Генетический полиморфизм трех пород лошади домашней

Использование в животноводстве методов молекулярно-генетического анализа является тенденцией современной науки [Эрнст, Зиновьева, 2008], а в коневодстве уже внедряются технологии полного геномного анализа [Храброва, 2015]. Одной из разновидностей исследования генетического полиморфизма является амплификация межмикросателлитных фрагментов ДНК, находящихся между двумя инвертированными повторами генома [Zietkiewicz,

Rafalski, Labuda, 1994]. ISSR-PCR маркирование, по сравнению с другими методами, характеризуется высочайшей вариабельностью, наилучшей воспроизводимостью и результативно используется для оценки внутривидовой и межвидовой генетической вариабельности, проведения генетического мониторинга в породах с целью сохранения аллелофонда немногочисленных пород [Мухина, Дубинина, 2011; Гаври-личева и др., 2017; Денискова, Соловьева, Зиновьева, 2017]. Формирование программ селекции с учетом не только лишь родословной, фенотипических

характеристик, но и полилокусных генотипов, а еще значений генетического сходства имеет возможность способствовать ускорению и увеличению эффективности селекционной работы. Для учета генетического разнообразия пород проводят подготовительный подбор наиболее информативных ISSR-PCR маркеров [Глазко и др., 2013; Glazko et. al, 2016; Erkenov et al, 2017].

В Пермском крае разнообразие лошади домашней представлено 19 породами. В конных хозяйствах Пермского края чаще других используют лошадей тракененской породы, реже – орловских и русских рысаков, и ещё реже – лошадей тяжеловозных пород, а также местные улучшенные породы [Лядова, Пол-ковникова, 2013].

Целью данной работы является молекулярногенетический анализ и характеристика генофондов тракененской, рысистой и тяжеловозной пород лошади домашней, как наиболее часто представленных в Пермском крае.

Материал и методы исследования

Материал

Проведено молекулярно-генетическое изучение трех пород лошади домашней ( Equus сaballus L., Equidae): тракененская (n=41), тяжеловозная (n=20) и рысистая породы (n=21). Забор 82 проб крови у лошадей был проведен ветеринарным врачом с соблюдением всех санитарно-гигиенических норм на базе крестьянско-фермерского хозяйства Д.Н. Шашерина, расположенного в пос. Красный восход Пермского р-на Пермского края. Кровь помещалась в пробирки с антикоагулянтом ЭДТА (Этилендиаминтетрауксусная кислота), которые транспортировались в контейнере с хладоэлемен-тами [Методические рекомендации…, 2003]. Среди изученных преобладали лошади в возрасте от 6 до 15 лет (63.4% от общего числа). Лошади молодого возраста (от 2 до 5 лет) составили 9.8% от 82 лошадей; а старше 15 лет – 24.4%. Половой состав изученных лошадей следующий: 40.2% – жеребцы, 59.8% – кобылы. Избранные для исследования генотипов лошадей ISSR-PCR маркеры не сцеплены с полом.

Методы исследования

Для выделения ДНК из крови лошадей применен комплект реагентов Проба ГС («ДНК-технология», Россия). Тотальную ДНК для проведения ПЦР разводили до концентрации 10 нг/мкл в TE-буфере. Концентрацию и качество ДНК определяли с применением прибора Nanodrop ND-2000 («Thermо scientific», USA). Для характеристики генофондов пород лошадей был избран ISSR (Inter Simple Sequence Repeats)-метод определения полиморфизма ДНК [Zietkiewicz et al., 1994] с исполь- зованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Праймеры синтезированы в ЗАО «Синтол» (г. Москва). Эффективность праймеров определяли по результативности выявления полиморфизма ДНК [Календарь, Боронникова, 2007], рассчитанной в соответствии со шкалой 1–5: от невысокой (1) до высочайшей (5).

