Гемопоэтические показатели при остром облучении мышей, подвергнутых терапии сополимером N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина
Рубрика: Научные статьи
Статья в выпуске: 1 т.25, 2016 года.
Бесплатный доступ
Получены данные о состоянии гемопоэза и выживаемости мышей после острого облучения в дозах 7 и 8,5 Гр с оценкой морфофункциональных показателей клеток периферической крови и костного мозга. Проведено изучение противолучевых свойств сополимера N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина при внутримышечном введении препарата (500 мг/кг) и двух схемах его использования: за 20 минут до облучения и через 20 минут после облучения при разных поглощённых дозах. В экспериментах на 280 самцах мышей линии C57Bl/6j показано, что применение сополимера при всех использованных схемах введения сопровождается противолучевым эффектом. При облучении животных в абсолютно летальной дозе (8,5 Гр) средняя продолжительность жизни подопытных мышей увеличивается на 40%. Со стороны гемопоэза радиомодифицирующее действие препарата выражается в 5-6 кратном повышении клеточности костного мозга и абсолютного содержания гемопоэтических стволовых клеток (7 Гр) со значительным выходом в кровь зрелых и пролиферирующих клеток. С учётом полученных данных изучаемый сополимер, по-видимому, можно отнести к группе радиомитигаторов, действие которых реализуется через активацию ряда провоспалительных сигнальных путей и усиление секреции гемопоэтических ростовых факторов.
Похожие статьи в разделе Фармакология. Общая терапия. Токсикология
Короткий адрес: https://sciup.org/170170240
IDS: 170170240
Hematopoietic parameters in acute irradiated mice treated with copolymer of N-vinylpyrrolidone and 2-methyl-5-vinylpyridine
In framework of this work we obtained the experimental data on hematopoiesis and viability of mice after acute irradiation with 7 and 8.5 Gy and measured the morphofunctional readings for peripheral blood cells and bone marrow under this condition. We investigated anti-radiation properties of N-vinylpyrrolidone and 2-methyl-5-vinylpyridine copolymer using the intramuscular injection (dose 500 mg/kg) in two experimental scenarios: 20 minutes before and 20 minutes after irradiation with different intensity. We demonstrated anti-radiation effectiveness of copolymer compound using 280 C57B1/6j line male mice. The average life expectancy was increased by 40% for mice irradiated with absolutely lethal dose (8.5 Gy).Copolymer increases bone marrow cellularity and absolute number of hematopoietic stem cells (7 Gy) in 5-6 time and leads to a significant release of mature and proliferating cells into blood stream. This study shows that the N-vinylpyrrolidone and 2-methyl-5-vinylpyridine copolymer is radiomitigator, which acts via the activation of a number of pro-inflammatory signaling pathways and stimulates the secretion of hematopoietic growth factors.
Текст научной статьи Гемопоэтические показатели при остром облучении мышей, подвергнутых терапии сополимером N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина
Фармакологические средства на основе синтетических ионогенных полимеров представляют большой интерес для фармации и медицины [1-7]. К таким соединениям относятся полимеры на основе мономеров винилпиридинового ряда, обладающие интересными биотропными свойствами, в том числе, иммуномодифицирующей активностью [8-12]. Анализ литературных данных свидетельствует о возможном смягчении эффектов ионизирующего излучения in vivo при воздействии подобных иммуноадъювантных субстанций, в том числе при хроническом внутреннем облучении [13]. Однако проведённые исследования носили достаточно узкий и несистематический характер. В связи с этим целью настоящей работы является выявление возможной противолучевой активности ионогенных синтетических полимеров (сополимеров N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина) при остром облучении in vivо по показателям кроветворной системы мышей.
Материалы и методы
Животные. В экспериментах использовано 280 мышей-самцов линии C57Bl/6j в возрасте 1,5-2,0 месяца с массой тела 18-20 г, содержавшихся в стандартных условиях и на стандартном рационе на основе брикетированных кормов. Мышей распределяли на группы методом рандо-
Панов А.В. – директор по науке, к.х.н.; Кедик С.А. – ген. директор, д.т.н., проф.; Яковлева Т.А. – научн. сотр. ЗАО «Институт фармацевтических технологий». Изместьева О.С. – вед. научн. сотр., к.б.н.; Селиванова Е.И.* – ст. научн. сотр., к.б.н.; Жаворонков Л.П. – зам. директора по научн. работе, д.м.н. МРНЦ им. А.Ф. Цыба – филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России.
