны и трудоемки, что обусловлено 2-летним циклом развития растений, само- и перекрестной несовместимостью, инбредной депрессией (1). Биотехнологический метод гаплоидии, предполагающий культивирование растений в условиях in vitro (2), эффективен для индукции генотипического многообразия в исходной популяции, но его применение ограничено узкой специфичностью этих условий не только для разных генотипов одного вида, но и в зависимости от этапа культивирования. Варьирование, наблюдаемое при культивирова-

^∗ Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ «Научная школа РФ» (НШ=5282.2014.4 — проект «Разработка теории репродукции растений с позиции проблемы целостности и надежности биосистем. Поливариантность морфогенетических программ развития, естественные и искусственные модели их реализации».

нии репродуктивных органов растений, может значительно расширить пределы изменчивости и облегчить получение форм для селекционных целей (в том числе на основе удвоенных гаплоидов) (3).

Для усовершенствования метода гаплоидного партеногенеза у сахарной свеклы оптимизируются условия индукции неоплодотворенных семязачатков и культивирования гаплоидных регенерантов с ценными генетическими рекомбинациями, отрабатываются приемы включения реституционных линий в селекционный процесс (4-8). Наиболее сложная проблема — гормональный состав питательных сред при культивировании in vitro (отметим, что принцип эмпирического подбора условий для индукции гаплоидии остается доминирующим) (9-10). Представляет интерес использование жидких сред, значительно повышающее выход гаплоидных регенерантов (11), спонтанная диплоидизация гаплоидов при длительном (более 1 года) культивировании (12), предобработка семязачатков агентами (колхицин, трифлуралин и др.), вызывающими антимитотическую активность клеток женского гаметофита и повышающими частоту гаплоидной регенерации (13). Сравнение морфологии гаплоидов и удвоенных гаплоидных регенерантов выявило преимущества первых по скорости развития побегов и размножения in vitro. На этом основании предлагается использовать гаплоиды сахарной свеклы не только для получения удвоенных гаплоидов, но и в специализированных проектах, касающихся геномного анализа, или при генетической трансформации, когда гаплоидные ткани служат исходным материалом (14).

У сахарной свеклы культивирование in vitro неоплодотворенных семязачатков и получение из них гаплоидов позволило направленно создавать гомозиготные линии для селекции (9, 15). Однако коммерческое применение этих технологий ограничивается низким выходом гаплоидных регенерантов и недостаточной методической разработанностью в том, что касается критических периодов в развитии зародышевого мешка, установления морфогенетической компетентности его элементов для переключения с гаметофитной на спорофитную программу развития, биохимической и молекулярно-генетической оценки создаваемых гомозиготных линий.

Мы впервые проанализировали признаки, связанные с морфогенезом и воспроизведением растений-регенерантов сахарной свеклы in vitro при гаплоидном партеногенезе, и показали возможность их использования в качестве диагностических для оценки критических периодов в развитии женского гаметофита при переходе на спорофитный путь морфогенеза. Кроме того, применение RFLP-анализа с рестриктазой Hind III впервые позволило выделять гаплоидные микроклоны по типу цитоплазмы (N или S) из сортовых популяций сахарной свеклы, облегчая задачу создания линий с ЦМС.

Цель работы — выявить признаки, позволяющие повысить эффективность гаплоидного партеногенеза у сахарной свеклы in vitro, в том числе в сочетании с биохимическими и молекулярными маркерами.

Методика . Для культивирования органов и тканей использовали гибриды Beta vulgaris L. (коллекция Всероссийского НИИ сахарной свеклы и сахара им. А.Л. Мазлумова). Применяли общепринятую технику стерилизации и приготовления питательных сред по Р.Г. Бутенко (2).

Активность фермента NADP-изоцитратдегидрогеназы определяли в гомогенатах растительных тканей (16). Электрофорез изоферментов в крахмальном геле и ПААГ проводили согласно описанию (17).

RFLP-анализ (restriction fragment length polymorphism) с Hind III (18) применяли для выявления стерильных и фертильных гаплоидных регенерантов. Продукты разделяли электрофорезом в 1 % агарозном геле с добавлением бромистого этидия.

Плоидность определяли на проточном цитофотометре Ploidy Analys- er PA-2 («Partec GmbH», Германия) (11).

Достоверность цитоэмбриологических данных оценивали с помощью коэффициента вариации Сv (19).

