Генетический полиморфизм забрюшинных миксоидных липосарком

Саркомы мягких тканей относятся к редким опухолям, развивающимся из разных типов соединительной ткани. Ежегодно в России регистрируется около 3,5 тысяч новых случаев, что составляет менее 1 % от всех онкологических заболеваний [1]. В 10–15 % случаев саркомы мягких тканей расположены ретроперитонеально [2, 3]. Липосаркома является наиболее часто встречаемой забрюшинной мезенхимальной опухолью, на долю которой приходится более 50 % случаев от общего числа сарком [4].

Отдельным гистологическим типом представлены миксоидные липосаркомы, которые составляют 30–35 % от всех липосарком [5–7]. В 95 % случаев при этом гистологическом типе присутствует реципрокная транслокация хромосом 12 и 16 t(12;16)(q13;p11), выявление которой помогает дифференцировать данную опухоль от других гистологических типов липосарком [6–8]. Основным методом лечения забрюшинных неорганных липо-сарком является хирургический. У большинства пациентов после радикально выполненной операции возникают рецидивы, являющиеся причиной смерти [9–14]. При лечении распространенной или метастатической формы заболевания применяют антрациклины (доксорубицин и эпирубицин) и алкилирующий агент ифосфамид [14]. Несмотря на то, что по сравнению с другими гистотипами липосарком для миксоидных характерна высокая частота ответа на проводимую химиотерапию (48 % против 18 %, p=0,012) [15], отдаленные результаты лечения данной категории пациентов неудовлетворительны.

В настоящее время отсутствуют убедительные данные об эффективности таргетной терапии в лечении липосарком. Недавние исследования показали наличие определенных генетических перестроек в липосаркомах, одни из которых влияют на прогноз, общую и безрецидивную выживаемость, а роль других не определена. По мере накопления данных выявленные изменения, предположительно, могут стать предикторами прогноза и новыми терапевтическими целями. В исследовании, проведенном в Китае, показаны мутации в гене PIK3CA при миксоидных липосаркомах, частота встречаемости которых составляет 11 % [16]. Аналогичная работа из США по генотипированию образцов миксоидных липосарком продемонстрировала мутации в генах сMET и PIK3CA [18]. Следующее исследование, проведенное в США, экспонирует не только наличие мутаций в гене PIK3СА в 18,3 % случаев миксоидных/круглоклеточных липосарком, но и значимую корреляцию с плохим прогнозом – у больных с PIK3-ассоциированными липосаркомами отмечены более низкие показатели общей выживаемости, чем у пациентов с диким типом гена PIK3CA в опухоли (р=0,036) [19]. База данных COSMIC (catalog of somatic mutations in cancer) демонстрирует молекулярно-генетическую гетерогенность миксоидных липосарком: мутации в генах Tp53 (7 %), сKIT (3 %), EGFR (2 %), KRAS (2 %) и др., клиническая значимость которых не оценена при забрюшинных неорганных липосаркомах.

С целью поиска новых молекулярно-генетических маркеров и терапевтических решений мы выполнили пилотное исследование с использованием высокопроизводительного секвенирования (NGS) образцов опухолевой ткани миксоидных липосарком. В работе представлены полученные результаты проведенного исследования и обзор мировой литературы по выявленным маркерам.

Материал и методы

В исследование были включены пациенты с забрюшинными неорганными миксоидными липо-саркомами, которым выполнялось хирургическое лечение в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России в 2011, 2012, 2015 и 2016 гг. После пересмотра морфологических образцов сертифицированным патоморфологом и подтверждения гистологического типа липосар-комы выделены зоны, содержащие наибольшее количество опухолевых клеток (не менее 40 %).

Следующим этапом с использованием микродиссектора был сделан срез толщиной 10 микрон с каждого образца опухолевой ткани, фиксированной в формалине и заключенной в парафин (FFPE). Из данного среза выделили ДНК с помощью набора «GeneRead DNA FFPE Kit (50)» (Qiagen) согласно инструкции.

Молекулярно-генетическое исследование проводилось методом высокопроизводительного секвенирования (NGS) с использованием коммерческой панели для целевого обогащения генов GeneReader Actionable Insights Tumor Panel (GRTP – 101X) на платформе QCI Analyser version 1.1 (Qiagen), позволяющей анализировать 12 генов, вовлеченных в канцерогенез: KRAS, NRAS, KIT, BRAF, PDGFRA, ALK, EGFR, ERBB2, PIK3CA, ERBB3, ESR1, RAF1. Дизайн используемой панели позволяет эффективно выявлять клинически значимые мутации и полиморфные варианты с глубиной покрытия 5 000 для каждого ампликона.

