Генетические предпосылки развития постхимиолучевых легочных повреждений и пути их профилактики у больных раком молочной железы

Комбинированная терапия рака молочной железы (РМЖ) сопровождается целым рядом осложнений и побочных эффектов. Повреждение легких при применении химиолучевой терапии возникает в 50–100% пациентов [8]. Частыми среди повреждений легких является пневмонит, склероз и фиброз легких [2]. Механизм противоопухолевого действия цитостатиков и луче-

Фундаментальная онкология и экспериментальная медицина вой терапии разный, но при их сочетании резко возрастают токсические побочные эффекты [10]. Это связано с образованием свободных радикалов и угнетением активности антиоксидантной системы, накоплением продуктов перекисного окисления липидов, активацией про-воспалительных и профибротических факторов [3]. Интенсификация терапии РМЖ требует поиска эффективных протекторов для профилактики постхимиолучевых повреждений.

Несмотря на стандартизацию методов лечения, легочные осложнения встречаются далеко не у каждой пациентки. Степень их выраженности также достаточно вариабельная, что позволяет предположить генетическую детерминированность таких процессов. В литературе освещены вопросы участия системы матриксных металлопротеиназ (MMP) в развитии ряда заболеваний легких. Однако роль MMP в патогенезе постхимиолучевой легочной патологии остается не изученной [9]. Одним из факторов, с которым связан целый ряд заболеваний и осложнений фармакотерапии, является генетически обусловленный высокий уровень гомоцистеина. Гипергомоцистеинемия (ГГ) играет важную роль в механизме печеночного и кардиального фиброгенеза [11]. Среди ряда генетически детерминированных факторов развития ГГ наиболее распространенным является полиморфизм С677Т в гене метилен-тетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) — энзима цикла реметилирования гомоцистеина [6]. Возможно, ассоциированные с мутацией MTHFR биохимические нарушения смогут служить предикторами формирования пневмофиброза у больных, получающих химио- и радиотерапию.

Коррекцию ГГ можно провести поступлением фолиевой кислоты и антиоксидантов [7]. По нашему мнению, тиотриазолин и кверцетин имеют все основания для использования в качестве протекторов постхимиолучевых осложнений [1, 4, 5].

Цель исследования

Установить роль генетических факторов в развитии постхимиолучевых легочных повреждений у больных РМЖ и разработать пути их профилактики в группах повышенного риска.

Материалы и методы

В исследование было включено 288 больных, которые прошли комбинированное лечение по поводу РМЖ.

Пациентки были разделены на две группы: контрольную группу составили 142 больные, прошедшие химиотерапию по схеме ЦМФ и облучение (45 Гр). Клиническую группу составили 146 больных, которые, кроме стандартного лечения, получили кверцетин по 10 мг/кг перорально и тиотриазолин по 2,0 мл 1% раствора в/м три раза в сутки на протяжении всего лечения.

По результатам молекулярно-генетического анализа больные были разделены на подгруппы: дикий тип С/С гена MTHFR; гетерозиготный тип (мутация С/Т) и гомозиготный тип (мутация Т/Т). По полиморфизму гена MMP-12 — на дикий тип А/А и с мутацией по гетерозиготному типу A/G. А также подгруппа с сочетанием дикого типа (аллели А/А) гена MMP-12 с мутацией гена MTHFR-667Т и подгруппа с мутацией в обоих генах MMP-12 АG + MTHFR-667Т.

Экспериментальную часть проводили на 240 крысах генетических линий Fisher 344, Wistar, спонтанно-гипертензивных (СГК). В эксперименте было модулировано химио-лучевое повреждение легких путем введения циклофосфамида в терапевтических дозах и облучение крыс в дозе, эквивалентной 45 Грей.

Результаты исследования и их обсуждение

Проанализировав осложнения, которые чаще всего встречаются после лечения РМЖ, мы обнаружили, что более чем у половины больных развиваются разного рода легочные повреждения, которые носят длительный характер и часто заканчиваются формированием пневмофиброза. Клинически они сопровождались одышкой, кашлем, болью в грудной клетке, лихорадкой и общей слабостью. Через 3 месяца от начала лечения клиника была обусловлена развитием острого пульмонита и бронхита, через 6 месяцев явления воспаления уменьшались, а через 1 год у части больных проявлялись с новой силой, что совпадало с вы-

Генетические предпосылки развития постхимиолучевых легочных повреждений и пути их профилактики у больных раком молочной железы явлением у них при спиральной компьютерной томографии (СКТ) очагов пневмофиброза.