ПЦР проводили в термоциклере Gene Amp PCR System 9700 («Applied Biosystems», USA) по стандартной для ISSR-метода программе: предшествующая денатурация 94°C, 2 мин.; первые 5 циклов 94°С, 20 сек.; t° отжига, 10 сек.; 72°С, 10 сек.; в следующих 35 циклах: 94°С, 5 сек.; t отж., 5 сек.; 72°С, 5 сек. Завершающий цикл элонгации длился 2 мин. при 72ºС. Температура отжига в зависимости от G/С-состава праймеров увеличивалась от 56 до 64°С. Для проверки достоверности полученных ДНК-спектров опыт повторяли не менее трех раз. В качестве негативного (К-) контроля в реакционную смесь для проверки чистоты реактивов добавляли вместо ДНК 5 мкл деионизированной воды.

Продукты амплификации делили методом электрофореза в 1.7%-ном агарозном геле в 1х ТВЕ буфере. Гели окрашивали бромистым этидием и снимали в проходящем ультрафиолетовом свете в системе GelDoc XR («Bio-Rad», США). Определение длин фрагментов велось с поддержкой программы Quantity One в системе гель-документации Gel Doc XR («Bio-Rad», США) с использованием маркера молекулярной массы (100 bp +1.5 + 3 Кb DNA Ladder) («ООО-СибЭнзим-М», Москва).

Компьютерный анализ полученных данных проведен с использованием программы POPGENE 1.31 [Yeh, Young, Mao, 1999] и с поддержкой спец макроса GenAlEx6 [Peakall, Smouse, 2006] для MS-Excel с определением: доли полиморфных локусов ( P 95 ) [Williams et al., 1990], абсолютного числа аллелей ( n a ), эффективного числа аллелей ( n e ) [Kimura, Crow, 1964], ожидаемой гетерозиготности ( H E ) [Nei, 1987]. Описание специфики генофонда каждой породы проведены с применением коэффициента генетической оригинальности или же КГО [Потокина, Александрова, 2008], с учетом каждой особи [Боронникова, 2009]. Статистическая обработка данных проведена в программе STATISTICA 6.0.

Результаты и их обсуждение

С целью выявления эффективности протестировано 14 ISSR-праймеров, которые содержали последовательности ди- и тринуклеотидных микросателлит-ных мотивов с добавлением одного или двух якорных нуклеотидов на 3’-конце (табл. 1).

Каждый праймер был индивидуально проанализирован в ПЦР с тотальной ДНК исследуемых пород. Из 14 ISSR-праймеров были отобраны 5 наиболее эффективных для дальнейшего анализа.

Для E. сaballus эффективными являются в зависимости от числа нуклеотидов в коровом повторе три динуклеотидных праймера: (GA) 6 CC; (AG) 8 CA; (AG) 8 CG; два тринуклеотидных: (CTC) 6 C; (GAG) 6 C.

Таблица 1 Эффективность ISSR-праймеров для E. сaballus

Обозначение праймера	Нуклеотидная последовательность праймера (5'→3')	Эффективность праймера
M1	(AC) 8 CG	3
М2	(AC) 8 CC	2
ISSR-1	(AC) 8 T	1
ISSR-3	(TG) 8 AA	-
ISSR-4	(TG) 8 GC	2
ISSR-5	(AG) 8 CA	5
ISSR-6	(AG) 8 CG	5
ISSR-7	(CTC) 6 C	5
ISSR-8	(GAG) 6 C	5
ISSR-9	(ACG) 7 G	2
CR-212	(CT) 8 TG	1
CR-215	(CA) 6 GT	4
CR-216	(GA) 6 GG	1
CR-218	(GA) 6 CC	5

Примечание. Жирным шрифтом выделены праймеры с наибольшей эффективностью.

У трех изученных пород E. сaballus посредством ПЦР с пятью эффективными ISSR-праймерами выявлено 111 ISSR-PCR маркеров, из которых 106 являются полиморфными (P95 = 0.955). Число амплифи- цированных ISSR-PCR маркеров E. сaballus варьировало в зависимости от праймера от 14 (праймер ISSR-8) до 26 (праймер ISSR-5) а их размеры – от 140 (ISSR-6) до 1550 (ISSR-7) пн (табл. 2). Доля полиморфных локусов наибольшая у рысистой породы (P95 = 0.938), наименьшая – у тракененской породы (P95 = 0.821). Ожидаемая гетерозиготность (HE) на общую выборку E. сaballus составила 0.227 (табл. 3). Данный показатель наибольший в выборке лошадей рысистой породы (HE =0.228), а наименьший – у лошадей тракененской породы (HE =0.178).

