GATCGGenerator: новый генератор для создания квазислучайных нуклеотидных последовательностей

Введение. В последние десятилетия знания о ДНК все шире применяются для решения небиологических задач (вычисления с помощью ДНК, долговременное хранение информации). В первую очередь речь идет о случаях, когда необходимо подобрать искусственные нуклеотидные последовательности. Для их создания используются специальные программы. Однако существующие генераторы не учитывают физико-химические свойства ДНК и не позволяют получать последовательности с явно выраженной «небиологической» структурой. Фактически они генерируют последовательности, распределяя нуклеотиды случайным образом. Целью данной работы является создание генератора квазислучайных последовательностей с особой нуклеотидной структурой. Он должен учитывать некоторые физико-химические особенности нуклеотидных структур и будет задействован при хранении небиологической информации в ДНК.

Материалы и методы. Описано новое программное обеспечение GATCGGenerator для генерации квазислучайных последовательностей нуклеотидов. Оно предоставляется как SaaS (от англ. software as a service — программное обеспечение как услуга), что обеспечивает его доступность с разных устройств и платформ. Программа генерирует последовательности определенной структуры с учетом гуанинцитозинового (GC) состава и содержания динуклеотидов. Представлена работа алгоритма новой программы. Требования к сгенерированным нуклеотидным последовательностям заданы с помощью чата в «Телеграм» (Telegram), наглядно показано взаимодействие с пользователем. Определены и обобщены различия входных параметров и получаемых в результате работы программы конкретных нуклеотидных структур. Также в сопоставлении даны временные затраты генерации последовательностей при различных входных данных. Изучены короткие последовательности, различающиеся по типу, длине, GC-составу и содержанию динуклеотидов. В табличном виде показано, как в этом случае соотносятся входные и выходные параметры.

Результаты исследования . Созданное программное обеспечение сравнили с существующими генераторами нуклеотидных последовательностей. Установлено, что генерируемые последовательности отличаются по структуре от известных ДНК-последовательностей живых организмов, а значит, могут быть использованы в качестве вспомогательных или маскирующих олигонуклеотидов, пригодных для молекулярно-биологических манипуляций (например — реакции амплификации), а также для хранения в молекулах ДНК небиологической информации (изображений, текстов и т. д.). Предложенное решение дает возможность формировать специфические последовательности длиной от 20 до 5 000 нуклеотидов с заданным числом динуклеотидов и без гомополимерных участков. Более жесткие условия генерации снимают известные ограничения и позволяют создавать квазислучайные последовательности нуклеотидов по заданным входным параметрам. Кроме количества и длины последовательностей можно заранее определить GC-состав, содержание динуклеотидов и природу нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК).

Приводятся примеры коротких последовательностей, различающихся по длине, GC-составу и содержанию динуклеотидов.

Полученные 30-нуклеотидные последовательности прошли проверку. Установлено отсутствие 100-процентной гомологии с известными ДНК-последовательностями живых организмов. Максимальное совпадение наблюдалось для сгенерированных последовательностей длиной 25 нуклеотидов (сходство около 80 %). Таким образом доказано, что GATCGGenerator может с высокой эффективностью генерировать небиологические нуклеотидные последовательности.

Обсуждение и заключение . Новый генератор позволяет создавать нуклеотидные последовательности in silico с заданным GC-составом. Решение дает возможность исключить гомополимерные фрагменты, что качественно улучшает физико-химическую стабильность последовательностей.

Original article

GATCGGenerator: New Software for Generation of Quasirandom Nucleotide Sequences

Olga Yu. Kiryanova ¹ M ©, Ravil R. Garafutdinov ² Ф, Irek M. Gubaydullin ³ Ф, Aleksei V. Chemeris²®

• ¹    Ufa State Petroleum Technological University, Ufa, Russian Federation

• ²    Institute of Biochemistry and Genetics, Ufa Federal Research Center, RAS, Ufa, Russian Federation

