Генетическая структура региональных популяций Mycosphaerella graminicola (Septoria tritici) - возбудителя септориоза пшеницы (Triticum aestivum L.)

Возбудитель септориозной листовой пятнистости (STB) Mycosphaerel-la graminicola (анаморфа Septoria tritici ) — доминирующий вид в септориоз-ном комплексе на посевах пшеницы в основных зернопроизводящих районах России (Северо-Кавказский, Центрально-Черноземный). Кроме того, он широко распространен в центральной части страны и на юге Поволжья, где его доля в видовой структуре популяций достигает 40-50 %. Отмечается присутствие этого вида в Северо-Западном районе, в Калининградской области, а также на территории Западной и Восточной Сибири.

Знание генетической структуры популяций патогена, частоты встречаемости генов вирулентности, их динамики во времени и пространстве, а также степени эффективности генов устойчивости относят к обязательным

^∗ Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Международного научно-технического центра (МНТЦ).

условиям успешной селекции на устойчивость к заболеванию. Если сравнивать с другими болезням (ржавчина, мучнистая роса и др.), то в случае септориоза генетика устойчивости растений менее изучена. К тому же в патосистеме «пшеница― M. graminicola » присутствуют два типа взаимодействия, то есть устойчивость может быть как количественной (горизонтальной), так и изолят-специфичной (вертикальной), причем оба эти взаимодействия важны для патосистемы.

Специфичность взаимодействия между M. graminicola и пшеницей впервые доказали Z. Eyal с соавт. (1, 2), которые, проанализировав многие индивидуальные комбинации «сорт ½ изолят», предположили наличие 28 комплементарных генов. Существование взаимодействующих пар генов было подтверждено результатами других исследователей с использованием 80 изолятов и 47 сортов (3). Заключительное свидетельство связи «ген-на-ген» было получено с помощью молекулярно-генетических исследований хозяина и патогена, что устранило любые сомнения в ее существовании в отношении по крайней мере некоторых известных генов устойчивости (4-7).

За недавние годы на основании взаимодействия между сортами пшеницы и изолятами гриба идентифицировано 17 основных генов устойчивости к M. graminicola ( Stb1 - Stb17 ). Эксперименты, проведенные в разных лабораториях мира, позволили определить хромосомную локализацию и молекулярные маркеры этих генов, которые предлагается использовать в маркерной селекции (8-14).

Согласно теории «ген-на-ген», наличие генов устойчивости у хозяина предполагает существование специфических генов вирулентности у патогена, частота встречаемости которых в регионе может быть вычислена как доля изолятов, выражающих эти гены (вирулентности), от числа изо-лятов, используемых в исследовании (2). Это позволяет, в свою очередь, определить степень эффективности Stb -генов, что имеет большое значение для селекции, так как внедрение определенного Stb -гена не обусловит эффективную устойчивость, если часть популяции патогена вирулентна для несущего такой ген сорта. В частности, исследования, проведенные во Франции, показали, что при тестировании 11 сортов с известными генами устойчивости с использованием монопикнидиальных изолятов из пяти областей страны многие из Stb -генов были неэффективными в отношении большинства французских штаммов M. graminicola (15). Тем не менее, эффективность некоторых генов подтверждена мировой практикой. Так, ген Stb1 , введенный в озимые сорта пшеницы Oasis и Sullivan, более чем 25 лет сохранял свою эффективность в Индиане и соседних штатах (8). Сорт яровой пшеницы Tadinia обладает одним доминантным геном устойчивости Stb4 , который в течение 30 лет использовался для контроля S. tritici в Калифорнии (9). Ген Stb6 ― широко распространенный источник устойчивости к STB во всем мире (16). Об эффективности Stb -генов по отношению к российским популяциям патогена известно мало. Есть только данные Ю.В. Зеленевой (17), проводившей исследования на изолированных листьях пшеницы, согласно которым наибольшей эффективностью против изо-лятов M. graminicola из Центрально-Черноземного района обладали гены Stb1 , Stb4 , Stb5 , тогда как гены Stb2 , Stb3 были менее эффективными.

Пока что нет согласованной методологии оценки и определения границы разделения устойчивости и восприимчивости. Известно, что иммунитета (полной устойчивости) к M. graminicola не существует, так как некрозы и (или) пикниды присутствуют всегда (18, 19). Генетическая устойчивость к STB может выражаться в уменьшении размера зоны поражений и в снижении плодовитости гриба. Эти два параметра находятся под разным генетическим контролем и оба важны при оценке заболевания (3). Плодовитость гриба чаще всего принято оценивать по числу пикнид. В этом случае реакция растений группируется в классы от близкой к иммунной с небольшими некрозами без пикнид до очень восприимчивой с большими сливающимися пятнами и многочисленными пикнидами (5, 2022). Однако визуальная оценка числа пикнид, особенно по балльной шкале, довольно субъективна. Кроме того, было установлено, что на восприимчивых сортах число спор в одной пикниде в 2,0-2,5 раза больше, чем на устойчивых (23). В связи с этим некоторые исследователи рекомендуют определять спорулирующую способность гриба in vivo методом подсчета спор в камере Горяева (24).

