Генетические особенности опухолей невыявленной первичной локализации

Опухоли невыявленной первичной локализации (ОНПЛ) – метастатическое проявление злокачественных новообразований, при котором первичный очаг не выявляется по данным анамнеза и/ или результатам диагностических исследований [1]. Каждый год выявляются около 3–5 % новых случаев ОНПЛ от общего числа злокачественных новообразований [2]. Из-за небольшой численности и высокой гетерогенности ОНПЛ отсутствует понимание их биологии и механизмов образования. Тем не менее все случаи ОНПЛ имеют общие черты: раннее и агрессивное распространение, плохой прогноз и непредсказуемый метастатический характер [3, 4].

Опухоли невыявленной первичной локализации условно делят на 2 типа: с благополучным (15–20 %; медиана выживаемости 10–16 мес) и неблагоприятным (80–95 %; 3–6 мес) течением [5, 6]. Первый вариант клинического течения характерен для плоскоклеточного рака с поражением шейных лимфоузлов, низкодифференцированных нейроэндокринных карцином, карциномы Меркеля, метастазов аденокарциномы в подмышечные лимфоузлы и др. Неблагоприятное течение ОНПЛ связывают с такими факторами, как мужской пол, множественные метастазы аденокарциномы в головной мозг, печень, кости, легкие и низкодифференцированный рак [5, 7].

Механизмы формирования ОНПЛ пока плохо изучены. Согласно одной из гипотез, ОНПЛ является метастазом, сформированным на ранней стадии опухолевого процесса и развивающимся параллельно с первичным новообразованием [8]. По другой гипотезе ОНПЛ – это отдельная группа опухолей с фенотипическими и генотипическими особенностями [9]. Согласно данной гипотезе, формирование ОНПЛ может быть связано с ошибками эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) вследствие возникновения генетических нарушений, приводящих к фиксации клеток в гибридном состоянии и приобретения ими высокого туморогенного и инвазивного потенциалов [10].

Cеквенирование нового поколения (next-generation sequencing, NGS) рассматривается как один из основных инструментов выявления генетических изменений, вовлеченных в патогенез и прогрессирование злокачественных новообразований. Ранние работы по анализу мутационного профиля ОНПЛ показали, что наиболее часто нарушения встречаются в TP53 , KRAS , PIK3CA , ALK , EGFR ,

RET , FGFR1 , NTRK1 и других генах [1, 11–13]. Для ОНПЛ также характерны гиперэкспрессия генов MYC , ERBB2 / HER2 , EGFR и BCL2 [14] и белковая гиперэкспрессия металлопротеиназ MMP2, MMP9 и TIMP1 [15].

Цель исследования ‒ поиск генетических нарушений, характерных для ОНПЛ.

Материал и методы

В исследование включено 7 пациентов с ОНПЛ (табл. 1). Метастазы были обнаружены в лимфатических узлах (n=5) и легком (n=2). Хирургическим путем получены образцы метастазов (n=7). В процессе диагностики у 5 пациентов выявлены микроочаги первичной опухоли: рак почки, легкого, слюнных желез и брюшины. В связи с этим нами принято решение о переводе данных пациентов в группу сравнения (n=5).

Исследование выполнялось в соответствии с принципами Хельсинкской декларации (1964 г., дополненной в 1975 и 1983 гг.) и одобрено этическим комитетом НИИ онкологии Томского НИМЦ. От пациентов получено информированное согласие на добровольное участие.

Биоинформатический анализ данных проводился с помощью пайплайна GATK [16]. Байесовская статистика и апостериорная вероятность использовались для определения (calling) генотипов. Генетические варианты, в частности однонуклеотидные замены (SNVs), аннотировали с помощью инструмента ANNOVAR [17]. Отбор генов-драйверов канцерогенеза проводился с использованием ресурса IntOGen [18]. Для предсказания функциональной значимости мутаций в генах использовали инструменты SIFT и PolyPhen2 [19]. Для детекции аберраций числа копий ДНК (CNAs) применялся инструмент CNVkit с использованием метода циркулярной бинарной сегментации (circular binary segmentation, CBS) и скрытой Марковской модели (Hidden Markov Model, HMM) [20–22]. Расчеты

Таблица 1/table 1

Клинико-патологические параметры пациентов, включенных в исследованиеClinical and pathological parameters of patients included in the study проводились как в рамках исходных регионов эк-зомной панели Agilent SureSelect v7, так и с исключением регионов, входящих в трек Duke Excluded Regions на основании данных о картировании и уникальности с ENCODE и переразмеченных для референсного генома GRCh38/hg38. В итоговом анализе использовались только общие пересечения полученных с помощью разных методов и предобработки исходных данных CNA-сегменты. Частоту нарушений генов интереса в злокачественных новообразованиях получали из базы данных cBioPortal.