-
*Контакты: 249036, Калужская обл., Обнинск, ул. Королева, 4. Тел.: (484) 399-71-88; e-mail: selivanova_l@mail.ru .
мизации. Все работы с животными выполняли в соответствии с требованиями нормативноправовых актов о порядке экспериментальной работы и гуманном отношении к животным [14].
Вводимое вещество. Сополимеры N-винилпирролидона с 2-метил-5-винилпиридином синтезировали радикальной сополимеризацией при постоянном соотношении мономеров в реакционной массе, обеспечиваемом периодическим введением смеси исходных мономеров [12]. Выделенный и очищенный сополимер представляет собой белый порошок, содержащий 35 мольных %, состоящих из звеньев 2-метил-5-винилпиридина, и характеризующийся средневязкостной молекулярной массой 43000 Да.
Условия облучения. Тотальное облучение животных осуществляли в контейнерах из оргстекла γ -лучами 60Со на терапевтической установке «Луч» (Россия), однократно, в дозах 7,0 и 8,5 Гр, при мощности поглощённой дозы 34,75 сГр/мин. Дозиметрические измерения проводили клиническим дозиметром типа 27012 (Veb RFT Messellktronik «Otto Schon», Германия). Доверительный интервал погрешности измерения при вероятности 0,95 не превышает 9%. При каждой дозе радиационного воздействия было сформировано 5 групп (по 10-14 мышей в каждой): интактный контроль, сополимер, облучение, сополимер + облучение (защитный вариант), облучение + сополимер.
Для анализа радиопротекторных свойств сополимер в дозе 500 мг/кг вводили мышам в/м в объёме 0,2 мл за 20 минут до начала облучения, при изучении лечебного эффекта – в той же дозе через 20 минут после окончания лучевого воздействия.
Оценку радиозащитной и терапевтической эффективности препарата осуществляли по критериям 30-суточной выживаемости и средней продолжительности жизни животных всех экспериментальных групп, а также анализировали по комплексу параметров состояние гемопоэза и ферментативного звена антиоксидантной системы.
Анализ количественных и морфологических характеристик зрелых клеток периферической крови лабораторных мышей всех экспериментальных групп проводили на автоматическом гематологическом анализаторе Abacus junior vet, Diatron (Австрия). С этой целью у части мышей на 6-е сутки после облучения производили забор крови из синуса глаза по 0,25 мл в специальные одноразовые пробирки с ЭДТА (Aquisel® Tube). Во всех экспериментальных группах оценивали содержание эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, морфологическую гетерогенность эритроцитов и тромбоцитов, определяли концентрацию гемоглобина, гемато- и тромбокрит, а также активность основных ферментов антиоксидантной системы и содержание гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в крови и костном мозге, выделенном из бедренной кости тотчас после эвтаназии животных путём цервикальной дислокации.
Определение активности супероксиддисмутазы (СОД). Активность СОД в гемолизате крови (разведение 1:300) оценивали спектрофотометрическим методом (спектрофотометр «UNICO 2804», США) при длине волны 420 нм. Метод основан на торможении ферментом аутоокисления кверцетина, вызванного анион-радикалом (О- 2 ) [15]. Полученные результаты выражали в количественном содержании очищенного фермента (пг на 1 эритроцит) [16] и в процентном соотношении к исходному уровню.
Определение активности каталазы. Активность каталазы в гемолизированной крови определяли спектрофотометрически общепринятым методом при длине волны 420 нм. Принцип определения основан на способности перекиси водорода образовывать с молибдатом аммония стойкий окрашенный комплекс [16]. Активность каталазы эритроцитов выражали в коли- честве утилизированной перекиси водорода в пикакаталях (мкмоль за 1 мин) на один эритроцит, пкат/эритроцит. С этой целью гемолизат крови разводили таким образом, чтобы в реакционную смесь попадало 106 эритроцитов.