Технологические этапы секвенирования включали: выделение образцов ДНК, таргетное обогаще- ние, клональную амплификацию, секвенирование, интерпретацию результатов. Библиотеки образцов ДНК нормализовали по концентрации с последующим пулированием. В результате секвенирования были получены прочтения с качеством выше Q25 для более чем 70 % исследованной ДНК. Программное обеспечение автоматически производило фильтрацию полученных фрагментов по качеству, тримминг адаптеров и картирование полученных фрагментов на референсный геном hg19.

Поиск информационных источников произведен в системах NCBI, включая PubMed, SNP database, ClinVar, Ensemble, COSMIC cancer database. Проанализированы данные ретроспективных и проспективных клинических исследований.

Результаты

В работе исследован послеоперационный материал (парафиновые блоки и гистологические стекла) 4 пациентов, оперированных по поводу забрюшинных миксоидных липосарком в 2011–16 г. Выполнено таргетное секвенирование с целью молекулярного профилирования. Нами впервые выявлены ранее не описанные в мировой литературе при миксоидных липосаркомах мутации и полиморфные варианты в генах EGFR, PIK3CA, ALK, BRAF,ERBB2/3, ESR1, KIT, PDGFRA (рис. 2). Также для каждого образца сформирован валидный результат (рис. 1).

Рис. 1. Результат молекулярно-генетического тестирования методом высокопроизводительного секвенирования (NGS) опухолевой ткани пациента с забрюшинной миксоидной липосаркомой

Fig. 1. The result of molecular genetic testing by next-generation sequencing (NGS) of a tumor tissue of a patient with retroperitoneal myxoid liposarcoma

Ген	Вид мутации	Экзон	Номенклатура				MAF minor allele frequency	Highest population MAF	Частота всречаемости n=4
ERBB2(HER2)	миссенс	17	P.I655V	C.1963A>G	rs!136201	NM_004448.3:c.l963A>G (p.lle655Val)	0.12 (G)	0.32	1/4 (25%)
	миссенс	27	Р.Р1170А	C.3508OG	rs!058808	NM_004448.3:c.3508C>G (p.Pro!17OAIa)	0.45 (G)	0.48	3/4 (75%)
PIK3CA	N/A	1	N/A	С.-77+8483ОТ	N/A	N/A	N/A	N/A	1/4 (25%)
	миссенс	7	р.1391М	c.H73A>G	rs2230461	NM_006218.3(PIK3CA):c.ll73A>G(p.lle391Met)	0.09 (G)	0.29	1/4 (25%)
ALK	N/A	29	Р.Т1446Т	C.4338OG	N/A	N/A	N/A	N/A	1/4 (25%)
	миссенс	29	P.K1491R	c.4472A>G	rs1881420	NM_004304.4(ALK):c.4472A>G (p.Lysl491Arg)	0.42 (C)	0.49	2/4(50%)
	синонимичный вариант	15	P.G845G	с.2535Т>С	rs2256740	N M_004304.4(ALK):c.2535T>C (p.Gly845=)	N/A	0.49	3/4 (75%)
	синонимичный вариант	18	Р.Т1012Т	c.3036G>A	rs2293563	NM_004304.4(ALK):c.3036G>A (p.Thr!012=)	0.17 (T)	0.29	1/4 (25%)
BRAF	синонимичный вариант	16	P.G643G	c.!929A>G	rs9648696	NM_004333.5(BRAF):c.l929A>G (p.Gly643=)	0.35 (C)	0.39	3/4 (75%)
EGFR	синонимичный вариант	4	P.N158N	C.474OT	rs2072454	N M_005228.4(EGFR):c.474C>T (p.Asnl58=)	0.48 (T)	0.50	3/4 (75%)
	миссенс	13	P.R521K	C.1562G>A	rs!1543848, rs2227983	NM_005228.4(EGFR):c.l562G>A(p.Arg521Lys)	0.29 (A)	0.50	3/4 (75%)
	синонимичный вариант	20	P.Q787Q	c.2361G>A	rsl0251977, rsl050171	NM_005228.4(EGFR):c.2361G>A(p.Gln787=)	0.43 (A)	0.50	4/4(100%)
	N/A	16	Р.Н656Н	C.1968OA	N/A	N/A	N/A	N/A	1/4 (25%)
	N/A	18	N/A	c.2184+19G>A	N/A	N/A	N/A	N/A	1/4 (25%)
	синонимичный вариант	25	р.09940	C.2982OT	rs2293347	N M_005228.4(EGFR):c.29820>T (p.Asp994=)	0.14 (T)	0.32	1/4 (25%)
ESRI	N/A	8	N/A	c.!369+13777T>G	N/A	N/A	N/A	N/A	1/4 (25%)
	N/A	3	p.SlOS	c.30T>C	N/A	N/A	N/A	N/A	3/4 (75%)
PDGFRA	синонимичный вариант	12	Р.Р567Р	C.17O1A>G	rsl873778	NM_006206.5(PDGFRA):c.l701A>G (p.Pro567=)	0.04 (A)	0.19	4/4(100%)
ERBB3	N/A	12	р.14491	c.l347T>C	N/A	N/A	N/A	N/A	1/4 (25%)
	миссенс	27	P.S1119C	c.3355A>T	N/A	N/A	N/A	N/A	1/4 (25%)
KIT	N/A	17	N/A	c.2362-77G>A	N/A	N/A	N/A	N/A	1/4 (25%)