• ³    Institute of Petrochemistry and Catalysis, RAS, Ufa, Russian Federation

Introduction. In recent decades, knowledge about DNA has been increasingly used to solve biological problems (calculations using DNA, long-term storage of information). Principally, we are talking about cases when it is required to select artificial nucleotide sequences. Special programs are used to create them. However, existing generators do not take into account the physicochemical properties of DNA and do not allow obtaining sequences with a pronounced “non-biological” structure. In fact, they generate sequences by distributing nucleotides randomly. The objective of this work is to create a generator of quasirandom sequences with a special nucleotide structure. It should take into account some physicochemical features of nucleotide structures, and it will be involved in storing non-biological information in DNA. Materials and Methods . A new GATCGGenerator software for generating quasirandom sequences of nucleotides was described. It was presented as SaaS (from “software as a service”), which provided its availability from various devices and platforms. The program generated sequences of a certain structure taking into account the guanine-cytosine (GC) composition and the content of dinucleotides. The performance of the new program algorithm was presented. The requirements for the generated nucleotide sequences were set using a chat in Telegram, the interaction with the user was clearly shown. The differences between the input parameters and the specific nucleotide structures obtained as a result of the program were determined and generalized. Also, the time costs of generating sequences for different input data were given in comparison. Short sequences differing in type, length, GC composition and dinucleotide content were studied. The tabular form shows how the input and output parameters are correlated in this case.

Информатика, вычислительная техника и управление

Results. The developed software was compared to existing nucleotide sequence generators. It has been established that the generated sequences differ in structure from the known DNA sequences of living organisms, which means that they can be used as auxiliary or masking oligonucleotides suitable for molecular biological manipulations (e.g., amplification reactions), as well as for storing non-biological information (images, texts, etc.) in DNA molecules. The proposed solution makes it possible to form specific sequences from 20 to 5 000 nucleotides long with a given number of dinucleotides and without homopolymer fragments. More stringent generation conditions remove known limitations and provide the creation of quasirandom sequences of nucleotides according to specified input parameters. In addition to the number and length of sequences, it is possible to determine the GC composition, the content of dinucleotides, and the nature of the nucleic acid (DNA or RNA) in advance. Examples of short sequences differing in length, GC composition and dinucleotide content are given. The obtained 30-nucleotide sequences were tested. The absence of 100 % homology with known DNA sequences of living organisms was established. The maximum coincidence was observed for the generated sequences with a length of 25 nucleotides (similarity of about 80 %). Thus, it has been proved that GATCGGenerator can generate non-biological nucleotide sequences with high efficiency.

Discussion and Conclusion. The new generator provides the creation of nucleotide sequences in silico with a given GC composition. The solution makes it possible to exclude homopolymer fragments, which improves qualitatively the physicochemical stability of sequences.

Acknowledgements: the authors would like to thank the reviewers for valuable comments that contributed to the improvement of the article.

Funding information . The research is done on RFFI grant no. 20 - 07 - 00222.

Введение. ДНК является уникальным биополимером, обеспечивающим хранение, передачу и воспроизведение генетической информации в живых организмах. Молекулы ДНК состоят из четырех типов нуклеотидов, содержащих азотистые основания аденин (A), гуанин (G), цитозин (C), тимин (T). Их возможные комбинации обеспечивают нуклеотидные последовательности, формирующие функциональные генетические элементы. В молекулярной биологии и генетике основные работы ведутся с нуклеотидными последовательностями живых организмов, однако возрастает потребность в создании искусственных последовательностей, особенно при решении небиологических задач (например, ДНК-вычисления [1, 2], хранение в ДНК [3], криптография [4], ДНК-метчики в гидрологии [5] и др.).

Как ожидается, к концу 2040 года объем информации достигнет нескольких йоттабайт (1024), что требует ее структурирования и хранения. Оба этих процесса существенно влияют на потребление энергетических ресурсов, а также на производство устройств хранения данных и периферийных устройств (жесткие диски, твердотельные накопители). Для хранения такого количества информации требуется более 109 кг особо чистого кремния [6], которого может не хватить. Решение видится в использовании принципов ДНК для работы с масштабными объемами данных.

Нуклеотидные последовательности легко оцифровываются путем присвоения соответствующих двоичных кодов отдельным нуклеотидам [7–11] или блокам нуклеотидов [12–14], поэтому текстовые, графические или мультимедийные файлы можно преобразовывать в последовательности нуклеотидов [15–18]. Искусственные нуклеотидные последовательности можно составить вручную или сгенерировать с помощью специального программного обеспечения (генераторы ДНК) в зависимости от решаемых задач. Некоторые генераторы ДНК разрабатывались как самостоятельные приложения, другие — как часть программных пакетов, предназначенных для решения общих [19] 1 ^, 2 ^, 3 ^, 4 ^, 5 или специфических задач [20]. Как правило, генераторы ДНК разработаны на основе комбинаторных подходов и производят случайные последовательности заданной длины гуанинцитозинового (GC) состава. Однако такие программные решения не учитывают химические свойства нуклеотидов и не позволяют получать последовательности с определенной структурой (например, без гомополимерных участков или длинных повторяющихся мотивов). Поэтому создаваемые такими генераторами последовательности не всегда можно воспроизвести в лабораторных условиях. Кроме того, такие последовательности могут быть идентичны существующим в природе фрагментам ДНК, что вносит неоднозначность при попытках закодировать информацию небиологического характера.

