Генетический полиморфизм возбудителя вирусной диареи (болезни слизистых оболочек) крупного рогатого скота на молочных комплексах Сибири

Вирусная диарея (болезнь слизистых оболочек) крупного рогатого скота (ВД-БС КРС) распространена во всем мире (1), в том числе в России: инфицированность скота в разных регионах достигает 65-100 % (2-6). Значение этой инфекции в условиях интенсификации молочного и мясного животноводства возрастает. Ее наиболее экономически значимые последствия — репродуктивные нарушения и болезни респираторного тракта, по- этому к инфицированию в большей степени чувствительны серонегативные телки случного возраста и телята до 6-месячного возраста (7-9). Стационарное неблагополучие хозяйств поддерживается из-за наличия персистентно инфицированных (ПИ) особей, которые становятся постоянным эндогенным источником возбудителя. Транзитно инфицированные (ТИ) животные, у которых болезнь протекает в острой форме, могут быть кратковременными источниками (1).

У КРС болезнь вызывают два генетически различающихся вида вируса — BVDV-1 и BVDV-2 (10), представленные цитопатогенным (ЦП) и нецитопатогенным (НЦП) биотипами (1, 11). Распространение видов и субтипов вируса имеет региональные особенности и зависит от характера ведения животноводства, плотности размещения, продуктивности, частоты ввода новых животных и других факторов (12). Первый вид вируса распространен во всем мире (1), но чаще обнаруживается в странах Европы. Наибольшее количество субтипов (до 21) выявлено у КРС в Италии (13) и Китае (14). BVDV-2 от КРС выделен в США (15), Канаде (16), Бразилии (17), Аргентине (18), Уругвае (19), Германии (20), Словакии (21), Италии (22), Южной Корее (23), Японии (24) и Монголии (25). Этот вид вируса, считающийся более вирулентным, подразделяется на шесть субтипов (2а-2f) (26) и преобладает в США и Канаде (до 50 % всех выделенных штаммов) (1). Для видовой дифференциации вируса используют метод нуклеотидного сиквенса геномной РНК с исследованием 5´-нетранслируемого региона (5´-UTR), подходящего для амплификации (28, 29). В России работы по филогенетическому анализу изолятов носят фрагментарный характер: установлено широкое распространение BVDV-1 среди КРС в Центральном регионе (30) и выявлены два антигенно различающихся штамма вируса (1m и 1а) в популяции лесных бизонов и домашнего скота (31).

Ранее мы определили основные половозрастные группы животных, наиболее подверженных риску инфицирования, которые могут использоваться как индикаторные и быть источником возбудителя в стаде (4).

В настоящей работе мы впервые провели филогенетический анализ двух типов вируса вирусной диареи (болезни слизистых оболочек), выделенных от животных иностранного и отечественного происхождения с различными клиническими проявлениями болезни, и установили преобладание BVDV-1b у ПИ и ТИ животных и циркуляции BVDV-2b и BVDV-2c на молочных комплексах Сибири.

Цель работы — изучение генетического полиморфизма возбудителей вирусной диареи (болезни слизистых оболочек) крупного рогатого скота, циркулирующих среди персистентно и транзитно инфицированных животных, в том числе импортируемых, на крупных молочных комплексах.

Методика. Исследования (2006-2017 годы) выполняли на семи молочных комплексах в Западной и Восточной Сибири (Тюменская, Новосибирская, Иркутская области, Красноярский край, Северный Казахстан) с поголовьем 800 и более дойных коров черно-пестрой породы (среднегодовая продуктивность 7000-10000 л и выше), где специфическую профилактику болезни не проводили или применяли инактивированные вакцины (4). Условия кормления и содержания соответствовали физиологическим и зоотехническим нормам.

Отбирали пробы биоматериала (кровь, сыворотка крови, выделения из носа, лимфоидные органы, легкие, вагинальные выделения) от клинически здоровых персистентно инфицированных животных, транзитно инфицированных животных с репродуктивными нарушениями и респираторным синдромом, а также абортированных плодов. Персистентную инфекцию диагностировали только при выявлении РНК вируса в парных пробах сыворотки крови, отобранных с интервалом в 30 сут. Всего изучили 479 проб биоматериала.