Результаты

В работе учитывались только генетические варианты, затрагивающие экзонные области генов

и имеющие функциональное влияние на белковые продукты согласно биоинформатическому анализу. Сравнение профиля генетических нарушений проводилось между пациентами (n=2), у которых очаг не был обнаружен в ходе детального инструментального анализа, и больными, у которых последующее диагностическое обследование выявило микроочаги первичной опухоли.

Для пациентов с ОНПЛ были характерны нарушения в гене эфринового рецептора EPHA8 (табл. 2). Согласно базе данных cBioPortal, соматические нарушения в гене EPHA8 встречаются в 1,3 % различных злокачественных новообразований. В исследуемых образцах мутации были представлены несинонимичным SNV и SNV с образованием стоп-кодона (stopgain). Инструмент

Код/ The code	Локализация метастазов/ Localization of metastases	Первичный очаг/ Primary tumor	Пол/ Gender	Возраст/ Age	Стадия/ Stage	TNM	Неоадъювантная химиотерапия/ Neoadjuvant chemotherapy
		Плоскоклеточный
1	Лимфоузлы/ Lymph nodes	рак слюнной железы/ Squamous cell carcinoma of	Ж/W	69	III	T3N1M0	Нет/No
		the salivary gland
		Немуцинозный микроинва-
2	Легкое/ Lung	зивный рак легкого/ Non-mucinous microinvasive	М/M	66	IV	T2NхM1	Нет/ No
		lung cancer
3	Шейные лимфоузлы/ Neck lymph nodes	Не выявлен/ Not identified	М/M	44	IV	TхNхM1	Нет/ No
	Легкое/ Lung	Мелкоклеточный
4		рак легкого/	Ж/W	63	IV	T1NхM1	Нет/ No
		Small cell lung cancer
5	Шейные лимфоузлы/ Neck lymph nodes	Светкоклеточный рак почки/ Clear cell renal cell carcinoma	М/M	69	IV	T2N3M1	Нет/ No
6	Шейные лимфоузлы/ Neck lymph nodes	Не выявлен/ Not identified	Ж/W	41	IV	TхNхM1	Да/ Yes
7	Лимфоузлы/ Lymph nodes	Рак брюшины/ Peritoneal cancer	Ж/W	58	IV	TisN1M1	Нет/ No

Таблица 2/table 2

Ген/ Gene	Хромосома: позиция/ Chromosome: position	Замена/ Change	Тип мутации/ Mutation type	SIFT	Polyphen2	ExAC	cBioPortal
	chr1:22593620	C>T	stopgain	.	.	0,0001
EPHA8	chr1:22601701	C>G	Несинонимичная SNV/ Nonsynonymous SNV	T	P	.	2,1 %

Примечание: chr – хромосома; stopgain – замена с образованием стоп-кодона; SIFT и Polyphen2 – инструменты для предсказания функциональной значимости мутаций (T – tolerant, P – pathogenic); ExAC – база данных о частоте встречаемости герминальных генетических вариантов в популяциях человека; cBioPortal – база данных о частоте встречаемости соматических генетических вариантов у онкологических больных.

sNVs, характерные для ОНПЛ sNVs specific for Cup

Note: chr – a chromosome; stopgain – nucleotide change with the formation of a stop codon; SIFT and Polyphen 2 are tools for predicting the functional significance of mutations (T – tolerant , P – pathogenic ); ExAC - database on the frequency of occurrence of germline genetic variants in human populations; cBioPortal – a database on the frequency of occurrence of somatic genetic variants in cancer patients.

