Генетическая структура естественных популяций стерляди (Acipenser ruthenus L.) в бассейнах рек Кама и Обь на основании полиморфизма ISSR маркеров

Изучение полиморфизма молекулярно-генетических маркеров — обязательный этап разработки программ по сохранению генетических ресурсов осетровых рыб. Анализ генофондов с использованием молекулярногенетических маркеров свидетельствует о выраженных особенностях генетической структуры и необходимости дальнейшей разработки генетически обоснованных методов сохранения биоразнообразия редких видов рыб (1).

Один из методов для изучения генетического разнообразия популяций растений и животных — межмикросателлитный анализ полиморфизма ДНК (inter simple sequence repeats, ISSR). Он обладает хорошей воспроизводимостью и с успехом применяется в мировой (2, 3) и отечественной прак-348

тике (4). ISSR-метод может быть использован для выявления межвидовой и внутривидовой генетической изменчивости, идентификации видов, популяций, линий, а в ряде случаев — для индивидуального генотипирования (5). Установлено, что ISSR маркеры имеют выраженные породо- и видоспецифические особенности (6). В работах Ю.А. Столповского с соавт. (7-9), L.V. Nesteruk с соавт. (10), P.P. Srivastava с соавт. (11) ISSR-метод применялся для генотипирования популяций и пород животных, в том числе идентификации популяций тутового шелкопряда (12). В связи с этим перспективно проанализировать использование полилокусного маркирования для молекулярно-генетической идентификации популяций и стад стерляди.

Осетроводство в России с каждым годом приобретает все больший масштаб как одна из важнейших отраслей сельского хозяйства. Искусственное воспроизводство позволяет компенсировать ущербы водным биоресурсам и проводить мероприятия по реинтродукции осетровых (13). Стерлядь ( Acipenser ruthenus L.) — один из наиболее широко распространенных представителей осетровых в России с длительной эволюционной историей (14). Отдельные популяции этого вида включены в Красную книгу Российской Федерации (15), Пермского края (16) и Кировской области (17). Коммерческая ценность осетровых стимулирует интенсивный вылов этих рыб. Строительство гидротехнических сооружений и расположение промышленных зон вблизи водных объектов привело к резкому снижению численности естественных популяций стерляди (18). Для ее восполнения и компенсации ущерба, нанесенного хозяйственной деятельностью человека, в естественную среду выпускают особей, выращенных в рыбоводных хозяйствах. На сегодняшний день нет сведений об эффективности подобных мероприятий, поскольку отсутствует одна из важнейших составляющих природоохранных реакклиматизационных мероприятий — данные о восполнении популяций. Для учета возврата в популяции особей, выращенных в рыбоводных хозяйствах, необходимы исследования, включающие идентификацию молоди из хозяйств, а также особей, принадлежащих к природной популяции в исследуемом водоеме (19). Ввиду необходимости охраны промысловых и исчезающих рыб особенно важны исследования популяций, претерпевающих антропогенные нагрузки (20). Изучение генетической структуры популяций стерляди в бассейнах рек Камы и Оби с использованием межмикросател-литного анализа полиморфизма ДНК ранее не проводилось.

Нами с помощью межмикросателлитного анализа полиморфизма ДНК впервые получены данные о структуре популяции стерляди из рек Кама, Обь и Вятка. Выявлены редкие ISSR маркеры и предложены два подхода к идентификации популяций стерляди — по уникальным маркерам и сочетанию полиморфных маркеров.

Цель работы — изучение генетического разнообразия естественных популяций стерляди на основании полиморфизма ISSR маркеров.

Методика. Объектом исследований были естественные популяции стерляди ( Acipenser ruthenus L.) в возрасте 3-4 лет. Отбор проб провели в 2015-2016 годах у 195 особей, выловленных в пяти точках: Vi — река Вятка около н.п. Вишкиль (среднее течение), Sh — река Вятка около н.п. Шурма (нижнее течение, 236 км от выборки Vi по течению реки), Vp — река Вятка в районе г. Вятские поляны Кировской области (нижнее течение, 138 км от выборки Sh по течению реки), Km — река Кама ниже плотины Воткинской ГЭС, CHM — река Обь в районе слияния рек Иртыш и Обь.