Рис. 2. Результаты молекулярно-генетического тестирования методом высокопроизводительного секвенирования (NGS) опухолевой ткани пациентов с забрюшинными миксоидными липосаркомами

Fig.2. The results of molecular genetic testing by next-generation sequencing (NGS) of tumor tissue of patients with retroperitoneal myxoid liposarcoma

Обсуждение

Таргетное секвенирование забрюшинных неорганных миксоидных липосарком продемонстрировало генетическую гетерогенность. Синонимичные мутации в генах EGFR (Q787Q) и PDGFRA (P567P) выявлены во всех четырех случаях, другие молекулярно-генетические изменения определены с меньшей частотой. Полученные данные о полиморфизме каждого гена проанализированы с учетом опыта зарубежных исследователей, представленного в научных базах данных.

Ген EGFR (ENSG00000146648)

У пациентов с миксоидными липосаркомами в структуре гена EGFR мы выявили мутации в 4, 13, 16, 18, 20 и 25 экзонах. EGFR – ген, кодирующий трансмембранный гликопротеин молекулярной массой 170 kD, обладающий тирозинкиназной активностью. EGFR (или HER1) относится к семейству рецепторов эпидермального фактора роста. Данное семейство включает эпидермальный фактор роста (EGFR или ERBB1), ERBB-2, ERBB-3 и ERBB-4. EGFR экспрессируется на поверхности как нормальных, так и трансформированных эпителиальных клеток и участвует в регуляции клеточного роста и дифференцировки. В ряде опухолей обнаруживаются аномальные рецепторы эпидермального фактора роста, что обусловлено наличием мутации в соответствующем гене. В клетках с мутацией происходит активация сигнального пути EGFR, что, в свою очередь, инициирует процессы злокачественной трансформации в большинстве опухолей. Сигнальные пути контролируют процессы пролиферации, дифференцировки, апоптоза, ангиогенеза, инвазии и метастазирования [19].

В нашем исследовании в забрюшинных миксоидных липосаркомах мы выявили синонимичную мутацию Q787Q (rs10251977, rs1050171) в 20 экзоне гена EGFR в 100 % случаев. В базе данных Национального центра биотехнологической информации США (NCBI) представлены исследовательские работы, демонстрирующие влияние rs1050171 на клиническое течение заболевания при другой нозологии. Ученые анонсировали клиническую значимость полиморфизма Q787Q в гене EGFR как фактора прогноза при плоскоклеточном раке легкого. При частоте выявляемости, равной 23,9 %, отмечено значимое отрицательное влияние на общую выживаемость. Группа пациентов с наличием полиморфизма Q787Q гена EGFR имела меньшую продолжительность жизни не только по сравнению с пациентами, имеющими дикий тип гена EGFR, но и с пациентами – носителями мутаций в экзонах 18, 19, 21 гена EGFR [21].

Следующая работа демонстрирует прогностическую и предиктивную роль EGFR(Q787Q) полиморфизма при терапии тиразинкиназным ингибитором (Gefitinib) у пациентов с немелкоклеточным раком легкого после хирургического лечения. Пациенты с диким типом гена EGFR(GG) имели лучший прогноз, чем больные – носители аллелей GA или AA (p=0,0653) [22].

В нашем исследовании в забрюшинных миксоидных липосаркомах в 25 % случаев выявлен синонимичный вариант мутации D994D (rs2293347) в 25 экзоне гена EGFR. Работа коллег из Китая свидетельствует о предиктивной роли полиморфизма D994D в гене EGFR при терапии тиразин-киназным ингибитором (Gefitinib) у пациентов с немелкоклеточным раком легкого. Пациенты c аллелью rs2293347A имели значительно более низкую частоту ответа на терапию тиразинкиназным ингибитором, чем пациенты с аллелями s2293347G (37,5 % против 71,2 %, p=0,004) [23].

В 75 % случаев нами выявлена миссенс-мутация R521K (rs11543848, rs2227983) в 13 экзоне гена EGFR. По данным литературы, полиморфизм R521K в гене EGFR может рассматриваться как предиктор ответа на терапию тирозинкиназным ингибитором (Cetuximab) и фактор благоприятного прогноза при колоректальном раке. Пациенты с генотипами G/A или A/A гена EGFR имеют значительно более высокую частоту ответа на лечение – 78,9 % против 55,6 % (p=0,01), более длительный период без прогрессирования – 16 мес против 8 мес (p<0,01) и общую выживаемость – 24 мес против 16 мес (р<0,01) [24].