Результаты . При культивировании in vitro неоплодотворенных семязачатков сахарной свеклы была обнаружена уникальная способность эмбриогенных клеток к реализации потенциала развития под влиянием экзогенных факторов (20), что позволило разработать технологию получения гомозиготных линий. Благодаря этому приему генетически и морфологически разнообразный материал от обогащенных в генетическом отношении растений-доноров получают без многократного самоопыления. Предложенная технология обеспечивает выход до 38 гаплоидных регенерантов от одного растения-донора и создание гомозиготного материала сахарной свеклы за 2-3 года (вместо 8-10 лет при традиционных методах). В настоящее время свыше 100 таких гомозиготных линий используются в селекционных программах (20). Эксперименты выявили ряд морфологических, цитоэмбриологических, биохимических и молекулярно-генетических признаков, повышающих эффективность обнаружения гаплоидов при индукции гаплоидного партеногенеза in vitro, что ускоряет создание гомозиготных линий.

На этапе введения семязачатков в культуру к критическим факторам, влияющим на эффективность гаплоидной регенерации, относится период развития цветоносных побегов у донорских растений. У сахарной свеклы оптимальна фаза бутонизации в конце периода раннего генеративного состояния соцветий (VII и VIII этапы органогенеза) (21). Бутоны с семязачатками, более способные к индуцированию гаплоидии и максимально пригодные для эксплантации, находятся в центральном колосе кистевидной части плейохазия. Регенерационная активность наблюдается в семязачатках с 1-го по 25-й бутон (расположены по колосовидному цветоносу вверх от раскрывшегося цветка).

Для успешного культивирования семязачатков также необходимо выбрать оптимальную стадию развития зародышевого мешка. Цитоэмбрио-логические наблюдения показали, что ядра и клетки женского гаметофита у сахарной свеклы способны к новообразованиям in vitro на всех этапах развития. По-видимому, это связано с особенностями женского гаметофита, в первую очередь с хорошо выраженной полярностью, дифференцирующими делениями и тотипотентностью его элементов, что в условиях in vitro стимулирует инициацию программы формирования гаплоидных регенерантов. По нашим данным, поляризация начиналась в одноядерном зародышевом мешке, который по мере развития увеличивался в размере и вытягивался в направлении к микропиле. В результате последующих трех митотических делений образуется 8-ядерный зародышевый мешок. После последнего митоза от каждого полюса к центру отходит по одному полярному ядру. Вокруг ядер локализуется цитоплазма и происходит цитокинез, который завершается образованием семи клеток зародышевого мешка (22).

Культивирование изолированных семязачатков, содержащих 8-ядерные (или 7-клеточные, но 8-ядерные) зародышевые мешки, наиболее благоприятно для индуцирования гаплоидии и регенерации (8). Можно предположить, что строгая полярность зародышевого мешка в этот период, а также тотипотентность его ядер и неспециализированных клеток женского гаметофита обеспечивают наибольшую способность к морфогенезу. Это критический фактор для переключения на спорофитный тип развития.

Определение стадий развития зародышевого мешка — сложный и длительный процесс. Здесь критический период диагностируется по эмбриологическим признакам — наличию одноядерных микроспор и 2-3638

клеточных пыльцевых зерен пыльников, находящихся в одном бутоне с семязачатками. В зависимости от погодных условий в период цветения эти признаки можно наблюдать за 1-5 сут до раскрытия бутонов.

Диагностическими признаками также могут служить аномалии мужского и женского гаметофитов, которые проявлялись у некоторых генотипов, полученных при длительном самоопылении и полиплоидии, а также у ЦМС-гибридов, где с частотой до 40 % встречался апомиксис. Возможно, рецессивные гены, вовлеченные в контроль апомиксиса (23), в том числе в гаплоидный партеногенез, по-разному накапливаются при селекции. Генотипы с наибольшими аномалиями более склонны к индукции гаплоидии in vitro.

Существенный недостаток гаплоидной технологии in vitro — низкая частота регенерации (1,7-10,5 %). Ее повышают стрессовые воздействия, например предобработка семязачатков холодом (4-6 ° С, 2-4 сут) или рентгеновским облучением (1000-5000 Р, 50 мин) (24). Возможно, in vitro у семязачатков сахарной свеклы (по аналогии с микроспорами пшеницы) (25) низкие положительные температуры, изменяя метаболизм, задерживают развитие зародышевого мешка и индуцируют спорофитный морфогенез.