Определение ГСК . ГСК выявляли в костном мозге и крови мышей по высокой экспрессии CD34 и низкой экспрессии CD45 с помощью проточной цитометрии после инкубации образцов с соответствующими антителами и ДНК-связывающим красителем Хехст 33342 («Sigma», USA). Использовали моноклональные антитела к CD34, меченные фикоэритрином (ФЭ), и CD45, меченные флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ) («eBioscience», США). Анализировали пробы на проточном цитофлуориметре FACS Vantage (BDIS, USA) в течение часа после окрашивания. Использовали двухлазерную систему: флуоресценцию ФИТЦа и ФЭ возбуждали с помощью лазерного пучка с длиной волны 488 нм (Spectra Physics, USA); флуоресценцию Хехста 33342 – с помощью лазера 364 нм (Coherent Enterprise, USA). Для измерения флуоресценции ФИТЦа использовали узкополосные фильтры 530/30 нм, ФЭ – 585/30 нм, Хехста 33342 – 424/20 нм. Мощность первого лазера (488 нм) составляла 56 мВт, мощность второго лазера (364 нм) – 10 мВт. В каждом образце анализировали до 100000 клеток, данные сохраняли в файл и затем обрабатывали с помощью программы CellQuestPro (BDIS, USA). Определяли относительное количество (%) CD45lowСD34+Хехст+ (в дальнейшем – CD45lowСD34+) ГСК. Затем рассчитывали абсолютное количество ГСК (число клеток/л крови или на бедро), исходя из общей концентрации ядросодержащих клеток в каждом образце.
Статистика. Были определены средние арифметические значения показателей, их стандартные ошибки, медианы и квартили. Для оценки значимости межгрупповых различий использованы параметрические критерии (t-критерий Стьюдента, F-критерий Фишера) и непараметрические (Вилкоксона – Манна – Уитни (U), медианный критерий кси-квадрат и ранговый критерий Вардена) [7]. Различия между группами признавали статистически значимыми при значении интеграла вероятности p, не превышающем 0,05.Статистический анализ проводился с помощью программ Origin 6.0 («MicroCal Software», США) и «Statistica 6.0» (StatSoft, Inc.).
Результаты и обсуждение
Как видно из результатов, представленных в табл. 1, через 30 мин после однократного внутримышечного введения сополимера в дозе 500 мг/кг в периферической крови животных наблюдается рост общего количества лейкоцитов, преимущественно за счёт гранулоцитов. Через 6 суток на фоне сохранившегося лейкоцитоза у мышей этой группы регистрируется снижение количества гранулоцитов и повышение количества лимфоцитов. В состоянии ферментативного звена антиоксидантной системы через 30 мин после однократного введения препарата в указанной дозе отмечается незначительный рост активности супероксиддисмутазы и каталазы (рис. 1). Реакцию подобного типа можно расценить как отклик на манипуляцию, связанную с проведением эксперимента. Однако через 6 суток после инъекции в антиоксидантной системе регистрируется отчётливый сдвиг функционирования основных ферментов, выразившийся в диссоциации их активности: повышении активности супероксиддисмутазы и снижении активности каталазы .