Таблица 3/table 3

Ген/ Gene	Хромосома: позиция/ Chromosome: position	Замена/ Change	Тип мутации/ Mutation type	SIFT	Polyphen2	ExAC	cBioPortal
HSPG2	chr1:21890485	G>T	Несинонимичная SNV/ Nonsynonymous SNV	D	D	.	4,7 %
PTPN13	chr4:86762995	G>T	Несинонимичная SNV/ Nonsynonymous SNV	D	D	0,0038	3,4 %
KMT2C	chr7: 152252087	C>A	Несинонимичная SNV/ Nonsynonymous SNV	D	D	.	8,7 %
MET	chr7:116699902	C>A	Несинонимичная SNV/ Nonsynonymous SNV	D	P	0,00003314	2,6 %
ZNF680	chr7:64521784	A>AT	frameshift insertion	.	.	.	1,3 %
RET	chr10:43128192	T>G	Несинонимичная SNV/ Nonsynonymous SNV	D	D	.	2,5 %
BCL9L	chr11:118900780	G>A	Несинонимичная SNV/ Nonsynonymous SNV	D	D	.	2,4 %
CBL	chr11:119273924	G>T	Несинонимичная SNV/ Nonsynonymous SNV	D	P	.	1,6 %
POLE	chr12:132641819	C>T	Несинонимичная SNV/ Nonsynonymous SNV	T	D	0,000008327	3,6 %
CDKN1B	chr12:12717874	G>C	Несинонимичная SNV/ Nonsynonymous SNV	T	B	.	0,9 %
FLT3	chr13:28023459	T>A	Несинонимичная SNV/ Nonsynonymous SNV	T	D	.	3,1 %
ING1	chr13:110715537	CTG>C	frameshift deletion	.	.	0,00000825	1,0 %
DICER1	chr14:95133439	T>C	Несинонимичная SNV/ Nonsynonymous SNV	D	B	0,0018	2,9 %
COL1A1	chr17:50199881	G>C	Несинонимичная SNV/ Nonsynonymous SNV	D	B	.	2,9 %
RNF213	chr17:80263763	G>A	Несинонимичная SNV/ Nonsynonymous SNV	D	P	.	5,1 %
EFTUD2	chr17:44879596	A>G	Несинонимичная SNV/ Nonsynonymous SNV	D	B	.	1,5 %
TP53	chr17: 7674250	C>A	Несинонимичная SNV/ Nonsynonymous SNV	D	D	.	37,0 %
SETBP1	chr18:44953148	G>C	Несинонимичная SNV/ Nonsynonymous SNV	T	B	.	3,5 %
CNOT3	chr19:54149598	G>C	Несинонимичная SNV/ Nonsynonymous SNV	T	D	.	1,6 %
SMC1A	chrX:53415142	C>A	Несинонимичная SNV/ Nonsynonymous SNV	D	D	.	2,2 %
AR	chrX:67717535	G>T	Несинонимичная SNV/ Nonsynonymous SNV	D	D	.	2,1 %

Примечание: chr – хромосома; frameshift insertion – инсерция со сдвигом рамки считывания; frameshift deletion – делеция со сдвигом рамки считывания; SIFT и Polyphen2 – инструменты для предсказания функциональной значимости мутаций (D – deleterious, T – tolerant, P – pathogenic, B – benign); ExAC – база данных о частоте встречаемости герминальных генетических вариантов в популяциях человека; cBioPortal – база данных о частоте встречаемости соматических генетических вариантов у онкологических больных.

sNVs в генах-драйверах канцерогенеза, характерные для ОНПЛ sNVs in cancer driver genes specific for Cup

Note: chr – a chromosome; SIFT and Polyphen 2 are tools for predicting the functional significance of mutations (D – deleterious,

T – tolerant, P – pathogenic, B – benign); ExAC - database on the frequency of occurrence of germline genetic variants in human populations; cBioPortal – a database on the frequency of occurrence of somatic genetic variants in cancer patients.

Таблица 4/table 4

Хромосома: регион и позиция/ Chromosome: region and position			Тип мутации/ Mutation type	Гены, входящие в регион/ Genes located on in the region	cBioPortal
			Амплификация/Amplification	ID2	0,9 %
Chr2	2p25.1	7220102–8731313	Делеция/Deletion		0,3 %
			Амплификация/ Amplification	KIDINS220	1,0 %
			Делеция/Deletion		0,3 %
Chr3	3p26.2	3845079–3845341	Делеция/Deletion	LRRN1	0,9 %
Chr5	5p15.33	664496–664996	Амплификация/Amplification	CEP72 TPPP	4,4 % 4,4 %
Chr8	8p23.3	243951–244457	Делеция/Deletion	ZNF596	4,1 %
Chr9	9p24.3	52745–116710	Амплификация/Amplification	FOXD4	1,2 %
Chr10	10p15.3	179367–179867	Амплификация /Amplification	ZMYND11	1,0 %
			Делеция/Deletion		0,3 %
Chr17	17p13.3	745033–747876	Делеция/Deletion	GEMIN4	0,9 %
ChrX	Xp22.33	3325102–3329943	Амплификация/Amplification	MXRA5	1,0 %
			Делеция/Deletion		0,3 %

Примечание: chr – хромосома; cBioPortal – база данных о частоте встречаемости соматических генетических вариантов у онкологических больных.

CNas, характерные для ОНПЛ

CNas characteristic of Cup

Note: chr – a chromosome; cBioPortal – a database on the frequency of occurrence of somatic genetic variants in cancer patients.

для предсказания функциональной значимости мутаций, Polyphen2, обозначил несинонимичный SNV как патогенный вариант.

Используя инструмент IntOGen, среди генов, мутации которых были обнаружены в ОНПЛ, были выделены гены-драйверы канцерогенеза, характерные для различных злокачественных новообразований. Так, в одном случае ОНПЛ мутации были обнаружены в 26 генах-драйверах канцерогенеза, среди которых 21 ген был уникален по сравнению с контрольной группой ( HSPG2 , PTPN13 , KMT2C , MET , ZNF680 , RET , BCL9L , CBL , POLE, CDKN1B , FLT3 , ING1 , DICER1 , COL1A1 , RNF213 , EFTUD2 , TP53 , SETBP1 , CNOT3 , SMC1A и AR ) (табл. 3). С помощью инструментов SIFT и Polyphen2 обнаружено, что большинство генетических нарушений характеризуются как патогенные.