Гормональный состав сред при культивировании семязачатков тоже был ключевым фактором, определяя тип морфогенеза — через регенерацию (эмбриоидогенез) или через каллус (гемморизогенез) (26).

В наших опытах индукцию и морфогенез гаплоидных регенерантов по типу спорофита лимитировала среда на основе минеральных солей по Гамборгу (В5) с витаминами по Уайту и различным гормональным составом (26). Так, добавление гиббереллина (2 мг/л) индуцировало эмбриоидо-генез гаплоидных регенерантов. В зародышевом мешке семязачатка с первых дней культивирования наблюдали деление клеток яйцевого аппарата с образованием уже на 3-и сут многоклеточного (5-8 ярусов клеток) про-эмбрио. К 5-м сут зародыш принимал форму шара и увеличивался в размере за счет делений в поперечном и продольном направлениях, заполняя на 8-12-е сут все пространство зародышевого мешка (при этом гаусториаль-ный вырост в нуцеллус не увеличивался). Центральная клетка, не приступая к делению, сохранялась до 5-8-х сут, затем дегенерировала. Иногда формировалось несколько ядер эндосперма, которые также дегенерировали. Крахмал в клетках нуцеллуса не откладывался, перисперм и оболочки семени не формировались. На 28-е сут зародыш разрывал интегументы и проросток появлялся на поверхности семязачатка с образованием небольших семядольных листочков, гипокотиля и первичного корешка. Это свидетельствует о сходстве гаплоидного эмбриоидогенеза и эмбриогенеза зиготического зародыша, однако эмбриоид формируется только с использованием минеральных солей среды культивирования (без участия питательных веществ эндосперма, который в условиях in vitro вообще не образуется).

Ауксины стимулировали рост каллусных структур наряду с гиноге-нетическими зародышами. Гиббереллин (2 мг/л), 6-бензиламинопурин (0,1 мг/л) и индолил-3-масляная кислота (0,1 мг/л) индуцировали развитие гаплоидных эмбриоидов, а затем вторичных регенерантов из каллусных тканей гипокотиля, что 6-10-кратно увеличивало выход гаплоидов (20). Поскольку тотипотентность клеток гетерогенного каллуса неодинакова, возможно формирование двух основных типов каллуса — морфогенного и неморфогенного. Неморфогенный состоит из паренхимных клеток и не регенерирует. В морфогенном каллусе (имел более плотную мелкозернистую структуру) происходили формообразовательные процессы — либо ризогенез, либо гем-могенез (появление почек), либо гемморизогенез. Гемморизогенез начинался в субэпидермальном слое каллуса. В условиях in vitro появлялись инициаль- ные клетки с утолщенной клеточной оболочкой и более крупным ядром, из которых de novo развивались зоны меристемы (в виде бугорков). В результате периклинальных делений на внешней стороне бугорков формировался апекс (серповидный валик) и примордий 1-го листа, то есть ростовая почка. Апексы корней закладывались в боковой или базальной части каллуса. Между корнем и почкой формировался проводящий пучок. Воспроизведение растений через каллус происходило при гемморизогенезе или геммоге-незе с последующей индукцией корневой системы по истечении 3-4 нед.

Культивирование неоплодотворенных семязачатков в жидкой питательной среде усиливало пролиферацию клеток женского гаметофита, длительно (до 4-6 мес) сохраняя их жизнеспособность. Перенос этих эксплантов на агаризованную среду того же состава стимулировал регенерацию (на 13,7 и 18,9 % — через каллусо- и эмбриоидогенез). Отметим, что каллус — система с непрямым органогенезом, что увеличивает время получения регенерантов, поэтому прямая регенерация in vitro более перспективна для селекции.

Этап стабилизации включает отбор нормально развитых гаплоидных растений-регенерантов (27) с высокой способностью к формированию адвентивных побегов и микроклональному размножению. Для повышения эффективности на этом этапе использовали морфологические и цитологические признаки. Так, у гаплоидных регенерантов высота и размер всех органов обычно меньше, чем у диплоидов. У нормально развитых гаплоидных форм в зависимости от генотипа более узкие листовые пластинки с длинными черешками или, наоборот, широкие листья с волнистым краем и короткими черешками. Характерный цитологический признак гаплоидов — 9 хромосом, которые выявляются при микроксопировании или цитофотометрически по содержанию ядерной ДНК (28). Последний метод быстрее, надежнее и может широко применяться для выявления растений с измененной плоидностью. К цитоэмбриологическим признакам следует отнести наличие 8-10 хлоропластов в замыкающих клетках устьиц, среди которых встречаются аномальные или не формирующие хлоропласты либо имеющие одну бобовидную клетку. Так как цитоэмбриологические признаки у гаплоидов варьировали незначительно, их можно использовать в качестве морфологических маркеров для идентификации и отбора гаплоидных регенерантов. Это позволяет проводить оценку на самых ранних этапах развития регенерантов, когда анализ хромосомного набора крайне затруднен и приводит к гибели эксплантов.