Цель представленной работы — создание генератора нуклеотидных последовательностей особой структуры, которые можно применять при кодировании текстовой, графической и другой информации в молекулах ДНК.

Материалы и методы. Определены критерии, которые следует иметь в виду при создании последовательностей. Учтена необходимость варьировать GC-состав, задавать определенное количество динуклеотидов, исключить гомополимерные участки в последовательностях.

Коллектив авторов разработал программу GATCGGenerator на языке Python 3.6 (Anaconda distribution) 6 . Для создания бота 7 в «Телеграм» (Telegram) использовали Numpy 1.19 [21] и библиотеку Python GATCGGenerator. Решение предоставляется как SaaS (от англ. software as a service — программное обеспечение как услуга), что открывает возможность доступа с разных устройств и платформ.

Входные параметры: количество последовательностей, их длина, GC-состав и содержание динуклеотидов. Генератор исключает повторы длиной от двух нуклеотидов более четырех раз. Результат представлен в виде файла CSV, который содержит следующую информацию: последовательность, GC-состав и количество всех нуклеотидов.

Повторы и гомополимерные фрагменты хранятся в виде отдельного списка. Сначала случайным образом генерируется последовательность из четырех элементов (random.choice(nuc), где nuc = 'ACGT'). Затем выполняется поиск повторов. Если встречается хотя бы один элемент из списка, выполняется новая случайная генерация. Далее рассчитывается GC- и NN-состав. Если NN-состав не соответствует заданному пользователем диапазону, парный нуклеотид заменяется случайным образом и пересчитывается GC-состав. Если последовательность соответствует входным параметрам, она записывается во множество последовательностей (sequences).

Ниже представлена работа алгоритма программы.

Type — тип; GCmin, GCmax — диапазон возможного содержания GС; NNmin, NNmax — диапазон возможного содержания динуклеотидов NN%; N — количество; S — последовательность; l — длина последовательности; count — общее количество последовательностей

Псевдокод

Начало

Ввод (Type, GC, NN, N)

Count = 0

sequences = set()

IF i ≤ N?

Возврат на шаг 1.

ELSE

NN = len(DI_REGEX.findall(''.join(S)))

NN_perc = (NN × 2 / l) × 100

IF NNmin ≤NN_perc ≤ NNmax

Информатика, вычислительная техника и управление

GC = S.count('G') + S.count('C') / l ×100

IF GCmin ≤ GC ≤ GCmax

IF type == DNA

Шаг 2.

A_perc = S.count('A') / l × 100

G_perc = S.count('G') / l × 100

C_perc = S.count('C') / l × 100

T_perc = S.count('T') / l × 100

U_perc = S.count('U') / l × 100

Count = count +1

ELSE S = S.replace('T', 'U')

Шаг 2. )

ELSE

Возврат на шаг 1.

ELSE

Случайная замена второго повторяющегося символа, GC = S.count('G') + S.count('C') / l ×100

Вывод Sequences: (S, GC%, NN%, A%, G%, C%, T/U%) Конец

Требования к сгенерированным нуклеотидным последовательностям задаются с помощью чата в Telegram. Пример взаимодействия с пользователем показан на рис. 1.

Рис. 1. Пример пользовательского чата в Telegram

В рамках представленной работы сравнивались функциональные возможности генераторов случайных последовательностей и GATCGGenerator. Определялись различия входных параметров и получаемых в результате работы программы конкретных нуклеотидных структур (таблица 1).

Таблица 1

Сравнение функциональных возможностей GATCGGenerator с другими генераторами нуклеотидных последовательностей

	GATCGGenerator [20]	Nucleotide Sequence Generator8	DNA Sequence Tools: Random Sequence Generator9	Random DNA Sequence Generator10	Random DNA Sequence11	Random DNA Generator12
Максимальная длина (нуклеотиды)	5 000	1 000 000			10 000	1 000
Число последовательностей	100	1			1; 10; 50; 100	100
Ввод GC-состава (%)	+	-	+		-	+ (*)
GC- состав (%)	интервал		число		-	число
Ввод NN-состава (%)		-
Отсутствие гомополимерных участков	+
Тип последовательности	ДНК/РНК	ДНК	ДНК/РНК/ Протеин	ДНК
Вывод результатов	.CSV file	Текст на экране
(*) Пользователь вводит AT-состав

GATCGGenerator обладает более широким функционалом, дает возможность пользователю указывать количество динуклеотидов, создавать последовательности без протяженных гомополимерных участков и повторов, влияющих на успешность эксперимента. В существующих генераторах возможно только варьирование GC-состава.