При изолированном воздействии γ-лучами в дозе 8,5 Гр у облучённых животных на 6 сутки регистрируется глубокая лейко- и тромбоцитопения, а в эритроидном ростке кроветворения отмечаются признаки развития гипохромной анемии (табл. 1). На этом фоне отмечается выра- женное опустошение костного мозга, регистрируемое по снижению клеточности костного мозга. Радиационное воздействие в поглощённой дозе 8,5 Гр вызывает 100% гибель облучённого контроля (табл. 2) в течение первых 10 дней после облучения. В состоянии антиоксидантной системы у этих животных регистрируется нарушение в функционировании основных ферментов, проявившееся в диссоциации их активности: выраженное повышение активности супероксид-дисмутазы и снижение активности каталазы. Выявленные отклонения в функционировании ферментов являются более глубокими, чем при изолированном воздействии сополимера. При всех использованных схемах применения испытуемого соединения у животных, облучённых в дозе 8,5 Гр, в пострадиационном периоде на 6 сутки не наблюдается отчётливого восстановления показателей гемопоэза и антиоксидантной системы. С учётом известных радиобиологических закономерностей лучевого поражения и временных параметров восстановления полученные данные вполне ожидаемы. Тем не менее, можно лишь говорить о тенденции к проявлению радиотерапевтического действия при использовании схемы: облучение + сополимер. В этой группе животных на 11-е сутки после острого воздействия у-лучами регистрируется 52,8% выживаемость (при 100% гибели в группе «облучение»), и на 6-е сутки после лучевого воздействия отмечается незначительный рост количества лейкоцитов, снижение степени анемии и тенденция к восстановлению функционирования индикативных ферментов антиоксидантной защиты. Средняя продолжительность жизни погибших животных в этой группе оказалась значимо выше по сравнению с облучённым контролем и группой сополимер + облучение. Этот более длительный период выживания на фоне резкой панцитопении в крови и костном мозге был отмечен и ранее у полимерных препаратов подобного строения [5]. Возможно, имеет значение их иммуномодулирующая активность. Изолированное радиационное воздействие в дозе 7,0 Гр, при которой погибает около 20% животных, вызывает меньшие нарушения в состоянии гемопоэза и антиоксидантной системы, чем доза 8,5 Гр (табл. 3, рис. 2).
Таблица 1
Основные показатели (M ± m) периферической крови и клеточности костного мозга мышей-самцов линии C57Bl/6j при оценке противолучевых свойств сополимера (500 мг/кг )
|
Показатели |
Группы |
|||||
|
Интактный контроль |
Сополимер |
6-е сутки после облучения в дозе 8,5 Гр |
||||
|
Через 30 мин |
Через 6 суток |
Облучение |
Облучение + сополимер |
Сополимер +облучение |
||
|
Лейкоциты, х109/л |
6,61±0,95 |
10,7±1,9* p<0,047 |
10,3±1,5* p<0,042 |
0,16±0,02* p<0,00005 |
0,87±0,34*v p<0,00004 |
0,41 ±0,15* p<0,00004 |
|
Лимфоциты, х10 9 /л |
4,63±0,72 |
5,8±0,89 |
6,90±0,76* p<0,04 |
0,08±0,01* p<0,00005 |
0,43±0,12*v p<0,0001 |
0,20±0,09* p<0,0001 |
|
Гранулоциты, х109/л |
1,77±0,28 |
4,26±1,02* p<0,007 |
3,0±0,7 p<0,11 |
0,08±0,01* p<0,00005 |
0,44±0,11* p<0,0001 |
0,22±0,10* p<0,0001 |
|
Эритроциты, х1012/л |
9,8±0,5 |
9,5±0,6 |
9,7±0,1 |
7,3±0,7 |
8,7±0,2 |
8,0±0,9 |
|
Гемоглобин, г/л |
143±4 |
146±9 |
150±2 |
111±12* p<0,02 |
133±3 p<0,08 |
116±14* p<0,05 |
|
Тромбоциты, х10 9 /л |
309±67 |
429±23 |
452±75 |
54±8* p<0,003 |
72±15* p<0,006 |
59±8* p<0,004 |
|
Тромбокрит, % |
0,18±0,04 |
0,24±0,01 |
0,23±0,04 |
0,031 ±0,005* p<0,003 |
0,046±0,007* p<0,007 |
0,033±0,007* p<0,006 |
|
Клеточность костного мозга, х106/бедро |
18,5±1,2 |
19,2±1,3 |
18,8±1,4 |
0,78±0,34* р<0,0001 |
0,29±0,05* р<0,0001 |
0,29±0,04* p<0,0001 |
Список литературы Гемопоэтические показатели при остром облучении мышей, подвергнутых терапии сополимером N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина
- Платэ Н.А., Васильев А.Е. Физиологически активные полимеры. М.: Химия, 1986. 296 с.
- Сидельковская Ф.П. Химия N-винилпирролидона и его полимеров. М.: Наука, 1970. 150 с.
- Штильман М.И. Полимеры медико-биологического назначения. М.: ИКЦ Академкнига, 2006. 400 с.
- Алексеев К.В., Грицкова И.А., Кедик С.А. Полимеры для фармацевтической технологии. М.: ЗАО ИФТ, 2011. 512 с.