Фрагменты плавников собирали прижизненно, затем особей возвращали в водоем. Плавники фиксировали в 96 % спирте. Выделение тотальной ДНК из навески массой 100 мг осуществляли по методике S.O. Rogers

• (21) . Качество и концентрацию ДНК определяли на спектрофотометре NanoDrop 2000 («Thermo Fisher Scientific», США) и доводили до 10 нг/мкл.

Межмикросателлитный анализ полиморфизма ДНК проводили согласно описанию (5). ПЦР (polymerase chain reaction, PCR) проводили в реакционной смеси объемом 25 мкл, содержащей 2 ед. Tag ДНК-полимеразы, 2,5 мкл стандартного 10½ буфера для ПЦР, 25 пМ праймера, 2,5 мМ Mg²⁺, 0,25 мM dNTPs, 5 мкл тотальной ДНК. Пробы ДНК рыб были проанализированы с пятью эффективными для стерляди ISSR-праймерами, подобранными ранее (22). ПЦР осуществляли в амплификаторе GeneAmp Biosystem («Applied Biosystems», США) в обычном для ISSR-метода режиме: предварительная денатурация 2 мин при 94 ° C; денатурация 20 с при 94 ° С, отжиг праймера 10 с при 56 ° C, элонгация 10 с при 72 ° C (5 циклов); денатурация 5 с при 94 ° С, отжиг праймера 5 с при 56 ° C, элонгация 5 с при 72 ° C (30 циклов); заключительная элонгация 2 мин при 72 ° C. Температура отжига в зависимости от G/С-состава праймеров варьировала от 56 до 64 ° С. В качестве отрицательного (К ^- ) контроля в реакционную смесь для проверки чистоты реактивов вместо ДНК добавляли 5 мкл деионизированной воды. Для доказательства воспроизводимости результатов ПЦР-анализ повторяли трижды. Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 1,7 % агарозном геле с 1½ ТВЕ буфером. Для определения длины фрагментов ДНК использовали маркер молекулярной массы (100 bp + 1,5 + 3 Кb DNA Ladder, «ООО-СибЭнзим-М», Москва). Длину фрагментов определяли с использованием программы Quantity One в системе гель-документации Gel-Doc XR («Bio-Rad», США).

Компьютерный анализ полученных данных проводили в программе POPGENE 1.31 (23) и с помощью специализированного макроса GenAlEx6 (24) для Microsoft Excel с определением доли полиморфных локусов (P95), а также ожидаемой (He) гетерозиготности, среднего числа аллелей (Na) и эффективного числа аллелей (Ne) на локус, числа редких аллелей (R).

Для описания генетической структуры популяции использовали следующие параметры (25, 26): ожидаемая доля гетерозиготных генотипов (HT) во всей популяции как мера общего генного разнообразия; ожидаемая доля гетерозиготных генотипов (HS) в субпопуляции как мера внутри-популяционного разнообразия; доля межпопуляционного генетического разнообразия в общем разнообразии, или показатель подразделенности популяций (GST). Баейсовский метод анализа популяционной структуры выполняли с использованием пакета STRUCTURE 2.3.4. Оценку надежности возможных кластерных групп и их визуализацию осуществляли в программе STRUCTURE HARVESTER (27). Структуру популяции рассчитывали посредством размещения исследуемых особей в наиболее вероятное число кластеров согласно алгоритму, предложенному G. Evanno с соавт. (28). Вероятность числа кластеров определяли в диапазоне от 1 до 10.