Абсолютное число аллелей на локус ( n a ) на общую выборку составило 1.988 (табл. 3). Этот показатель наивысший у выборки лошадей тракенен-ской породы ( n a =1.757), в выборке лошадей тяжеловозных пород он наименьший ( n a =1.685).

Эффективное число аллелей на локус ( n e ) на общую выборку составило 1.365. Наибольшее значение эффективного числа аллелей выявлено у рысистых пород ( n e =1.382), а наименьшее – у траке-ненской породы ( n e =1.269).

Для характеристики генофондов важны редкие ISSR-PCR маркеры, встречающиеся с частотой менее 5%.

Наибольшее число редких маркеров отмечено у лошадей тракененской породы (R = 5). Всего лишь один редкий маркер отмечен у рысаков.

Таблица 2

Характеристика ISSR-PCR маркеров трех пород E. сaballus

ISSR-праймеры	Нуклеотидная последовательность (5'→ 3')	Длина фрагментов ДНК, пн	Число полиморфных ISSR-PCR маркеров (их частота)			Число ISSR-PCR маркеров
						учитываемых	полиморфных
			Tr	Tg	R
ISSR-5	(AG) 8 CA	230-1000	14 (0.737)	12 (0.800)	15 (0.938)	26	24 (0.923)
ISSR-6	(AG) 8 CG	140-1340	12 (0.667)	15 (0.938)	10 (0.909)	24	23 (0.958)
ISSR-7	(CTC) 6 C	280-1550	13 (0.929)	11 (1.000)	24 (0.960)	25	24 (0.960)
ISSR-8	(GAG) 6 C	240-1000	11 (0.917)	10 (0.833)	10 (0.909)	14	14 (1.000)
CR-218	(GA) 6 CC	300-1100	19 (0.905)	19 (0.864)	16 (0.941)	22	21 (0.955)
Всего ISSR-PCR маркеров			69 (0.821)	67 (0.882)	75 (0.938)	111	106 (0.955)

Примечание. Tr – тракененская порода, Tg – тяжеловозная порода, R – рысистая порода.

Таблица 3

Генетическое разнообразие трех пород E. caballus

Породы / показатели	Tr	Tg	R	На общую выборку
H E	0.178 (0.015)	0.211 (0.018)	0.228 (0.018)	0.227 (0.012)
n a	1.757 (0.165)	1.685 (0.153)	1.712 (0.162)	1.988 (0.160)
n e	1.269 (0.125)	1.347 (0.124)	1.382 (0.132)	1.365 (0.131)
R	5	4	1	10

Примечания: H E – ожидаемая гетерозиготность; n a – абсолютное число аллелей на локус; n e – эффективное число аллелей на локус; у всех вышеуказанных параметров в скобках даны стандартные отклонения; R – число редких аллелей; Tr – тракененская порода, Tg – тяжеловозная порода, R – рысистая порода.

Анализ КГО проведен как у каждой породы отдельно, так и у каждой из 82 лошадей. Чем выше этот показатель, тем больше специфических аллелей содержится в генотипе лошади. Значения КГО были прологарифмированы по основанию 2 и обозначены как КГОlog. Установлено, что КГОlog имеет нормальное распределение, так как критерий Шапиро-Уилка высок и равен у рысаков 0.927, у тяжеловозов – 0.891; у тракенов – 0.958.

На основании функции плотности распределения произведено разделение значений КГОlog на квантили [Нестерук, 2016]. Наименьшие значения этого показателя соответствовали типичным аллелям лошадей породы, а наибольшие – специфическим. У трех лошадей тракененской породы отмечены минимальные значения КГОlog (1.519 и ниже), то есть эти лошади являются носителями типичных для породы аллелей. У четырех лошадей этой породы определены максимальные значения, которые равны или выше 1.799, что свидетельствует о наличии в генотипе лошадей специфических для генофонда породы аллелей. Близкие по значению показатели получены и для изученных лошадей рысистых пород: у четырех лошадей выявлены минимальные значения КГОlog (1.572 и ниже), а у трех лошадей – максимальные (1.783 и выше). У изученных тяжеловозов всего две лошади пригодны для разведения как представители типичного генофонда породы, так как у них отмечены минимальные значения КГОlog (1.279 и ниже), только три лошади имеют в своем генотипе специфические аллели, так как значение КГОlog у них максимальное (1.600 и незначительно выше). Причем и минимальные, и максимальные значения КГОlog лошадей тяжеловозных пород ниже, чем у траке-ненской и рысистых пород.