- Жаворонков Л.П. Влияние на систему крови и радиозащитная эффективность синтетических ионогенных полимеров: дис.. канд. мед. наук. М., 1979. 105 с.
- Калистратов В.Г., Кедик С.А., Свергун В.И. Противолучевые и другие биологические свойства сополимера 2-метил-5-винилпиридина и N-винилпирролидона//Медицинская радиология. 1993. Т. 38, № 10. С. 21-25.
- Жаворонков Л.П. Основы прикладной медико-биологической статистики. Обнинск: ФГБУ МРНЦ Минздравсоцразвития России, 2012. 60 с.
- Кедик С.А., Панов А.В., Зайцев М.А., Черта Ю.В. Сополимеры 2-метил-5-винилпиридина и N-винилпирролидона, обладающие свойствами активаторов фагоцитоза: пат. РФ № 2430933 от 10.10.2011.
- Кедик С.А., Свергун В.И., Черта Ю.В., Ярцев Е.И., Панов А.В. Сополимеры на основе N-винилпирролидона: пат. РФ № 2415876 от 10.04.2011.
- Кедик С.А., Ворожцова С.В., Ярцев Е.И., Сакаева И.В., Кочкина (Черта) Ю.В., Панов А.В. Влияние совидона на цитогенетические изменения в клетках эпителия роговицы, повреждённых радиационным воздействием//Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2012. № 8. С. 32-35.
- Кедик С.А., Панов А.В., Сакаева И.В., Кочкина (Черта) Ю.В., Еремин Д.В., Суслов В.В. Синтез и радиопротекторная активность сополимеров N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилтетразола//Химико-фармацевтический журнал. 2012. Т. 46, № 12. С. 30-33.
- Кедик С.А., Панов А.В., Сакаева И.В., Кочкина (Черта) Ю.В., Еремин Д.В., Суслов В.В. Синтез и молекулярно-массовые характеристики сополимеров N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина//Химико-фармацевтический журнал. 2012. Т. 46, № 8. С. 110-113.
- Калистратова В.С., Иванов А.А., Нисимов П.Г. К проблеме профилактики при помощи иммуномодуляторов отдалённых последствий, вызванных внутренним облучением//Радиационная биология. Радиоэкология. 2001. Т. 41, № 1. С. 104-112.
- Западнюк И.А., Западнюк В.И., Захария Е.А., Западнюк Б.В. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте. Киев: Вища школа, 1983. 383 с.
- Костюк В.А., Потапович А.И., Ковалева Ж.В. Простой и чувствительный метод определения активности супероксиддисмутазы, основанный на реакции окисления кверцетина//Вопросы медицинской химии. 1990. Т. 36., № 2. С. 88-91.
- Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Токарев В.Е. Метод определения активности каталазы//Лабораторное дело. 1988. № 1. С. 16-19.
- Semina O.V., Semenets T.N., Zamulaeva I.A., Selivanova E.I., Iljina T.P., Maliutina Y.V., Deigin V.I., Saenko A.S. Dipeptide thymodepressin inhibits migration of CD34+ cells from the bone marrow into peripheral blood during tumor growth//Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2008. V. 146, N 1. P. 96-99.
- Кедик С.А., Федоров Е.К., Свергун В.И., Гаврилов В.А., Зубаиров М.М. Сополимеры 2-метил-5-винилпиридина и N-винилпирролидона, обладающие иммуностимулирующим действием: авт. cвид. РФ № 2000004 от 15.02.1993.
- Васин М.В. Классификация противолучевых средств как отражение современного состояния и перспективы развития радиационной фармакологии//Радиационная биология. Радиоэкология. 2013. Т. 53. № 5. С. 459-467.
- Shannon M.F., Coles L.S., Vadas M.A., Cockerill P.N. Signals for activation of the GM-CSF promoter and enhancer in T cell//Critical Review of Immunology. 1997. V. 17. P. 301-323.
- Богомазов С.Д. Антикомплементарные свойства полиэлектролитов и их защитная эффективность при радиационном поражении иммунитета: дис. … канд. мед. наук. М., 1978. 198 с.
