Гемопоэтические показатели при остром облучении мышей, подвергнутых терапии сополимером N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина

Фармакологические средства на основе синтетических ионогенных полимеров представляют большой интерес для фармации и медицины [1-7]. К таким соединениям относятся полимеры на основе мономеров винилпиридинового ряда, обладающие интересными биотропными свойствами, в том числе, иммуномодифицирующей активностью [8-12]. Анализ литературных данных свидетельствует о возможном смягчении эффектов ионизирующего излучения in vivo при воздействии подобных иммуноадъювантных субстанций, в том числе при хроническом внутреннем облучении [13]. Однако проведённые исследования носили достаточно узкий и несистематический характер. В связи с этим целью настоящей работы является выявление возможной противолучевой активности ионогенных синтетических полимеров (сополимеров N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина) при остром облучении in vivо по показателям кроветворной системы мышей.

Материалы и методы

Животные. В экспериментах использовано 280 мышей-самцов линии C57Bl/6j в возрасте 1,5-2,0 месяца с массой тела 18-20 г, содержавшихся в стандартных условиях и на стандартном рационе на основе брикетированных кормов. Мышей распределяли на группы методом рандо-

Панов А.В. – директор по науке, к.х.н.; Кедик С.А. – ген. директор, д.т.н., проф.; Яковлева Т.А. – научн. сотр. ЗАО «Институт фармацевтических технологий». Изместьева О.С. – вед. научн. сотр., к.б.н.; Селиванова Е.И.* – ст. научн. сотр., к.б.н.; Жаворонков Л.П. – зам. директора по научн. работе, д.м.н. МРНЦ им. А.Ф. Цыба – филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России.

• *Контакты: 249036, Калужская обл., Обнинск, ул. Королева, 4. Тел.: (484) 399-71-88; e-mail: selivanova_l@mail.ru .

мизации. Все работы с животными выполняли в соответствии с требованиями нормативноправовых актов о порядке экспериментальной работы и гуманном отношении к животным [14].

Вводимое вещество. Сополимеры N-винилпирролидона с 2-метил-5-винилпиридином синтезировали радикальной сополимеризацией при постоянном соотношении мономеров в реакционной массе, обеспечиваемом периодическим введением смеси исходных мономеров [12]. Выделенный и очищенный сополимер представляет собой белый порошок, содержащий 35 мольных %, состоящих из звеньев 2-метил-5-винилпиридина, и характеризующийся средневязкостной молекулярной массой 43000 Да.

Условия облучения. Тотальное облучение животных осуществляли в контейнерах из оргстекла γ -лучами ⁶⁰Со на терапевтической установке «Луч» (Россия), однократно, в дозах 7,0 и 8,5 Гр, при мощности поглощённой дозы 34,75 сГр/мин. Дозиметрические измерения проводили клиническим дозиметром типа 27012 (Veb RFT Messellktronik «Otto Schon», Германия). Доверительный интервал погрешности измерения при вероятности 0,95 не превышает 9%. При каждой дозе радиационного воздействия было сформировано 5 групп (по 10-14 мышей в каждой): интактный контроль, сополимер, облучение, сополимер + облучение (защитный вариант), облучение + сополимер.

Для анализа радиопротекторных свойств сополимер в дозе 500 мг/кг вводили мышам в/м в объёме 0,2 мл за 20 минут до начала облучения, при изучении лечебного эффекта – в той же дозе через 20 минут после окончания лучевого воздействия.

Оценку радиозащитной и терапевтической эффективности препарата осуществляли по критериям 30-суточной выживаемости и средней продолжительности жизни животных всех экспериментальных групп, а также анализировали по комплексу параметров состояние гемопоэза и ферментативного звена антиоксидантной системы.

Анализ количественных и морфологических характеристик зрелых клеток периферической крови лабораторных мышей всех экспериментальных групп проводили на автоматическом гематологическом анализаторе Abacus junior vet, Diatron (Австрия). С этой целью у части мышей на 6-е сутки после облучения производили забор крови из синуса глаза по 0,25 мл в специальные одноразовые пробирки с ЭДТА (Aquisel® Tube). Во всех экспериментальных группах оценивали содержание эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, морфологическую гетерогенность эритроцитов и тромбоцитов, определяли концентрацию гемоглобина, гемато- и тромбокрит, а также активность основных ферментов антиоксидантной системы и содержание гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в крови и костном мозге, выделенном из бедренной кости тотчас после эвтаназии животных путём цервикальной дислокации.

Определение активности супероксиддисмутазы (СОД). Активность СОД в гемолизате крови (разведение 1:300) оценивали спектрофотометрическим методом (спектрофотометр «UNICO 2804», США) при длине волны 420 нм. Метод основан на торможении ферментом аутоокисления кверцетина, вызванного анион-радикалом (О^- 2 ) [15]. Полученные результаты выражали в количественном содержании очищенного фермента (пг на 1 эритроцит) [16] и в процентном соотношении к исходному уровню.

Определение активности каталазы. Активность каталазы в гемолизированной крови определяли спектрофотометрически общепринятым методом при длине волны 420 нм. Принцип определения основан на способности перекиси водорода образовывать с молибдатом аммония стойкий окрашенный комплекс [16]. Активность каталазы эритроцитов выражали в коли- честве утилизированной перекиси водорода в пикакаталях (мкмоль за 1 мин) на один эритроцит, пкат/эритроцит. С этой целью гемолизат крови разводили таким образом, чтобы в реакционную смесь попадало 106 эритроцитов.