В диагностике легочных осложнений важную роль играет исследование функции внешнего дыхания. Так форсированная жизненная емкость легких у больных РМЖ через 3 месяца после химиолучевой терапии (p <0,05) составила 21,6 ± 9,9%, через 6 месяцев почти восстанавливалась и составила 91,7±9,3%, а через 12 месяцев составляла 80,7±11,6% от нормы. Максимальная вентиляция легких через 3 месяца составляла 81,9±11,4% от нормы, через 6 месяцев — 92,3±9,2%, а через 12 месяцев была ниже нормы на 28,8±15,2% (p <0,05). Пиковая объемная скорость выдоха через 3 месяца была ниже нормы на 23,8±12,6%, через 6 месяцев достоверно не отличалась от нормы, а через год была на 26,8±13,4% ниже нормы (p <0,05).

Лучшим методом ранней диагностики постхимиолучевых бронхитов, пульмонита и пневмофиброза является СКТ. Постлучевой бронхит определялся нами в 30,9±2,7% больных, пневмонит — у 31,9±2,7% больных. Среди пациенток, перенесших острый пульмонит, склероз и фиброз легких, через 12 месяцев определялся у 30,3±4,8% больных. Интересным фактом было то, что пневмофиброз или пневмосклероз через 12 месяцев был обнаружен у 13,4±2,9% от общего числа больных, не имевших ранних осложнений, а у 43,7±4,2% от общего числа пациентов, имевших ранее осложнения, через 12 месяцев ни явлений склероза, ни фиброза в легких не выявлено. У 23,2±3,5% больных не было ни ранних, ни поздних осложнений, несмотря на идентичность методов химиолучевой терапии. Это можно объяснить разной резистентностью легочной ткани к хи-миолучевой терапии, которая является очевидно генетически детерминированной.

В эксперименте, исследовав морфологию легочной ткани крыс разных генетических линий, мы обнаружили, что облучение вызывает склероз стромы, циклофосфамид (ЦФ) приводит к депрессии лимфоидной ткани легких, а сочетание облучения с введением ЦФ усиливает степень развития пневмофиброза. Все изменения были наиболее выраженными в группе СГК и наименее — у крыс группы Wistar, что доказывает роль генетических факторов в развитии постхимиолучевых легочных осложне- ний. Испытав кверцитин и тиотриазолин на модели постхимиолучевого повреждения легких у крыс, мы получили выраженный протекторный эффект и обнаружили различную его активность у крыс разных генетических линий.

Исследовав влияние химиолучевого лечения на легкие больных с различным генотипом MTHFR, мы обнаружили существенные (p <0,05) различия. На СКТ у всех пациенток с Т/Т мутацией и в 31±9,0% — с С/Т мутацией гена MTHFR обнаружен пневмофиброз. У больных группы С/С пневмофиброз развился только у 10±5,0% пациенток. Фиброзно-склеротические изменения в легких приводили к значительному ухудшению показателей внешнего дыхания, что особенно было заметно у больных с мутациями Т/Т и С/Т. Так, форсированная жизненная емкость легких была в группе больных с Т/Т мутацией достоверна на 33,0±1,3%, а в группе с С/Т мутацией на 27,2±8,0% ниже нормы, максимальная вентиляция легких, соответственно, — на 50,6±1,8% и 50,3±7,9%, пиковая объемная скорость выдоха — на 48,1±0,8% и 42,8±1,5%. Тогда как у больных С/С она почти не отличалась от нормы.

Исследовав влияние полиморфизма С677Т в гене MTHFR и мутации А/G гена MMP-12 на биохимические механизмы развития постхи-миолучевых повреждений легких, мы обнаружили, что у больных с гетерозиготной С/Т и особенно гомозиготной Т/Т аллели гена MTHFR достоверно увеличивается уровень гомоцистеина, интелейкина (ИЛ)-6, С-реак-тивного протеина (СРП), трансформирующего фактора роста (ТФР)-р1, свободного оксипролина и маркеров оксидативного стресса. Полиморфизм гена С677Т MTHFR детерминирует различия не только на базальном уровне гомоцистеина, но и в содержании весомых регуляторов фибротических и воспалительных процессов. Более высокие уровни профиброти-ческих и провоспалительных медиаторов могут детерминировать повышенную склонность к развитию пневмофиброза, особенно после проведения химиолучевой терапии.