Для выделения вирусной РНК и обратной транскрипции использовали коммерческие наборы «РИБО-сорб» и «Реверта-L» («ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора», Россия).

РНК вируса в пробах биоматериала выявляли в полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с использованием универсальных пар праймеров: 324 (sense) — 5´-ATGCCC(T/A)TAGTAGGA-CTAGCA-3´, 326 (antisense) — 5´-TCAACTCCATGTGCCATGTAC-3´ (33), фланкирующих регион 5´-UTR с последующим филогенетическим анализом. Состав реакционной смеси (объем 30 мкл): 5 мкл кДНК; 1½Taq буфер без Mg2+ (ООО «Лаборатория Медиген», Россия), 0,4 мМ dNTP, 3,3 мМ MgCl2, 0,15 пкМ каждого праймера, 1,5 IU SmartTaq ДНК-полимеразы, вода (до 30 мкл). Режим амплификации: 5 мин при 95 °С (1 цикл); 20 с при 95 °С, 30 с при 54 °С, 40 с при 72 °С (45 циклов); 7 мин при 72 °С (1 цикл). Продукты ПЦР анализировали методом электрофореза в 2 % агарозном геле в Трис-боратном буфере (рН 8,0) по стандартной методике.

Последовательность нуклеотидов в вирусном геноме определяли с использованием набора BigDye 3.1 («Applied Biosystems», США) при секвенировании по обеим цепям ДНК. Полученные нуклеотидные последовательности анализировали при помощи пакетов программ BioEdit 7.0.0 и Lasergene 7.1.0 . Филогенетическую дендрограмму строили методом ближайшего соседа в программе MEGA 7.0 . Топологию ветвей дендрограммы подтверждали методом бутстреп анализа (1000 шагов репликации) (13, 34). Нуклеотидные последовательности синтезируемых фрагментов анализировали методами выравнивания с последовательностями других штаммов BVDV-1, BVDV-2, опубликованными в GenBank (ТСИШ), используя программу ClustalW (35).

Результаты. РНК вируса обнаружили в 20 (4,17 % от числа исследованных) пробах, в том числе в 10 из Тюменской области, 6 — из Новосибирской, 1 — из Иркутской, 2 — из Красноярского края, 1 — из Северного Казахстана (табл.). Среди ПИ и ТИ животных установили циркуляцию двух видов вируса. Филогенетический анализ выявил семь субтипов BVDV-1: 1а (5 %), 1b (35 %), 1c (5 %), 1d (10 %), 1f (20 %), 1i (5 %), 1p (5 %). Вирус второго типа обнаружили в 15 % проб, из них BVDV-2b — в 10 %, BVDV-2с — в 5 %. Преобладающим субтипом был BVDV-1b (рис., размещен на сайте журнала .

Распространение субтипов имело некоторые географические различия. BVDV-1а выявили только в Тюменской области во внутренних органах абортированного плода. BVDV-1b, кроме Тюменской, присутствовал в Новосибирской области и Красноярском крае. В Красноярском крае он был выделен от животных местной породы, в Новосибирской области — от нетели, завезенной из Германии, и у местного скота, а в Тюменской области — от животных, завезенных из Голландии, США, Словении и Дании. Источником вируса были ПИ животные.

BVDV-1с обнаружили в Тюменской области в пробе сыворотки крови теленка с респираторной патологией, рожденного нетелью из Голландии, BVDV-1d — в Тюменской области в хозяйстве, куда завезли скот из Франции, а также в Новосибирской области у телят местной породы с респираторной патологией. BVDV-1f выявили в Северном Казахстане в сыворотке крови теленка с респираторной патологией, рожденного нетелью, завезенной из Германии, в Иркутской области в сыворотки крови коровы местной породы, в Красноярском крае в сыворотке крови коровы 1240

Генетический полиморфизм возбудителей вирусной диареи (болезни слизистых оболочек) крупного рогатого скота, циркулирующих среди персистентно инфицированных животных на молочных комплексах Западной и Восточной Сибири

