Генетический анализатор для фрагментного анализа ДНК

Совокупность генетической информации, определяющей особенности организма, сосредоточена в его геноме в виде последовательностей нуклеотидов в составе информационных молекул (ДНК или РНК). Отдельные фрагменты информационных молекул, которые кодируют белки, называются генами.

В медицине данные о геноме позволяют точно идентифицировать возбудителей инфекционных заболеваний (вирусы, бактерии, паразиты), уточнять их биологические особенности (степень патогенности), а также определять тактику лечения и профилактики (например, устанавливать чувствительность к определенным лекарственным препаратам).

Автоматизированные приборы для чтения последовательностей нуклеотидов в ДНК (секвенирование ДНК) и анализа их отдельных фрагментов получили название генетических анализаторов (секвенаторов).

КОНСТРУКТИВНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗАТОРА

Восьмикапиллярый генетический анализатор разрабатывается в ИАП РАН на основе однокапиллярного анализатора НАНОФОР® 05 [1–4].

Создан макет анализатора, позволяющий выполнить одновременно генетический анализ восьми образцов. Внешний вид макета представлен на рис. 1. Технические решения защищены патентами [5, 6], патентообладатель — ИАП РАН.

Анализатор содержит компоненты, показанные на функциональной схеме (рис. 2).

Основными узлами анализатора являются:

– позиционер — система двигателей, обеспечивающих двухмерное перемещение планшета с пробами и вспомогательными растворами (вода, буфер);

– термостатируемая кассета — устройство, в котором закрепляется и термостатируется линейка капилляров;

– устройство заполнения капилляра гелем;

– высоковольтный источник (ВВИ), создающий электрическое поле в капилляре и обеспечивающий как внесение пробы в капилляр, так и разделение ДНК в капилляре;

– лазер-индуцированный флуориметрический детектор, состоящий из лазера, системы зеркал, фильтров, линз и фотоэлектронных умножителей.

Рис. 1. Внешний вид макета генетического анализатора

Рис. 2. Функциональная схема макета генетического анализатора

Для электрофоретического разделения фрагментов нуклеиновых кислот использованы кварцевые капилляры, заполненные раствором геля. Капилляры с электродами опускаются в лунки планшета с растворами исследуемых образцов, и высоковольтный источник тока обеспечивает электрокинетическое введение пробы в капилляр (отрицательно заряженная ДНК движется из раствора в гель к положительно заряженному электроду, находящемуся на противоположном конце капилляра). Далее под действием электрического поля происходит разделение внесенных в капилляр фрагментов ДНК. Ранее при проведении реакции секвенирования в состав разделяемых фрагментов нуклеиновых кислот введены флуоресцентные красители. При достижении флуорес-центно-меченными фрагментами ДНК оптического окна, находящегося вблизи конца капилляра (более короткие фрагменты достигают его быстрее, а более длинные — медленнее), лазером производится возбуждение флуоресцентных красителей в составе ДНК, а регистрация флуоресценции — детектором. При этом в случае разделения секвенсной смеси отдельный цвет пика на электрофореграмме соответствует определенному нуклеотиду, а последовательность пиков представляет собой последовательность расшифровываемого (секвенируемого) участка ДНК. Полученные от детектора данные обрабатываются с помощью специального программного обеспечения и выдаются пользователю в заданном виде. Данный метод является очень точным и обеспечивает эффективное разделение отличающихся лишь на один нуклеотид фрагментов ДНК в диапазоне длин от 20 до 1000 нуклеотидов.

Основным отличием вновь разработанного анализатора является наличие устройства сканирования капилляров. В этом устройстве использован кулачковый привод платформы, на которой установлены микрообъектив и зеркало.

Для фокусирования лазера на капиллярах и сбора флуоресценции используется конфокальная оптическая схема. Устройство сканирования обеспечивает возбуждение флуоресцентных красителей и одновременную регистрацию флуоресценции последовательно при совпадении фокуса микрообъектива с центром каждого капилляра. Регистрация флуоресценции осуществляется одноканальными фотоэлектронными умножителями.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Макет разработанного анализатора позволяет регистрировать флуоресценцию красителей в пяти каналах детекции, суммированных в таблице.

Интерференционные фильтры каналов № 1–4 соответствуют максимумам флуоресценции красителей, используемых при анализе продуктов реакции секвенирования и фрагментном анализе, а фильтр канала № 5 — красителю, входящему в состав фрагментов маркера молекулярного веса.

Каналы детекции сигнала флуоресценции

№	Длина волны максимума пропускания фильтра, нм	Детектируемые флуоресцентные красители
1	520	FAM, R110, AlexaFluoro-488
2	550	R6G, JOE, VIC, HEX
3	580	TAMRA, NED, Cy3
4	610	ROX
5	650	LIZ, Cy5, DY632

2 700

2 650

2 600

2 550'

2 500'

2 450.

2 400

2 350

2 300

2 200.

2 050.

2 000

1 950

1 900

1 850

1 800.

1 700.

1 600

1 550'

1 500

1 400.

1 350.

1 300

1 250 ■

1 200

1 150.

1 100 .

• 1    280    1 290 " 1 300   1 316    1 320 1 3^-30    1 340 ’ 1 350 1 360"       ,

Время, с

Время, с

Рис. 4. Пример разделения спектрального калибратора СК-5.

Напряженность электрического поля — 280 В/см

Рис. 3. Пример разделения смеси 6-FAM-T 100 и 6-FAM-T 101 в 6 % ПДМА.