Определение ГСК . ГСК выявляли в костном мозге и крови мышей по высокой экспрессии CD34 и низкой экспрессии CD45 с помощью проточной цитометрии после инкубации образцов с соответствующими антителами и ДНК-связывающим красителем Хехст 33342 («Sigma», USA). Использовали моноклональные антитела к CD34, меченные фикоэритрином (ФЭ), и CD45, меченные флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ) («eBioscience», США). Анализировали пробы на проточном цитофлуориметре FACS Vantage (BDIS, USA) в течение часа после окрашивания. Использовали двухлазерную систему: флуоресценцию ФИТЦа и ФЭ возбуждали с помощью лазерного пучка с длиной волны 488 нм (Spectra Physics, USA); флуоресценцию Хехста 33342 – с помощью лазера 364 нм (Coherent Enterprise, USA). Для измерения флуоресценции ФИТЦа использовали узкополосные фильтры 530/30 нм, ФЭ – 585/30 нм, Хехста 33342 – 424/20 нм. Мощность первого лазера (488 нм) составляла 56 мВт, мощность второго лазера (364 нм) – 10 мВт. В каждом образце анализировали до 100000 клеток, данные сохраняли в файл и затем обрабатывали с помощью программы CellQuestPro (BDIS, USA). Определяли относительное количество (%) CD45^lowСD34⁺Хехст⁺ (в дальнейшем – CD45^lowСD34⁺) ГСК. Затем рассчитывали абсолютное количество ГСК (число клеток/л крови или на бедро), исходя из общей концентрации ядросодержащих клеток в каждом образце.

Статистика. Были определены средние арифметические значения показателей, их стандартные ошибки, медианы и квартили. Для оценки значимости межгрупповых различий использованы параметрические критерии (t-критерий Стьюдента, F-критерий Фишера) и непараметрические (Вилкоксона – Манна – Уитни (U), медианный критерий кси-квадрат и ранговый критерий Вардена) [7]. Различия между группами признавали статистически значимыми при значении интеграла вероятности p, не превышающем 0,05.Статистический анализ проводился с помощью программ Origin 6.0 («MicroCal Software», США) и «Statistica 6.0» (StatSoft, Inc.).

Результаты и обсуждение

Как видно из результатов, представленных в табл. 1, через 30 мин после однократного внутримышечного введения сополимера в дозе 500 мг/кг в периферической крови животных наблюдается рост общего количества лейкоцитов, преимущественно за счёт гранулоцитов. Через 6 суток на фоне сохранившегося лейкоцитоза у мышей этой группы регистрируется снижение количества гранулоцитов и повышение количества лимфоцитов. В состоянии ферментативного звена антиоксидантной системы через 30 мин после однократного введения препарата в указанной дозе отмечается незначительный рост активности супероксиддисмутазы и каталазы (рис. 1). Реакцию подобного типа можно расценить как отклик на манипуляцию, связанную с проведением эксперимента. Однако через 6 суток после инъекции в антиоксидантной системе регистрируется отчётливый сдвиг функционирования основных ферментов, выразившийся в диссоциации их активности: повышении активности супероксиддисмутазы и снижении активности каталазы .

При изолированном воздействии γ-лучами в дозе 8,5 Гр у облучённых животных на 6 сутки регистрируется глубокая лейко- и тромбоцитопения, а в эритроидном ростке кроветворения отмечаются признаки развития гипохромной анемии (табл. 1). На этом фоне отмечается выра- женное опустошение костного мозга, регистрируемое по снижению клеточности костного мозга. Радиационное воздействие в поглощённой дозе 8,5 Гр вызывает 100% гибель облучённого контроля (табл. 2) в течение первых 10 дней после облучения. В состоянии антиоксидантной системы у этих животных регистрируется нарушение в функционировании основных ферментов, проявившееся в диссоциации их активности: выраженное повышение активности супероксид-дисмутазы и снижение активности каталазы. Выявленные отклонения в функционировании ферментов являются более глубокими, чем при изолированном воздействии сополимера. При всех использованных схемах применения испытуемого соединения у животных, облучённых в дозе 8,5 Гр, в пострадиационном периоде на 6 сутки не наблюдается отчётливого восстановления показателей гемопоэза и антиоксидантной системы. С учётом известных радиобиологических закономерностей лучевого поражения и временных параметров восстановления полученные данные вполне ожидаемы. Тем не менее, можно лишь говорить о тенденции к проявлению радиотерапевтического действия при использовании схемы: облучение + сополимер. В этой группе животных на 11-е сутки после острого воздействия у-лучами регистрируется 52,8% выживаемость (при 100% гибели в группе «облучение»), и на 6-е сутки после лучевого воздействия отмечается незначительный рост количества лейкоцитов, снижение степени анемии и тенденция к восстановлению функционирования индикативных ферментов антиоксидантной защиты. Средняя продолжительность жизни погибших животных в этой группе оказалась значимо выше по сравнению с облучённым контролем и группой сополимер + облучение. Этот более длительный период выживания на фоне резкой панцитопении в крови и костном мозге был отмечен и ранее у полимерных препаратов подобного строения [5]. Возможно, имеет значение их иммуномодулирующая активность. Изолированное радиационное воздействие в дозе 7,0 Гр, при которой погибает около 20% животных, вызывает меньшие нарушения в состоянии гемопоэза и антиоксидантной системы, чем доза 8,5 Гр (табл. 3, рис. 2).

Таблица 1

Основные показатели (M ± m) периферической крови и клеточности костного мозга мышей-самцов линии C57Bl/6j при оценке противолучевых свойств сополимера (500 мг/кг )