Название изолята Тип/субтип (5´-UTR) Регион Источник вируса Происхождение животных N09/16 1b Новосибирская область Сыворотка крови коровы Россия N08/17 1b Сыворотка крови нетели Германия T38/16 1b Тюменская область Сыворотка крови ПИ теленка США T11/16 1p Кровь теленка Германия Kz05/15 1f Северный Казахстан Сыворотка крови теленка Германия N09/15 1i Новосибирская область Сыворотка крови теленка Россия Ir03/17 1f Иркутская область Сыворотка крови коровы Россия T13/17 1f Тюменская область Сыворотка крови нетели Неизвестна K04/16 1f Красноярский край Сыворотка крови коровы Россия K14/16 1b Красноярский край Сыворотка крови коровы Россия T11/17 1c Тюменская область Сыворотка крови теленка Голландия T15/17 2c Внутренние органы абортированного США плода T18/17 1a Внутренние органы абортированного Австрия плода T01/16 1b Сыворотка крови теленка Словения T30/16 1b Мезентериальные лимфоузлы теленка Голландия T41/17 1b Внутренние органы ПИ нетели Дания T24/16 1d Лимфоидные органы теленка Франция N19/17 2b Новосибирская область Внутренние органы мертворожденного Россия теленка N12/16 2b Внутренние органы абортированного плода N11/17 1d Сыворотка крови теленка местной породы и в Тюменской области в сыворотке нетели неизвестного происхождения. BVDV-1i обнаружили в Новосибирской области в сыворотке крови теленка местной породы из неблагополучного по респираторным болезням хозяйства, BVDV1р — в Тюменской области в крови теленка с аналогичной патологией, полученного от нетели, завезенной из Германии. BVDV-2c выявили в Тюменской области во внутренних органах абортированного плода от нетели, завезенной из США, BVDV-2b — в Новосибирской области во внутренних органах мертворожденного теленка и абортированного плода местной породы

Известно, что пестивирусы благодаря строению своего генома обладают значительной мутационной активностью, которая выражается в постоянном увеличении генотипического и фенотипического многообразия штаммов, влияющего на вирулентность. Их роль в патологии животных до конца не изучена. Кроме того, полиморфизм вирусов затрудняет диагностику болезней и может снижать эффективность вакцинации (1, 12). Наиболее распространены BVDV-1a и BVDV-1b, их роль описана при различных формах болезни, и они, наряду с BVDV-2a, включены в состав коммерческих вакцин во всем мире (1). Сообщалось о выявления BVDV-1f в Словении (36) и Австрии (33) у ПИ животных с высокой частотой. Спорадически этот субтип вируса выявляли в Италии (37) и Турции (38), но данные о клинических синдромах, вызываемых им, не представлены.

В нашей стране нет данных о выявлении различных субтипов BVDV-2 и их связи с клиническими формами проявления болезни. Ранее нами было установлено наличие вируса второго типа у животных с различной патологией, однако субтипирование провести не удалось (32). В настоящей работе нами впервые в России установлена циркуляция вируса субтипов BVDV-2b и BVDV-2c.

Согласно данным литературы, BVDV-2a и BVDV-2b признаны основными этиологическими агентами патологии воспроизводства и системной инфекции и распространены в основном в странах Северной и Южной

■ 1g isolate A 5 ■-----1g 10/08

BVDV-1

1j isolate 2B

• 2e strain VS-260

1c strain Bega

11c strain Manasi

93 _r N12/16 37[1N19/17

991— 1k isolate SuwaCp

J ₇₁.2c OY89 ⁵⁸__|12cKZ-91-CP

7511p isolate 4998/89

[- 1p isolate BJ0702 9911p isolate BJ0703

BVDV-2

BVDV-3

I 3 strain 315 "ggjj 3 strain Italy-129/07 76*3 strain D32/00 HoBi

Филогенетическая дендрограмма, построенная на основе анализа последовательно сти участка 5´-нетранслируемой области (5´-UTR) генома у возбудителей вирусной диареи (болезни слизистых оболочек) крупного рогатого скота BVDV-1 и BVDV-2, выявленных в хозяйствах Сибири (20062017 годы) . Выравнивание последовательностей методом ClustalW. Топология дерева восстановлена методом NeighborJoining. Матрица генетических расстояний рассчитана с применением метода минимальной эволюции. Внешняя группа — последовательности вируса BVDV-3. Около каждого узла дендрограммы указана бутстреп-поддержка. Исследованные изоляты выделены подчеркиванием. Для референтных штаммов указано название и номер в базе данных GenBank (NCBI).