При колхицинировании гаплоидов (27) происходила полиплоидиза-ция с образованием диплоидных, триплоидных и тетраплоидных форм. При повышении плоидности увеличивалось число хлоропластов в паре замыкающих клеток устьиц: с 9-11 у гаплоидов до 12-14, 15-17 и 18-21 соответственно у ди-, три- и тетраплоидов. Изменялось и соотношение площади замыкающих клеток у гаплоидных и ди-, три и тетраплоидных форм — соответственно 1:1,56; 1:1,87; 1:2,68 (табл. 1).

1. Цитоморфологические характеристики пар замыкающих клеток устьиц у растений сахарной свеклы ( Beta vulgaris L.) при разной плоидности

Плоидность	Просмотрено пар клеток	Число хлоропластов, шт.		Cv , %	Площадь, мкм2	Cv , %
		среднее	min-max
Гаплоидный (½)	250	10,2	9,4-10,9	9,3	0,95	0,9
Дигаплоидный (2½)	250	13,2	11,8-14,5	9,7	1,48	1,6
Триплоидный (3½)	250	15,5	14,4-16,6	5,8	1,78	1,8
Тетраплоидный (4½)	250	19,7	18,5-20,9	6,4	2,55	1,3

Отметим, что у некоторых удвоенных гаплоидов при размножении (in vitro и в грунте) восстанавливалось гаплоидное состояние, что, возможно, объясняется более коротким митотическим циклом у гаплоидных регенеран-640

тов. Поэтому при колхицинировании и внутриклеточном отборе возможно увеличение доли гаплоидных клеток в миксоплоидной меристеме регенерантов, что отрицательно сказывается на диплоидизации. Для усиления эффекта диплоидизации гаплоидов in vitro мы изменяли гормональный состав питательной среды, добавляя цитокинины и гиббереллин, тормозящие рост гаплоидной ткани. Высокой способностью стимулировать клеточное деление у диплоидов и тормозить — у гаплоидов обладал кинетин при добавлении до 0,25 мг/л, что позволяло получать до 90 % регенерантов с постоянным диплоидным набором хромосом.

Удобным инструментом выявления гаплоидных регенерантов сахарной свеклы служит сравнение изоферментных спектров. При исследовании электрофоретической подвижности изоформ NADP-изоцитратдегидрогеназы (NADP-ИДГ, КФ 1.1.1.42) нами обнаружены отличия гаплоидных регенерантов от исходного диплоидного растения. Ранее мы показали присутствие двух изоформ NADP-ИДГ — цитоплазматической ( ∼ 95 % активности) и митохондриальной ( ∼ 5 % активности) в листьях контрольных растений, что согласуется с результатами электрофореза: у контрольных вариантов имелись две изоформы NADP-ИДГ (R_f 0,31 и 0,39) с полосами одинаковой интенсивности, а у гаплоидов фермент был представлен двумя зонами активности — мономорфной (R_f 0,37) и полиморфной (R_f 0,26 и 0,31).

Изоферментный анализ можно также использовать для определения степени гомозиготности формируемых в результате стабилизирующего отбора реституционных линий. Теоретически все линии удвоенных гаплоидов должны быть гомозиготными. Однако у реституционных линий, полученных после обработки колхицином, выявляется в среднем 4 % гетерозиготных локусов (29). Не исключено, что такой полиморфизм можно объяснить эпигенетической изменчивостью у удвоенных гаплоидов сахарной свеклы (30, 31). Индекс изоферментной гомозиготности (Iiz) в проанализированных линиях, определенный как средний процент гомозиготности по семи изофер-ментным локусам, варьировал от 0,81 до 1 (29) и в среднем составил 0,96 (табл. 2). Вероятно, гомозиготность этих реституционных линий достоточна высока, несмотря на возможные эпигенетические изменения.