Таким образом, выявлены лошади, которые являются носителями типичных и специфических аллелей в составе генофонда каждой из изученных пород. К тому же, лошадей с минимальными значениями КГО log у изученных пород выявлено меньше, чем с максимальными значениями этого показателя.

Полиморфизм ISSR-PCR маркеров ранее был использован для выявления генетической структуры и внутрипородной дифференциации карачаевской и алтайской пород лошадей [Эркенов, 2015], выполненных в Центре нанобиотехнологий РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева (г. Москва). Данные молекулярно-генетического анализа могут быть использованы для выявления «генофондного стандарта» исследованных пород лошадей, а также для разработки программ контроля динамики генофондов различных пород лошадей в меняющихся условиях искусственного и естественного отбора [Глазко и др., 2013].

На основании данных о генетическом полиморфизме трех пород E. сaballus , разводимых в Пермском крае, даны следующие рекомендации:

• 1.    C целью сохранения генофонда пород E. сaballus в практику племенной работы необходимо внедрять маркерную систему оценки родословных, включающую определение степени гетерозиготности, контроль передачи генетической информации из поколения в поколение, определение фактического генотипического сходства пробанда с выдающимися предками.

• 2.    Полученные данные о генетическом разнообразии трех пород могут в дальнейшем быть ис-

• пользованы для разработки индивидуального генетического паспорта каждой лошади.

• 3.    Редкие ISSR-PCR маркеры можно использовать при молекулярно-генетической идентификации пород.

• 4.    Представленные в работе данные о КГО log могут быть применены как в селекционноплеменной работе (при отборе-подборе пар для скрещивания, обмене животными между хозяйствами), так и при сохранении генофонда породы, в частности, для сохранения всего спектра редких (оригинальных) и типичных (базовых) аллелей.

Выводы

• 1.    Для молекулярно-генетического анализа лошадей тракененской породы, тяжеловозных и рысистых пород определены 5 эффективных ISSR-праймеров, из которых три динуклеотидных – (AG) 8 CA; (AG) 8 CG; (GA) 6 CC и два тринуклеотид-ных – (CTC) 6 C и (GAG) 6 C праймера.

• 2.    У изученных пород E. сaballus выявлено 111 ISSR-PCR маркеров, из которых 106 были полиморфными ( P 95 = 0.955).

• 3.    Наибольшие показатели генетического разнообразия отмечены у лошадей рысистых пород ( P 95 = 0.938; H E = 0.228; n e = 1.382).

• 3.    У изученных лошадей выявлено 10 редких ISSR-PCR маркеров, наибольшее их число отмечено у лошадей тракененской породы (R=5).

• 4.    У всех изученных особей E. сaballus установлены КГО l . Лошади с минимальными значениями КГО имеют в генотипе типичные для породы аллели и могут быть рекомендованы для разведения с целью сохранения базового для породы генофонда. Лошади же с максимальными КГО являются носителями специфических аллелей и могут быть использованы в скрещиваниях в селекционной работе с целью закрепления специфических особенностей пород.

• 5.    Установлены лошади, которые являются носителями типичных и специфических аллелей в составе генофонда каждой из изученных пород. Отмечено, что лошади с базовыми аллелями встречаются реже, чем со специфическими аллелями; поэтому их разведение необходимо для поддержания типичного генофонда изученных пород E. сaballus , в том числе и в Пермском крае.

Выражаем искреннюю благодарность сотрудникам крестьянско-фермерского хозяйства Д.Н. Шашерина за возможность проведения молекулярно-генетических исследований и забор крови лошадей.