Помимо SNVs в ОНПЛ были обнаружены следующие CNAs: делеции и амплификации регионов 2p25.1, 10p15.3 и Xp22.33, делеции хромосомных участков 3p26.2, 8p23.3 и 17p13.3 и амплификации регионов 5p15.33 и 9p24.3 (табл. 4). В данных регионах локализованы гены, кодирующие факторы транскрипции ID2 (Inhibitor of DNA binding 2), FOXD4 (Forkhead Box D4), ZMYND11 (Zinc finger MYND-type containing 11) и ZNF596 (Zinc finger protein 596), трансмембранные белки KIDINS220 (Kinase D Interacting Substrate 220) и LRRN1 (Leucine Rich Repeat Neuronal 1), регулятор биогенеза микроРНК GEMIN4 (Gem Nuclear Organelle Associated Protein 4), компоненты клеточного цитоскелета CEP72 (Centrosomal Protein 72) и TPPP (Tubulin Polymerization Promoting Protein) и протеогликан, участвующий в адгезии и ремоделировании внеклеточного матрикса MXRA5 (Matrix-remodeling associated 5). Согласно базе данных cBioPortal, амплификации регионов в генах ID2, KIDINS220, CEP72, TPPP, FOXD4, ZMYND11 и MXRA5 встречаются в 0,9, 1,0, 4,4, 4,4, 1,2, 1,0 и 1,0 % случаев с различными злокачественными новообразованиями соответственно. Частота делеций генов ID2, KIDINS220, LRRN1, ZNF596, ZMYND11, GEMIN4 и MXRA5 составляет 0,3, 0,3, 0,9, 4,1, 0,3, 0,9 и 0,3 % соответственно (табл. 4).

Обсуждение

Механизмы возникновения ОНПЛ до сих пор неизвестны. Одной из причин ОНПЛ могут быть нарушения в генах-регуляторах клеточной миграции, в частности эпителиально-мезенхимального перехода [10]. Предполагается, что появление мутаций в данных генах приводит к фиксации клеток в состоянии гибридного ЭМП и приобретению ими способности к инвазии и метастазированию [10]. Соответственно, исследование мутационного профиля ОНПЛ актуально и может пролить свет не только на природу данного типа злокачественных новообразований, но и выявить новые гены-регуляторы миграции и инвазии опухолевых клеток.

Предыдущие исследования показали, что для ОНПЛ характерны нарушения TP53, KRAS, CD-KN2A, EGFR, KEAP1, SMARCA4, BRAF, BRCA1, BRCA2, CDK4, ERBB2, MET, AKT1, ERBB2, IDH2, PIK3CA, PTCH1, FGFR1, MDM2 и других генов, вовлеченных в регуляцию широкого круга кле- точных процессов, в том числе ЭМП, миграции и инвазии [6, 12, 23–25]. Однако в данных исследованиях использовалось таргетное NGS с фокусом на десятки/сотни генов, наиболее часто мутирующих в злокачественных новообразованиях. При таком подходе исключается вероятность выявления нарушений в других генах, в том числе в редко встречающихся типах рака.

В представленном исследовании мутационный профиль ОНПЛ был изучен с помощью полноэк-зомного секвенирования. Согласно полученным данным, обнаружены несинонимичные SNVs в генах-драйверах канцерогенеза TP53 и MET , что согласуется с данными литературы.

Помимо SNVs, для ОНПЛ были характерны делеции и амплификации регионов 2p25.1 ( ID2 и KIDINS220 ), 10p15.3 ( ZMYND11 ) и Xp22.33 ( MXRA5 ), только делеции хромосомных участков 3p26.2 ( LRRN1 ), 8p23.3 ( ZNF596 ) и 17p13.3 ( GEMIN4 ) или амплификации регионов 5p15.33 ( CEP72 и TPPP ) и 9p24.3 ( FOXD4 ) (табл. 4). Амплификация гена TPPP ранее была описана в клетках рака мочевого пузыря и связана с прогрессированием заболевания [29]. Мутации гена MXRA5 обнаружены у больных немелкоклеточным раком легкого [30].

Для некоторых генов, нарушения которых обнаружены в ОНПЛ, известна роль в миграции, инвазии и метастазировании различных злокачественных опухолей. Гены ID2 , ZMYND11 и KIDINS220 описаны как опухолевые супрессоры, нокаут которых способствует увеличению пролиферации, миграции, инвазии и ЭМП in vitro и метастазированию in vivo клеток рака молочной