Целью наших исследований было, допуская связь «ген-на-ген», определить гены вирулентности и частоту их встречаемости в популяциях Mycosphaerella graminicola из разных регионов России, используя набор сортов с известными генами устойчивости. Эта информация позволит выявить эффективность Stb -генов, оценить их функциональность на территории России и целесообразность использования в селекционных программах в качестве потенциальных источников устойчивости к STB.

Методика. Исследования проводили в течение 2009-2015 годов. Образцы пораженных растений собирали во время обследования посевов пшеницы в течение вегетационного периода по стандартной методике (25). При выделении в чистую культуру моноспоровых изолятов Myco-sphaerella graminicola применяли метод штрихов (26). Для этого кусочки пораженной ткани с пикнидами гриба сначала промывали под проточной водой, затем в нескольких порциях стерильной дистиллированной воды и помещали в стерильную чашку Петри на предметное стекло в каплю стерильной воды. Через несколько минут полученную споровую суспензию с помощью проволочной петли высевали на поверхность питательной среды в чашки Петри. В качестве питательной среды использовали картофельноглюкозный агар (КГА). Через 7-8 сут инкубации при температуре 20-25 ° С единичные колонии, произошедшие из одной конидии, отсевали в другие чашки. Стабильность изолятов отслеживали при трех последовательных пересевах 10-суточных колоний на свежую питательную среду. Культурально-морфологические (КМ) признаки изолятов оценивали на 30-е сут после посева, отмечая характер строения, диаметр и окраску колоний. Для исследований отбирали стабильные по КМ признакам изоляты из разных морфологических групп, стараясь как можно полнее отразить внутривидовое разнообразие популяций.

В опытах использовали моногенные сорта пшеницы с известными генами устойчивости — Bulgaria 88 и Oasis ( Stb1 ), Veranopolis ( Stb2 ), Israel 493 ( Stb3 ), Tadinia ( Stb4 ), CS/Synthetic 7D ( Stb5 ), Flame ( Stb6 ), Estanzuela Federal ( Stb7 ) и W7984 ( Stb8 ). Исследования проводили в камерах искусственного климата и в теплице. Растения выращивали в вазонах объемом 400 см³ (по 10 шт. на вазон) до фазы полностью развернутого 2-го листа. Инокулюм гриба культивировали на КГА в чашках Петри в течение 4-5 сут в лабораторных условиях без дополнительного освещения. Растения заражали индивидуальными изолятами, опрыскивая споровой суспензией гриба с помощью пульверизатора. Плотность суспензии ― 1½10⁷ спор/мл, расход суспензии ― 100 мл/м². Перед нанесением в суспензию добавляли каплю поверхностно-активного вещества Твин 20. После инокуляции растения на 48 ч помещали во влажную камеру при температуре 20-25 ° С, затем переносили в ростовую камеру или бокс, где поддерживались следующие условия: температура 18-20 ° С (ночь) и 22-24 ° С 724

(день), относительная влажность воздуха 70-80 %, фотопериод 16 ч, освещенность ― около 15 тыс. лк.

Оценку пораженности растений проводили через 20 сут после инокуляции. За основу был взят разработанный во Всероссийском НИИ фитопатологии метод, согласно которому в качестве основных параметров использовали степень поражения растений и интенсивность споруляции гриба in vivo (24, 27). Степень поражения определяли визуально по проценту пораженной поверхности 1-го и 2-го листа. Для определения споруляции срезали учетные листья растений и помещали их на 3-4 ч в лабораторные стаканы с точно измеренным количеством воды. Затем с помощью камеры Горяева определяли число спор в суспензии в пересчете на один учетный лист: N = 2500 MV/n, где N — число спор на одном учетном листе; M — число спор в 100 больших квадратах камеры Горяева; V — объем воды в сосуде, мл; n — число листьев в пробе; 2500 — коэффициент, полученный экспериментально.

Степень поражения дифференцировали как низкую (поражено в среднем до 20 % площади листа), среднюю (21-50 %) или высокую (более 50 %). По интенсивности споруляции изоляты относили к слабоспорулиру-ющим (до 100 тыс. спор/лист), среднеспорулирующим (от 100 до 200 тыс. спор/лист) или высокоспорулирующим (более 200 тыс. спор/лист). На основании сочетания двух этих параметров изоляты делили на три группы: I — слабовирулентные, II — средневирулентные, III — высоковирулентные.