Напряженность электрического поля — 250 В/см

Для обеспечения процесса разделения фрагментов ДНК в капилляре был приготовлен специальный гель — водный раствор линейного поли-диметилакриламида (ПДМА). Линейный ПДМА был получен путем свободнорадикальной полимеризации диметилакриламида по стандартной методике, описанной ранее [7]. Был приготовлен раствор ПДМА с содержанием геля 6 %. Разрешающую способность полимера оценивали с помощью тестовой смеси синтетических фрагментов олиготимиди-латов длиной 100 и 101 нуклеотидов, содержащих на 5’-конце флуоресцентный краситель 6-карбокси-флуоресцеин (FAM) (рис. 3). Разрешающую способность раствора полимера рассчитывали по формуле

Rs = 1/2⋅(Wh1 + Wh2) / ∆X⋅∆M, где Rs — разрешение; Wh1 и Wh2 — ширина на половине высоты пиков 1 и 2, с; ∆M — разность размеров фрагментов в нуклеотидах; ∆X — расстояние между пиками, с.

Рассчитанное значение разрешающей способности смеси 6-FAM-T 100 и 6-FAM-T 101 в 6 % ПДМА составило 1.58.

Для учета и нормализации свечения флуоресценции красителей в соседние каналы детектирования, так называемой спектральной калибровки генетического анализатора, было разработано два набора флуоресцентно-меченных фрагмента ДНК. Один, предназначенный для калибровки с целью проведения фрагментного анализа, состоит из пяти фрагментов ДНК длиной 62, 82, 94, 106, 120 нуклеотидов, меченных красителями DY632, ROX, TAMRA, R6G и FAM — спектральный калибратор 5 (СК-5). Результаты разделения этого спектрального калибратора представлены на рис. 4.

Второй калибратор, предназначенный для анализа продуктов реакции секвенирования, состоит из четырех фрагментов ДНК длиной 21, 32, 47 и 66 нуклеотидов, содержащих красители с резонансным переносом энергии флуоресценции FAM-ROX, FAM-TAMRA, FAM-R6G и FAM [8] — спектральный калибратор 4 (СК-4). Результат его разделения представлен на рис. 5.

а

Время, мин

Рис. 5. Пример разделения спектрального калибратора СК-4.

а — сырые данные, б — данные после обработки. Напряженность электрического поля — 280 В/см

б                    Время, мин

Рис. 6. Пример разделения маркера молекулярного веса М-450.

Напряженность электрического поля — 280 В/см

Рис. 7. Пример разделения "аллельной лестницы". Напряженность электрического поля — 280 Вт/см

Для определения длин анализируемых фрагментов ДНК в диапазоне 60–450 нуклеотидов был разработан маркер молекулярного веса М-450, состоящий из 24 фрагментов различной длины, каждый из которых на 5’-конце содержал флуоресцентный краситель DY632. Пример разделения маркера М-450 приведен на рис. 6.

На рис. 7 приведены результаты электрофоретического анализа "аллельной лестницы" — фрагментов ДНК, представляющих собой полный набор вариантов коротких тандемных повторов 19 генов человека, используемых в международных панелях для генетической идентификации личности. Данные получены с помощью набора COrDIS Plus, производства ООО "Гордиз", Россия.

Время, мин

Рис. 8. Пример разделения продуктов амплификации образца МК-1, полученных с использованием набора COrDIS Plus

На рис. 8 показан результат разделения образца МК-5, представляющего собой смесь продуктов мультиплексной амплификации 20 локусов контрольной ДНК человека, входящей в состав набора COrDIS Plus. На электрофореграмме в форме пиков изображены амплифицированные фрагменты ДНК, соответствующие аллелям 19 STR-маркеров и пол-специфичного локуса амело-генина. Совокупность длин аллельных фрагментов описывает индивидуальный генетический профиль, уникальный для каждого человека за исключением монозиготных близнецов. Все маркеры, представленные на рис. 8, активно используются в судебной генетике и входят в состав двух стандартных международных панелей маркеров CODIS и ESS. Генетический профиль в данном формате может быть использован экспертами-генетиками для идентификации личности, анализа родства и сравнения следов биологического происхождения с криминалистической базой ДНК-профилей. Представленные результаты демонстрируют возможность использования прибора НАНОФОР® 05 для решения этих задач.

Полученная в результате проведенных экспериментов скорость фрагментного анализа составляет 13.8 нуклеотидов в минуту или 830 нуклеотидов в час при напряженности электрического поля 280 В/см. При этом точность анализа составила ± 1 нуклеотид в диапазоне длин до 450 нуклеотидов.

Для генетического анализатора разработано программное обеспечение, которое рассчитано на работу в среде Windows XP и выше и позволяет задавать и контролировать значения высокого напряжения, тока через капилляры, температуры кассеты, времени анализа, скорости приема данных, а также детектировать флуоресценцию из пяти световых каналов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

• 1.    Подтверждены технические характеристики макета генетического анализатора:

  – 5-цветная детекция красителей;

  – возможность анализа фрагментов ДНК со скоростью 830 нуклеотидов в час и точностью ± 1 нуклеотид в диапазоне длин до 450 нуклеотидов.

• 2.    Для макета генетического анализатора разработаны следующие материалы и наборы реагентов:

• –    гель для разделения фрагментов ДНК;

• –    спектральный калибратор для фрагментного анализа;

• –    спектральный калибратор для секвенирования ДНК;

• –    маркер молекулярного веса.

Генетический анализатор разрабатывается при выполнении ОКР "Разработка генетического анализатора для секвенирования и фрагментного анализа ДНК" на основании Государственного контракта № 16.522.12.2014 от 10 октября 2011 г. по заказу Министерства образования и науки РФ в рамках федеральной целевой программы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007–2013 годы" (шифр заявки "2011-2.2-522-014-001").