Результаты. В пяти выборках из естественных популяций стерляди обнаружили и проанализировали 128 ISSR-PCR маркеров, из которых 120 оказались полиморфными (P₉₅ = 0,938). Число амплифицированных ISSR-PCR маркеров варьировало в зависимости от праймера от 7 (праймер CR-212) до 23 (праймер Х9). Наибольшую долю полиморфных локусов выявили в выборке Vp (P₉₅ = 0,876), наименьшую — в CHM (P₉₅ = 0,634). Ожидаемая гетерозиготность (H_e) для общей выборки оказалась невысока и составила 0,173 (табл. 1). В выборке Vp ожидаемая гетерозиготность оказалась наибольшей (H_e = 0,232), в CHM — наименьшей (H_e = 0,100). Можно предположить, что высокая ожидаемая гетерозиготности в попу-350

ляции Vp связаны с систематическими выпусками молоди из ближайших рыбоводных хозяйств, в основу маточных стад которых вошли особи естественных популяций реки Вятка. Для успешной идентификации принадлежности стерляди к конкретной популяции или установления ее географического происхождения важно наличие уникальных ISSR-PCR маркеров (R), которые присутствуют только в одной из популяций. В общей выборке естественных популяций было выявлено 23 уникальных ISSR-PCR маркера, причем 10 обнаружили в выборке Vp, что свидетельствует о возможности успешной идентификации стерляди этой популяции.

• 1.    Генетическое разнообразие изученных выборок из естественных популяций стерляди ( Acipenser ruthenus L.) (2015-2016 годы)

• 2.    Характеристика генетической структуры и дифференциации изученных популяций стерляди ( Acipenser ruthenus L.) из рек Кама, Обь и Вятка (2015-2016 годы)

Популяция	Р 95	H e	Na	Ne	R
Vp	0,876	0,232 (0,018)	1,625 (0,486)	1,402 (0,381)	10
Km	0,768	0,162 (0,018)	1,476 (0,501)	1,282 (0,374)	5
CHM	0,634	0,100 (0,016)	1,258 (0,439)	1,175 (0,328)	3
Vi	0,835	0,198 (0,017)	1,625 (0,486)	1,325 (0,344)	5
Sh	0,805	0,174 (0,017)	1,523 (0,501)	1,295 (0,364)	0
Всего	0,938	0,173 (0,110)	2,000 (0,000)	1,468 (0,340)	23

П р и м е ч а н и е. P₉₅ — доля полиморфных локусов, H_e — ожидаемая гетерозиготность, Na — абсолютное число аллелей на локус, Ne — эффективное число аллелей на локус, R — число уникальных ISSR-PCR маркеров. Показатели статистически значимы при P ≤ 0,05; в скобках даны стандартные отклонения (SD). Описание популяций см. в разделе «Методика».

Анализ генетической структуры и дифференциации изученных популяций стерляди показал (табл. 2), что ожидаемая доля гетерозиготных генотипов (HT) на общую выборку составила 0,283. Ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в отдельной популяции (HS) была равна 0,173. Следовательно, в среднем в каждой популяции присутствовало 17 % гетерозигот. Показатель подразделенности популяций (GST) составил 0,386, то есть на межпопуляционную компоненту генетического разнообразия стерляди приходилось 38,6 % разнообразия, на внутрипопуляционную — 61,4 %. Изученные выборки стерляди были сильно дифференцированы.

ISSR-праймер Нуклеотидная последовательность (5´ → 3´)		H T	H S	G ST
CR-212	(CT) 8 TG	0,302 (0,028)	0,225 (0,017)	0,252
CR-215	(CA) 6 GT	0,314 (0,033)	0,159 (0,085)	0,492
ISSR-9	(ACG) 7 G	0,220 (0,022)	0,159 (0,012)	0,277
Х9	(ACC) 6 G	0,277 (0,022)	0,155 (0,008)	0,442
X11	(AGC) 6 G	0,312 (0,022)	0,182 (0,009)	0,417
На общую выборку		0,283 (0,026)	0,173 (0,011)	0,386

П р и м е ч а н и е. H_T — ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в общей выборке, H_S — ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в отдельной популяции, G_ST — доля межпопуляционного генетического разнообразия в общем разнообразии, или показатель подразделенности популяций. Показатели статистически значимы при P ≤ 0,05; в скобках даны стандартные отклонения (SD).