По проценту вирулентных изолятов от общего числа исследованных определяли частоту и спектр генов вирулентности в популяции, а также оценивали эффективность Stb -генов. Stb -гены условно разделяли на эффективные (сорт восприимчив к 0-20 % изолятов), среднеэффективные (сорт восприимчив к 21-50 % изолятов) и неэффективные (сорт восприимчив более чем к 50 % изолятов).

Результаты. Группам вирулентности у изученных изолятов соответствовали следующие сочетания интенсивности споруляции гриба и степени поражения растений (табл. 1). Изоляты I группы рассматривались как авирулентные, тогда как II или III группа вирулентности свидетельствовали о наличии у изолята гена вирулентности.

1. Распределение изученных изолятов Mycosphaerella graminicola по группам вирулентности с учетом споруляции и развития поражения у растений пшеницы ( Triticum aestivum L.) в лабораторных тестах

Средняя степень поражения растений, %	Интенсивность споруляции, тыс. спор/лист
	низкая (до 100)	средняя (100-200)	высокая (более 200)
Низкая (до 20)	I	I	II
Средняя (21-50)	I	II	III
Высокая (51-100)	II	III	III

При исследовании генетической структуры популяций M. gramini-cola протестировали 47 изолятов из Северо-Кавказского района (14 — из Северной Осетии, 19 — из Ставропольского края, 13 — из Краснодарского края, 1 — из Чечни); 66 изолятов из Центрально-Черноземного района (26 — из Воронежской, 10 — из Тамбовской, 10 — из Липецкой, 12 — из Курской, 8 — из Белгородской области); 29 изолятов из Поволжья (9 — из Саратовской и 20 — из Волгоградской области); 64 изолята из Центрального района (59 — из Московской, 3 — из Тульской, 1 — из Брянской и 1 — из Рязанской областей); 34 изолята из Северо-Западного района (6 — из Ленинградской, 9 — из Псковской, 19 — из Новгородской областей). Все изоляты тестировали на восьми сортах с моногенной устойчивостью, за исключением представителей северо-кавказской популяции, которые мы испытывали на шести сортах, поскольку на тот период не располагали сортами с генами Stb6 и Stb8.

Во всех популяциях M. graminicola была выявлена вирулентность в отношении генов устойчивости Stb1 , Stb2 , Stb3 , Stb4 , Stb5 и Stb7 , значительно варьирующая по частоте (рис.).

Частота проявления вирулентности в отношении Stb -генов устойчивости пшеницы ( Triticum aestivum L.) в популяциях Mycosphaerella grami-nicola из разных районов России : А — СевероКавказский, Б — Центрально-Черноземный, В — Поволжский, Г — Центральный, Д — Северо-Западный (лабораторные тесты, образцы сборов 2009-2015 годов).

Северо-кавказская популяция была представлена различными генотипами вирулентности, то есть изоляты несли разные комбинации соответствующих генов. При этом 55,3 % изолятов проявляли широкий спектр вирулентности (поражали 3-6 моногенных сортов), 25,5 % изолятов имели по 1-2 гена вирулентности. Изоляты, не обладающие генами вирулентности, составляли 19,2 %. Чаще других поражались сорта c генами устойчивости Stb1 , Stb5 и Stb7 : доля вирулентных для них изолятов составляла 57,4-63,8 %. Сорта с генами Stb2 , Stb3 и Stb4 поражались реже и были восприимчивы к 17,0-36,2 % изолятов.

В центрально-черноземной популяции у 50 % изолятов выявили только по 1-2 гена вирулентности. Доля изолятов с более широким спектром вирулентности составляла 43,9 %. Не имели генов вирулентности 6,0 % изолятов. Чаще других поражались сорта c генами устойчивости Stb1 , Stb5 и Stb7 (47,0-77,3 % вирулентных изолятов). Сорта с генами Stb2 , Stb3 и Stb4 были устойчивы против большинства изолятов (частота вирулентности 7,6-15,1 %). Вирулентность в отношении генов устойчивости Stb6 и Stb8 отсутствовала.

Изоляты из поволжской популяции M. graminicola имели наиболее разнообразные сочетания генов вирулентности. При этом только один изолят (3,4 %) был авирулентным для всех сортов, а 13,8 % изолятов имели по одному гену вирулентности. Большинство изолятов несли по 3-6 генов вирулентности (65,5 %), подавляющее большинство (93,1 %) были вирулентны для сорта с геном Stb7 . Частота вирулентности в отношении сортов с геном Stb5 составляла 62,1 %, с генами Stb1 , Stb2 и Stb4 ― 31,0726

48,3 %. Незначительная вирулентность (3,4 %) наблюдалась в случае Stb3 и Stb6 . Сорт с геном Stb8 был устойчив ко всем изолятам из этой популяции.