Полиморфизм в гене MMP-12 не ассоциируется с ГГ и системными изменениями содержания ТФР-р1, ИЛ-6, СРП, но в сочетании с мутацией С677Т MTHFR усиливает негативное влияние последней.

Фундаментальная онкология и экспериментальная медицина

Полиморфизм гена С677Т MTHFR у больных РМЖ встречается в 5 раз чаще, чем в общей популяции, что приводит к увеличению лиц с генетически детерминированной предрасположенностью к ГГ, особенно при гомозиготном Т/Т генотипе. ГГ тесно коррелирует с маркерами воспаления, оксидатив-ного стресса и фиброгенеза (ТФР-р1 r = 0,66; ИЛ-6 r = 0,64; оксипролина r = 0,54; МДА r = 0,70), что может быть прогностически неблагоприятным фактором в лечении больных РМЖ.

Показав, что у больных РМЖ с гетеро- и гомозиготным типом 677Т мутации MTHFR пневмофиброз после химиолучевой терапии развивался значительно чаще, чем у больных с диким типом, мы решили исследовать роль мутации С677Т гена МТHFR в активации индуцированных химиолучевой терапией провоспали-тельных, прооксидантных и профибротичних агентов у больных РМЖ. Оказалось, что под влиянием химиолучевой терапии рос уровень гомоцистеина особенно у гомозигот Т/Т, что усиливало процессы перекисного окисления липидов и белков. Так, максимальный прирост уровня МДА отмечался у гомозигот Т/Т (31,1±2,4%), в то время как у гомозигот С/С и даже у гетерозигот С/Т динамика этого показателя была практически вдвое меньше и составляла 14,7±1,5% и 18,8±3,0% соответственно.

Накопление карбонильных групп белков в сыворотке крови пациентов с генотипом Т/Т было наибольшим (40,0±4,6%), а наименьшим — у пациентов с генотипом С/С (21,1±2,0%), в группе гетерозигот С/Т динамика составила 30,8±7,0%. У больных РМЖ после химиолучевой терапии регистрировалось достоверное повышение содержания ТФР-р1, оксипролина, ИЛ-6 и СРП в сыворотке крови. У гомозигот дикого типа С/С содержание ТФР-р1 в среднем повысилось на 11,0±1,1%, у гетерозигот С/Т — на 17,8±1,9%, в то время как у гомозигот Т/Т — на 51,8±3,5%, содержание ИЛ-6 в сыворотке крови у гомозигот Т/Т выросло на 30,7±4,8%, средний прирост у гетерозигот С/Т составил 39,4±8,1% и наименьшим он был у гомозигот дикого типа С/С — 19,1±4,0%.

Исследование мутации гена MTHFR позволяет выявить пациентов с потенциально высоким риском развития постхимиолучевых легочных повреждений и ввести систему превентивных мероприятий.

Получив обнадеживающие результаты от применения кверцетина и тиотриазолина у животных, мы изучили их влияние на развитие постхимиолучевых легочных повреждений у больных РМЖ и возможность предупреждения ими негативного влияния мутаций генов МТHFR и MMP-12. Применив их у 146 пациенток, мы получили выраженный протекторный эффект. Ни у одной из пациенток, получавших химиолучевую терапию на фоне протекторов, фиброз легких не развивался, пневмосклероз на СКТ был обнаружен у 5 больных, что составило 3,4±1,5% от общего числа. Значительно уменьшились явления воспаления и улучшились показатели внешнего дыхания.

Уже через 3 месяца от начала лечения количество больных с кашлем под влиянием протекторов уменьшилось с 64,1±4,0% до 31,5±3,8%, с одышкой с 54,9±4,1% до 28,8±3,7% (p <0,001). Через 12 месяцев явления пневмосклероза и фиброза легких выявлялись на СКТ у 33,1±3,9% больных контрольной группы, в группе больных, которые использовали протекторы, пневмосклероз развился только у 3,4±1,5% пациенток, а фиброз легких не определялся вовсе.