Программа, созданная авторами данной научной работы, генерирует заданное количество квазислучайных последовательностей нуклеотидов, не имеющих гомологии с природной ДНК, но пригодных для молекулярнобиологических манипуляций.

Результаты исследования. GATCGGenerator позволяет генерировать специфические последовательности ДНК или РНК длиной от 20 до 5 000 нуклеотидов, содержащие заданное количество динуклеотидов и не содержащие гомополимерных участков (не более двух одинаковых нуклеотидов, расположенных рядом). Более жесткие условия генерации могут привести к длительному подбору последовательностей. В качестве примера приведем небольшой диапазон возможного содержания гуанина и цитозина и динуклеотидов (допустим, GC-состав 45–50 % и NN-состав 10–20 %). Продолжительность работы программы для различных входных данных представлена в таблице 2.

Таблица 2

Временные затраты генерации последовательностей при различных входных данных

Входные данные				Время, с
Длина	Число	GC, %	NN, %
20	10	50–60	20–50	3,45
30	10	50–60	20–50	3,91
20	10	50–60	40–50	9,74
30	10	50–60	40–50	9,53
30	10	40–50	20–20	8,80
1 000	100	45–50	40–50	11,49
2 000	100	45–50	10–20	240,25
5 000	100	50–60	20–50	11,57

GATCGGenerator благодаря более жестким условиям генерации последовательностей снимает ограничения известных генераторов ДНК и создает квазислучайные последовательности нуклеотидов в зависимости от заданных входных параметров. Можно указать необходимое количество последовательностей, их длину, GC-состав и содержание динуклеотидов, а также природу нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК). Например, созданные с помощью GATCGGenerator последовательности могут быть использованы в ДНК-стеганографии, применяемой для защиты и передачи информации путем сокрытия содержания сообщения в последовательности нуклеотидов [3].

Предлагаемое программное решение (GATCGGenerator) позволяет получать набор квазислучайных последовательностей нуклеотидов в зависимости от заданных пользователем входных параметров (тип нуклеиновой кислоты, длина последовательности, GC- и динуклеотидный состав). GATCGGenerator исключает наличие любых нуклеотидных повторов и гомополимерных участков длиннее трех элементов. Сгенерированные последовательности могут быть использованы как служебные или маскирующие (например, в ДНК-стеганографии) и подходят для любых небиологических ферментативных манипуляций. Можно сгенерировать множество искусственных нуклеотидных последовательностей и использовать их для создания универсальной олиготеки, пригодной для многократного кодирования небиологических данных и их длительного хранения.

Информатика, вычислительная техника и управление

Данные, представленные в таблице 3, обобщенно демонстрируют результаты работы программы. Для определенного типа нуклеиновой кислоты (в данном случае ДНК) показаны: содержание динуклеотидов (NN %), количество сгенерированных последовательностей, их длина (нуклеотиды — нт) и GC-состав.

Полученные 30-нуклеотидные последовательности проверили с помощью инструмента Blast от NCBI. Выявлено отсутствие 100-процентной гомологии с известными ДНК-последовательностями живых организмов. Максимальное совпадение наблюдалось для сгенерированных последовательностей длиной 25 нуклеотидов (сходство около 80 %). Это свидетельствует о способности GATCGGenerator с высокой эффективностью генерировать небиологические нуклеотидные последовательности. Можно считать, что сгенерированные таким образом последовательности не имеют абсолютного совпадения с нуклеотидными фрагментами живых организмов.

Таблица 3

Примеры коротких последовательностей, различающихся по длине, GC-составу и содержанию динуклеотидов, %