Америки (1, 15, 16). Мы выявляли BVDV-2b во внутренних органах абортированного плода и мертворожденного теленка местной породы в Новосибирской области. BVDV-2c — редкий субтип вируса, обнаруженный в 2013-2014 годах в Германии (Северная Рейн-Вестфалия и Нижняя Саксония) при массовой вспышке ВД-БС у серонегативных животных. Он вызывал снижение молочной продуктивности у коров, лихорадку, респираторное заболевание и геморрагический энтерит у телят, нетелей и коров (40, 41). В 2016 году установлена его циркуляция среди мелких жвачных животных в Южной Италии (42).

Мы проводили исследование в хозяйствах, где осуществлялся ввоз новых животных из разных источников, в том числе из-за рубежа. Наши результаты показали, что разнообразие видов и субтипов вируса достаточно велико. В предыдущей работе среди местного и завозного скота при острых вспышках болезни ВД-БС КРС мы выявили циркуляцию 6 субтипов BVDV-1 (a, b, c, g, p, k) и BVDV-2 без дифференциации на субтипы (32). В настоящем исследовании подтверждена циркуляция и преобла- дание BVDV-1b у ПИ и ТИ животных. Кроме того, обнаружены три новых субтипа вируса первого типа (BVDV-1d, BVDV-1f и BVDV-1i), а также циркуляция новых субтипов BVDV-2b и BVDV-2с, ранее не выявленных в России. Нужно осторожно относиться к факту обнаружения их на территории нашей страны, учитывать потенциальную патогенность и отсутствие в составе коммерческих вакцин.

Поскольку в России меняется стратегия ведения животноводства и возрастает количество молочных мега-ферм, на которые из многих источников поступают животные с разным инфекционным статусом, изучение генетического полиморфизма вируса становится все более актуальным. Сопоставление данных о происхождении животных с результатами филогенетических исследований может помочь в определении источников, путей заноса возбудителей в тот или иной регион, а также в выявлении, отслеживании новых и высоковирулентных штаммов вирусов. Это особенно важно при вакцинации животных, когда генетические профили вакцинных штаммов и вирусов, циркулирующих на конкретной территории, не совпадают (29). В настоящее время в России применяются в основном инактивированные и живые вакцины на основе штаммы субтипов 1а, 1b и 2а (1, 12). В некоторых случаях генетический профиль вакцинных штаммов может не полностью соответствовать генетическому спектру пе-стивирусов, циркулирующих в конкретной стране или регионе. Выявленное нами генетическое многообразие вирусов вирусной диареи способно снижать эффективность специфической профилактики болезни. Кроме этого, для формирования стационарного неблагополучия по ВД-БС КРС и непрерывного эпизоотического процесса важное значение имеет замкнутый цикл мать—теленок. Это приводит к рождению персистентно инфицированного потомства, которое становится постоянным эндогенным источником вируса в стаде, что снижает эффективность специфической профилактики. Поэтому вакцинация будет более эффективной при условии полного удаления ПИ животных из стада (1, 4).

Таким образом, на молочных комплексах Сибири среди персистентно и транзитно инфицированных животных циркулируют возбудители вирусной диареи (болезни слизистых оболочек) крупного рогатого скота двух видов. Филогенетический анализ выявил семь субтипов BVDV-1 — 1а (5 %), 1b (35 %), 1c (5 %), 1d (10 %), 1f (20 %), 1i (5 %), 1p (5 %) и два субтипа BVDV-2 — 2b (10 %) и 2с (5 %). Преобладающим субтипом был BVDV-1b. Впервые на территории России установлена циркуляция BVDV-2b и BVDV-2c среди животных иностранного и отечественного происхождения, а также выявлена взаимосвязь между принадлежностью вирусов к субтипу и клиническими синдромами, вызываемыми ими: BVDV-1а — патология воспроизводства, 1b — персистентно инфицированные животные, 1с, 1d, 1i, 1p — респираторная патология, 1f — ПИ животные и респираторная патология, BVDV-2b и 2с — патологии воспроизводства и системная инфекция животных. Полученные нами данные могут быть полезны при изучении молекулярной эпизоотологии вирусов, разработке более точных диагностических тестов, охватывающих разнообразные генетические варианты, создании вакцин, а также для повышения эффективности программ контроля инфекции.