Прием протекторов значительно улучшал через 12 месяцев и показатели внешнего дыхания. Так, форсированная жизненная емкость легких в контрольной группе больных через 12 месяцев была достоверно (p <0,05) ниже нормы и составляла 2,52±0,36 л, в группе больных, получавших протекторы, она составила 2,88 ± 0,18 л, что статистически значимо не отличалась от нормы. Максимальная вентиляция легких у больных контрольной группы составляла 69,9±14,6 л/мин, тогда как у больных с протекторами — 92,0±4,8 л/мин. Пиковая объемная скорость выдоха в контроле была ниже нормы на 26,8±1,3%, когда в группе с протекторами достоверно не отличалась от нормы.

Применение кверцетина и тиотриазолина уменьшало признаки окислительного повреждения белков у гомозигот Т/Т на 32,7±5,0% и практически полностью нивелировало их у гомозигот С/С.

Под влиянием химиолучевой терапии у пациентов РМЖ повышалось содержание гомоцистеина, маркеров воспаления и оксидантного стресса, рос уровень ТФР-р1 и ок-

Генетические предпосылки развития постхимиолучевых легочных повреждений и пути их профилактики у больных раком молочной железы сипролина. Применение протекторов уменьшало, а иногда полностью нивелировало это нежелательное проявление. Так уровень гомоцистеина в группе больных дикого типа (С/С) при применении протекторов уменьшился на 8±4% и практически не отличался от исходного уровня. В группе больных с С/Т мутацией уровень гомоцистеина под действием протекторов уменьшился на 9,7±5,0%, а в группе Т/Т — на 8,7±4,0%. У гомозигот типа С/С химиолучевая терапия повышала содержание профибротического агента ТФР-Р1 на 10,0±2,5%, у гетерозигот С/Т — на 18,2±4,5%, а у гомозигот Т/Т — на 48,5±5,5%. В то же время, в группе пациентов, профилактически получавших протекторы, химио- ра-диоиндуцированное повышение содержания ТФР-Р1 не превышало 8,1±3,3% (у гомозигот Т/Т) и достоверно не отличалось от исходных показателей у гомозигот дикого типа С/С и гетерозигот С/Т. При сочетании химиолучевой терапии с кверцетином и тиотриазолином прирост уровня провоспалительных медиаторов ИЛ-6 и СРП в сыворотке крови больных РМЖ достоверно не отличался от исходного уровня во всех подгруппах, хотя в группе без протекторов после химио-радиотерапии уровень ИЛ-6 рос у гомозигот дикого типа С/С на 19,1±9,1%, а у носителей С/Т и Т/Т мутации до 36,6±9,5% и 52,3±10,6% соответственно.

Выводы

• 1.    Генетические факторы, а именно мутация С677Т в гене MTHFR и полиморфизм А/G гена MMP-12, имеют непосредственное влияние на развитие постхимиолучевых легочных повреждений у больных раком молочной железы. У носителей аллели А/G гена MMP-12 в сочетании с мутацией С677Т гена MTHFR значительно возрастает риск развития фиброза легких и других постхимио-лу-чевых легочных повреждений.

• 2.    Профилактическое назначение кверцетина и тиотриазолина достоверно уменьшает индуцированные химиолучевой терапией нарушения уровня гомоцистеина, ИЛ-6, ТФР- β 1, МДА и карбонильных групп белков в сыворотке крови у гомо- и гетерозиготных носителей Т-алле-ли и практически нивелирует их у гомозигот дикого типа, что позволяет рекомендовать их в качестве модуляторов негативного влияния мутации гена С677Т MTHFR у больных РМЖ.

• 3.    Применение кверцетина и тиотриазолина уменьшает частоту развития постхимиолу-чевых бронхитов с 30,9±2,7% до 4,0±1,3%, пульмонита с 31,9±2,7% до 5,0±1,4%, склероза легких с 13±2,4% до 3,0 ±1,0%. Пневмофиброз у больных, получавших протекторы, не встречался, когда в контрольной группе он определялся у 20±2,8% больных.