Ген ERBB2 (ENSG00000141736)

При таргетном секвенировании забрюшинных неорганных миксоидных липосарком мы выявили мутации в 17 и 27 экзонах гена ERBB2, который входит в состав семейства тирозинкиназных рецепторов ERBB, состоящего из четырех функционально взаимосвязанных рецепторных молекул, которые играют важную роль в клеточной пролиферации, дифференцировке и апоптозе. Под действием лигандов ERBB2 образует гетеродимеры с другими рецепторами данного семейства, приобретая мощный потенцирующий эффект на работу соответствующих сигнальных каскадов. Влияние ERBB2 может резко усиливаться при гиперэкспрессии гена. Суперэкспрессия ERBB2 повышает туморогенность клеток в культуре вследствие спонтанного фосфорилирования гетеродимеров, образуемых рецепторами, и включения соответствующих сигнальных каскадов, таких как МАРК и PI3K. При мутации в гене происходит активация сигнальных путей, инициирующих процессы злокачественной трансформации [29].

В 25 % случаев у пациентов с забрюшинными миксоидными липосаркомами нами выявлена миссенс-мутация I655V (rs1136201) в 17 экзоне гена ERBB2. Анализируя значимость данной мутации, найдены многочисленные работы, в том числе метаанализы, демонстрирующие связь полиморфизма I655V гена ERBB2 с высоким риском развития рака молочной железы [30–34]. Также в 75 % случаев мы выявили миссенс-мутацию P1170A (rs1058808) в 27 экзоне гена ЕRBB2 у пациентов с забрюшинными миксоидными липосаркомами. Представленная в NCBI исследовательская работа оценивает полиморфизм P1170A гена ERBB2 как фактор высокого риска развития рака легкого у населения Кореи [35]. Особый интерес представляет сочетание полиморфизмов rs1058808 и rs1136201 в опухоли. Авторы из Китая в своей работе экспонируют связь миссенс-мутаций I655V и P1170A в гене ERBB2 с высоким риском развития остеосаркомы [36].

Ген ALK (ENSG00000171094)

При молекулярно-генетическом тестировании опухолевой ткани забрюшинных миксоидных липосарком методом высокопроизводительного секвенирования (NGS) мы выявили мутации в гене ALK: в 75 % случаев аберрации представлены синонимичной мутацией G845G(rs2256740) в 15 экзоне гена ALK, в 50 % случаев миссенс-мутацией K1491R(rs1881420) в 29 экзоне. Синонимичный вариант T1012T(rs2293563) в 18 экзоне гена ALK нами выявлен в 25 % случаев. Также у одного из четырех пациентов определен полиморфный вариант T1446T в 29 экзоне.

Ген ALK кодирует рецепторную тирозинкиназу (Anaplastic Lymphoma Kinase; киназа анапластической лимфомы). ALK может приобретать онкогенные свойства вследствие транслокации. Если в норме ферментативная активность ALK контролируется участками белка, расположенными в начале его аминокислотной последовательности, то в случае перестройки каталитический домен ALK оказывается прикреплённым к совершенно другой молекуле (чаще всего – к фрагменту белка EML4). В результате этого ALK теряет способность подчиняться физиологической регуляции и начинает непрерывно посылать пролиферативные сигналы [36]. Мутации в гене ALK являются целями для терапии тиразинкиназными ингибиторами, такими как Crizotinib, Ceritinib, Alectinib, Brigatinib, Lorlatinib.

Ген BRAF (ENSG00000157764)

Синонимичная мутация G643G (rs9648696) в гене BRAF при забрюшинных миксоидных липо-саркомах нами выявлена в 75 % случаев. BRAF – ген, кодирующий белок B-Raf (серин/треонин-протеинкиназа) [38]. Белок B-Raf участвует в передаче внутриклеточных сигналов управления ростом клеток. В клетках с мутацией происходит активация сигнального пути и инициация процессов злокачественной трансформации [39]. Мутации в гене BRAF являются предметом для рассмотрения вопроса о включении в терапию ингибиторов тиразинкиназы (Dabrafenib, Trametinib).

Ген PDGFRA (ENSG00000134853)

Во всех 4 случаях (100 %) у пациентов с забрюшинными миксоидными липосаркомами нами выявлена синонимичная мутация Р567Р (rs1873778) в 12 экзоне гена PDGFRA, который кодирует тирозинкиназный рецептор фактора роста тромбоцитов, являющегося митогенным для клеток мезенхимального происхождения. Исследования показывают, что ген PDGFRA играет