2. Показатели изоферментной гомозиготности у реституционных линий сахарной свеклы ( Beta vulgaris L.)

Линия	Доля гомозигот по изоферментным локусам, %							Индекс изоферментной
	Adh-1 1	Mdh	1 1 Mdh-2 1	Me-1	Idh-1 1	Idh-2	1 Gdh-1	гомозиготности Iiz
1	100	87	93	88	100	100	100	0,95
2	100	97	100	68	100	100	96	0,94
3	100	40	93	42	100	100	93	0,81
4	100	87	93	100	100	100	100	0,97
5	100	100	100	100	100	100	100	1,00
6	100	100	100	96	100	96	100	0,99
7	100	100	100	96	93	96	100	0,98
8	97	79	84	96	100	100	100	0,94
Среднее	99	86	95	98	99	99	99	0,96

Молекулярные маркеры нейтральны по отношению к фенотипу, нетканеспецифичны, их можно обнаружить на любой стадии развития растений. Они позволяют контролировать передачу генетического материала от растений-доноров и вести отбор на искомый селекционный признак, например на цитоплазматическую мужскую стерильность (32, 33). Известно, что в популяциях сахарной свеклы присутствуют растения с нормальной (N) и стерильной (S) цитоплазмой. У N-растений пыльца фертильна и жизнеспособна, у S-растений она может быть как фертильной, так и стерильной в зависимости от взаимодействия стерильной (S) цитоплазмы с рецессивными генами ядра rf1 и rf2. Стерильность цитоплазмы у сахарной свеклы обусловлена изменением нуклеотидной последовательности в митохондриальном и хлоропластном геномах (34, 35).

Наши исследования показали, что PCR и RFLP-анализ с использованием рестриктазы Hind III позволяет идентифицировать тип цитоплазмы у создаваемых гаплоидов по числу рестриктов. У гаплоидных микроклонов с нормальной и стерильной цитоплазмой амплифицировался один фрагмент (800 п.н.), который рестрицировался только у стерильных (S) форм (рис.; видны два рестрикта и остатки фрагмента 800 п.н.).

Электрофореграмма рестриктов ампли-фицированных фрагментов ДНК (RFLP-анализ, рестриктаза Hind III ) у гаплоидных растений-регенерантов сахарной свеклы ( Beta vulgaris L.): К1 — контрольные фертильные растения, К2 — контрольные стерильные растения; 1-5 — формы с нормальной (N) цитоплазмой, 6-8 — формы со стерильной (S) цитоплазмой; М — маркеры молекулярных масс (ДНК-маркер MassRuler™, 80-1031 п.н., SM0383, «Thermo Scientific», США).

Гаплоиды, у которых этот фрагмент не рестрицировался Hind III, были представлены полностью фертильными формами с нормальной цитоплазмой (N) и ядерными генами в рецессивном состоянии ( rf ). В остальных образцах наблюдался полиморфизм фрагментов, что, по-видимому, предполагает наличие у соответствующих гаплоидных форм стерильной цитоплазмы (S) и разное сочетание рецессивных и доминантных аллелей ядерных генов Rf₁ / rf₁ и Rf₂ / rf₂ . Отметим, что PCR-профили у всех стерильных регенерантов (как гаплоидов, так и удвоенных гаплоидов) одинаковы. Поэтому выявление растений-регенерантов со стерильной цитоплазмой на разных этапах культивирования представляет значительный интерес для селекции сахарной свеклы, облегчая создание линий с ЦМС и высокопродуктивных гибридов на стерильной основе. Таким образом, показана эффективность использования комплекса диагностических признаков для совершенствования метода гаплоидного партеногенеза in vitro у сахарной свеклы. Выявленные маркерные фенотипические, морфологические, цитоэмбриологические показатели надежно характеризуют критические периоды для развития генеративных органов растений-доноров и индукции гаплоидии, а также стадии морфогенеза in vitro, наиболее благоприятные при стабилизирующих отборах гаплоидов и удвоенных гаплоидов. Определение электрофоретической подвижности изоферментов и молекулярное маркирование позволяют оценивать степень гомозиготности созданных линий. Использование RFLP-анализа дает возможность вести отбор гаплоидных регенерантов на искомый селекционный признак, например цитоплазматическую мужскую стерильность (ЦМС), и формировать линии, гомозиготные по ЦМС.