В популяции из Центрального района 42,2 % изолятов не имели генов вирулентности. У остальных главным образом выявлялось по 1-2 гена (40,6 % изолятов), реже по 3-5 генов (17,2 % изолятов). В целом, частота вирулентности в отношении Stb -генов была невысокой. Так, для Stb1 , Stb5 и Stb7 она составляла 26,6-31,1 %, для Stb2 , Stb3 и Stb4 — была вдвое ниже (10,9-14,1 %), для Stb6 и Stb8 — равнялась 0 %.

Северо-западная популяция M. graminicola была наименее разнообразной по генотипам вирулентности. Основное число изолятов не имели генов вирулентности (44,1 %) либо имели по одному гену вирулентности (32,3 %). Однако были и изоляты, которые несли по 3-6 генов, но их доля оказалась значительно меньше (14,7 %). Вирулентность наблюдалась чаще всего к генам устойчивости Stb1 и Stb7 (29,4-35,7 %). В отношении сортов с генами Stb2 , Stb3 , Stb4 и Stb5 частота вирулентности была заметно ниже и составляла от 5,9 до 17,6%. Ни у одного из изолятов не зафиксировали вирулентность к генам Stb6 и Stb8 .

Таким образом, региональные популяции M. graminicola различались по генотипам вирулентности, спектру и частоте встречаемости генов вирулентности. Вирулентность популяций из южной зоны (северо-кавказская, центрально-черноземная и поволжская) в целом была выше по сравнению с центральной и северо-западной популяциями, где наблюдалось высокое число авирулентных изолятов. Кроме того, популяции из южной зоны выделялись разнообразием генотипов вирулентности и более высоким числом изолятов с широким спектром вирулентности (3-6 генов). Такое географическое распределение вирулентности M. graminicola на территории России указывает на то, что южные популяции гриба более агрессивны, и это может быть одной из причин доминирования M. graminicola в септориозном комплексе на посевах пшеницы на юге страны.

2. Степень эффективности Stb -генов пшеницы ( Triticum aestivum L.) против региональных российских популяций Mycosphaerella graminicola (лабораторные тесты, образцы сборов 2009-2015 годов)

Регион	Эффективность Stb -генов (по проценту вирулентных изолятов)
	эффективные (< 20 %)	среднеэффективные (20-50 %)	неэффективные (> 50 %)
Северо-Кавказский	Stb2	Stb3, Stb4	Stb1, Stb5, Stb7
Центрально-Черноземный Stb2, Stb3, Stb4, Stb6, Stb8		Stb1	Stb5, Stb7
Поволжский	Stb3, Stb6, Stb8	Stb1, Stb2, Stb4	Stb5, Stb7
Центральный	Stb2, Stb3, Stb4, Stb6, Stb8	Stb1, Stb5, Stb7	Отсутствуют
Северо-Западный	Stb2, Stb3, Stb4, Stb5, Stb6, Stb8	Stb1, Stb7	Отсутствуют

Во всех популяциях M. graminicola наблюдалась более высокая частота вирулентности в отношении сортов с генами устойчивости Stb1, Stb5 и Stb7, свидетельствующая о том, что эти Stb-гены наименее эффективны (табл. 2). Реакция растений обычно выражалась в наличии некротических пятен с большой площадью поражения листа и формированием пикнид при средней и высокой интенсивности споруляции. В то же время значительной эффективностью против центральной, центрально-черноземной и северо-западной популяций M. graminicola обладали гены Stb2, Stb3, Stb4, однако отмечалось снижение их эффективности при заражении растений изолятами из северо-кавказской и поволжской популяций. Ген Stb6 был в высокой степени эффективным против всех пяти популяций M. graminicola. Только в поволжской популяции выявили вирулентность для сорта с этим геном, но она встречалась с низкой частотой (3,4 %). Ген Stb8 был абсолютно эффективным против всех протестированных изолятов. Растения редко имели видимые симптомы поражения, споруляция была очень скудной либо отсутствовала.

Итак, наши исследования показали, что 5 из 8 известных генов устойчивости ( Stb1 - Stb5 ) обладают только частичной функциональностью в природных популяциях Mycosphaerella graminicola в России, а эффективность гена Stb7 не подтвердилась в отношении всех изученных популяций. В то же время идентифицированы потенциальные источники устойчивости к септориозной листовой пятнистости — это сорта с генами Stb6 и Stb8 , которые могут быть рекомендованы для использования в селекционно-генетических программах по созданию форм, устойчивых к M. graminicola на территории Российской Федерации.

Авторы благодарят Dr. S.B. Goodwin (USDA-ARS, Crop Production and Pest Control Research Unit, Small Grain Fungal Disease Laboratory, США) за любезно предоставленные семена сортов с известными генами устойчивости Stb1-Stb8.