Структура распределения генотипов стерляди ( Acipenser ruthenus L.) из рек Кама, Обь и Вятка (при К = 5) (20152016 годы) . Программа STRUCTURE. Описание популяций см. в разделе «Методика».

Исследованная выборка

Было выявлено пять генетически обособленных групп. Для каждой из 195 исследованных особей в выборке определили вероятность ее принадлежности к какому-либо из предложенных кластеров (рис.).

Выявленные нами ISSR-PCR маркеры стабильны и воспроизводи- лись при повторных ПЦР. Нами предложены два подхода к идентификации популяций стерляди — по уникальным маркерам и на основании сочетания полиморфных маркеров. Первый подход иллюстрирует пример выборки Vi с уникальным ISSR-PCR маркером Acun780Х9 (длина 780 п.н.), который ам-плифицировался с праймером (АСС)6G (обозначен Х9) и присутствовал только в Vi с частотой 0,660. На принадлежность к популяции Km указывало наличие одновременно двух полиморфных маркеров — Acp640CR-212 (длина 640 п.н., частота 0,706), амплифицированного с праймера (CT)8TG, и Acp520Х9 (520 п.н., частота 0,735), выявляемого с праймером (АСС)6G.

Ранее ISSR-PCR маркеры были использованы (29) для контроля генетической структуры сельскохозяйственных видов млекопитающих и выявления породоспецифических особенностей их генофондов. Микроса-теллитные локусы (simple sequence repeats, SSR) применяли для установления видовой принадлежности осетровых и выявления особей гибридного происхождения рыб (30). В представленной работе мы показали, что межмикросателлитный анализ ДНК (ISSR-PCR маркеры) эффективен при изучении генетической структуры и молекулярно-генетической идентификации популяций стерляди, что необходимо для формирования ремонтноматочных стад, в которых происходит искусственное воспроизводство стерляди c дальнейшим выпуском молоди в популяцию с идентичным генофондом. Для таких стад рекомендуется популяция A. ruthenus из реки Вятки Vp с высоким генетическим разнообразием. При идентификации принадлежности стерляди к конкретной популяции или установления ее географического происхождения на основании выявленных молекулярных маркеров, включая редкие ISSR-PCR маркеры, следует составлять молекулярногенетические формулы, штрихкоды и генетические паспорта.

Таким образом, в изученных популяциях Acipenser ruthenus в бассейнах рек Кама и Обь выявлено 128 ISSR-PCR маркеров. Установлена высокая доля (0,938) полиморфных локусов в общей выборке. Выборка из реки Вятка в районе г. Вятские имела наибольшие показатели генетического разнообразия (P₉₅ = 0,876; Н_е = 0,232; Ne = 1,402; R = 10) относительно выборок, взятых из той же реки ближе к ее истоку. Выборку из реки Обь можно охарактеризовать как популяцию с низким генетическим разнообразием (P₉₅ = 0,634; Н_е = 0,100; Ne = 1,175; R = 3). Ожидаемая доля гетерозиготных генотипов (H_T) на общую выборку составила 0,283, в отдельной популяции этот показатель (H_S) был значительно ниже — 0,173. Следовательно, на межпопуляционную компоненту генетического разнообразия стерляди приходилось 38,6 %, на внутрипопуляци-онную — 61,4 %. Изученные популяции оказались сильно дифференцированы. В каждой выборке A. ruthenus определены уникальные молекулярные маркеры, а также сочетания полиморфных маркеров, которые могут быть использованы для молекулярно-генетической идентификации изученных популяций стерляди.