Входные параметры					Нуклеотидная последовательность, 5’→3’	Выходные параметры
Тип	Число	Длина, нт	GC, %	NN, %*		Длина, нт	GC, %	NN, %*
ДНК	5	30	41– 50	20	CT GG** TATATC GGAA TCATATCGCGCAGTGT	30	46,7	20,0
					AA TCAGCTAGTA GG ACGCAGTAGTG AA TCA	30	43,3	20,0
					G AA TGTAGT CC TA GG CACATACTACGTAGC	30	46,7	20,0
					AG TT GCACTG AA GTCTATGATCT GG CATGC	30	46,7	20,0
					GACACACTACTAT GG ACGTGA GG CAC TT AC	30	50,0	20,0
	5		51– 60		TCAGCTCAGCG CCAA TCGAGC TT ATAGTGC	30	53,3	20,0
					GA GG CTATCGTC AA GCATAGA CC GTGTGCT	30	53,3	20,0
					GACTCAGTAGCTGCT CCGG ACATACAG CC T	30	56,7	20,0
					TCGCGCG TT AGAC TT A GG TCTCATCGCAGC	30	56,7	20,0
					ACGCTCACA GG AG TT CGCATCG AA CGATGC	30	56,7	20,0
	5		41– 50	0	ACGACAGTGATATAGCACGACGTGCTCATA	30	46,7	0,0
					GACTACATCTGATAGTACACGTGCTGCACT	30	46,7	0,0
					TCTATCTCTGCTAGAGCGCTCGTCACTCTA	30	50,0	0,0
					TCTGATCTACTATAGCGATACGTGAGAGTG	30	43,3	0,0
					ACACATATATCGACGCACGCGTCGTAGTAC	30	50,0	0,0
	5	50	41– 60	20	TGCATGA CC ATGCTTGC GG TAGACA TT CAGA CGCGCG AA TAGTA GG ACGA	50	52,0	20,0
					GCATACGAGT GG CATACATA TT AGACTATAC GG TAGTGCATAT GG TGC AA	50	42,0	20,0
					CTGAGACT CC TCTCTGT GG AGCT CC TAGTA C C GTCACGCGTGCTCTG AA G	50	58,0	20,0
					CTGTGTG AA CATACGATGCA TT CTCATCTC GG TAT GG CTG AA GTGCACAT	50	46,0	20,0
					GCGCTGACGTCAT GGTT CATA CCAA TGTAGC ATGATGTGCGATA GG CACA	50	50,0	20,0

*NN показывает долю (%) содержащихся динуклеотидов в нуклеотидной последовательности.

**Динуклеотиды выделены жирным шрифтом.

В этом случае в качестве удобного носителя информации можно задействовать специальные ДНК-олигонуклеотиды искусственного происхождения, содержащие информативную и служебную части. Недавно авторы данной работы предложили использовать NYRN-олигонуклеотиды [14], состоящие из:

– внутренней части (YR)n, кодирующей зашифрованную информацию;

– служебных (вспомогательных) частей S1 и S2, фланкирующих последовательность (YR)n (рис. 2).

5’ — (N) k — (YR) n — (N) m — 3’ служебная кодирующая служебная часть S 1 часть      часть S 2

Рис. 2. Структура NYRN-олигонуклеотидов: N — вырожденные нуклеотиды; Y — пиримидины (C или T); R — пурины (A или G); k , n , m — индексы, соответствующие длине части

Длина участков ( n , k и m ) может варьироваться, но структура служебных частей должна обеспечивать успешное протекание реакций амплификации (длина более 18 нт, 40–60 % GC-состав, отсутствие гомополимерных участков и повторов). GATCGGenerator позволяет включать динуклеотиды NN, содержащие одинаковые парные нуклеотиды (например, AA, GG, CC, TT или UU для РНК), которые могут повысить специфичность молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот.

Обсуждение и заключение. Итак, по итогам выполненной научной работы предложено программное решение (GATCGGenerator), которое в сравнении с традиционными подходами предполагает более жесткие условия генерации последовательностей. Благодаря этой его особенности снимаются ограничения известных генераторов ДНК и формируются квазислучайные последовательности нуклеотидов в зависимости от заданных входных параметров. Исследованы полученные 30-нуклеотидные последовательности. Проверка позволила установить отсутствие 100-процентной гомологии с известными ДНК-последовательностями живых организмов. Максимально (примерно на 80 %) совпали сгенерированные последовательности длиной 25 нуклеотидов.

Отметим также, что для сокрытия информации в NYRN-олигонуклеотидах, необходимо их смешать с маскирующей ДНК. Маскирующие последовательности должны быть аналогичны последовательностям NYRN-олигонуклеотидов, чтобы при попытке считывания скрытой информации невозможно было их распознать без ключевых последовательностей. Адресату должны быть известны ключевые последовательности — праймеры к служебным участкам NYRN-олигонуклеотидов. Адресат может расшифровать переданное сообщение путем выделения информативных последовательностей нуклеотидов с помощью полимеразной цепной реакции с последующим секвенированием. Набор NYRN- и маскирующих олигонуклеотидов можно легко получить с помощью GATCGGenerator, синтезировать, а затем сохранить в виде олиготеки. Для этого достаточно определить оптимальные NYRN-олигонуклеотиды с последующим заполнением олиготеки. В дальнейшем планируется проведение лабораторных экспериментов с целью апробации предложенного метода хранения небиологической информации и проверки жизнеспособности олиготек, получаемых с помощью генератора.