Генетическое разнообразие и симбиотическая эффективность клубеньковых микросимбионтов остролодочника таймырского (Oxytropis taimyrensis (Jurtz.) A. et D. Love), астрагала холодного (Astragalus frigidus (L.) A.Gray) и астрагала Тугаринова (Astragalus tugarinovii Basil.) из Арктической Якутии

В последнее время развитию сельского хозяйства в Арктической зоне Российской Федерации уделяется все более пристальное внимание (1, 2). Устойчивое развитие животноводства и кормопроизводства на базе местных биологических ресурсов, адаптированных к сложным почвенно-климатическим условиям Арктики, позволит создать новые рабочие места и обеспечит местное население качественными и свежими продуктами питания, что будет способствовать повышению привлекательности северных территорий России (3). Так, И.С. Хантимер (4) показал возможность создания высокопродуктивных многолетних сенокосных лугов в Большеземельской тундре с целью обеспечения кормовой базой животноводческого хозяйства, расположенного в окрестностях г. Воркуты.

Ключевым высокобелковым компонентом природных сенокосов и пастбищ служат бобовые растения, которые широко распространены от Арктики до антарктических островов (5). Например, кормовое растение клевер ползучий (Trifolium repens L.) — одно из наиболее продуктивных пастбищных растений, значительно улучшающих плодородие и структуру почвы. Специально для выращивания в холодных регионах селекционерами выводятся холодостойкие сорта этого вида (6). Люцерна посевная Medicago sativa L. характеризуется высокой экологической пластичностью, устойчивостью к неблагоприятным условиям и относительно высокой зимостойкостью. Используется в травосмесях с многолетними злаковыми травами для создания культурных пастбищ и восстановления деградированных почв (7). Растения родов Остролодочник (Оxytropis DC.) и Астрагал (Astragalus L.) широко распространены в умеренных и арктических зонах Северного полушария, где служат кормом для диких и сельскохозяйственных животных и птиц (8, 9). Так, в тундровой зоне Восточной Сибири встречаются остролодочник таймырский (Oxytropis taimyrensis (Jurtz.) A. et D. Love) и астрагал Тугаринова (Astragalus tugarinovii Basil.), которые растут в основном на остепненных склонах, осыпях и в сухих редкостойных лиственничных лесах (10, 11). Вид O. adamsiana (Trautv.) Jurtzev распространен на Таймыре и в Северной Якутии, растет в тундре, редколесьях и в высокогорьях, где служит одним из важных компонентов пищевого рациона травоядных животных (8, 10-12). Вид A. frigidus (L.) A.Gray — широко распространенное за полярным кругом холодоустойчивое растение с высоким содержанием белка, рекомендованное к использованию в качестве кормовой и лекарственной культуры. На пастбищах хорошо поедается сельскохозяйственными животными и северными оленями (8). Показано, что включение бобовых растений в состав травосмесей пастбищных и сенокосных угодий способствует решению проблемы дефицита кормового белка и обеспечивает экономное расходование ресурсов в кормопроизводстве и земледелии на Европейском Севере России (13-15).

Ключевым фактором для продуктивного возделывания бобовых культур служат их микросимбионты, которые могут участвовать в питании растений-хозяев, защите от патогенов и фитофагов, а также в регуляции развития и адаптации к условиям, вызывающим стресс. Один из основных лимитирующих факторов распространения и продуктивности растений на Крайнем Севере — недостаточная обеспеченность почвы легко доступными для растений соединениями азота (16).

Симбиотические клубеньковые бактерии (ризобии), фиксируя атмосферный азот, обеспечивают стабильное снабжение растений этим важнейшим биогенным элементом. Многие бобовые вступают в симбиоз только с определенными видами микроорганизмов. Основными микросимбионтами растений рода Клевер ( Trifolium , триба Trifolieae Endl.) служат штаммы вида Rhizobium leguminosarum bv. trifolii (17) . Однако из корневых клубеньков различных видов Trifolium выделяют также и не типичные для этого рода бактерии, родственные видам Rhizobium и Agrobacterium (18, 19). Бобовые растения рода Люцерна ( Medicago L . ) входят в группу перекрестной инокуляции с представителями родов Донник ( Melilotus (L.) Mill.) и Пажитник ( Trigonella L.) , формирующие азотфиксирующий симбиоз со штаммами Ensifer meliloti (ранее Sinorhizobium meliloti ), однако в их клубеньках могут присутствовать и представители других родов, например Agrobacterium (20). Показано, что микросимбионты растений Astragalus могут принадлежать родам Rhizobium , Sinorhizobium , Bradyrhizobium , Mesorhizobium и Bosea (21-24). Для растений Oxytropis типичными микросимбионтами считаются представители рода Mesorhizobium , но встречаются и Rhizobium , Sinorhizobium , Bradyrhizobium , Bosea и Tardiphaga (21, 22, 25).

Бобово-ризобиальные отношения характеризуются сложной многокомпонентной структурой. Их экологическая и практическая роль обусловлена тем, что формирование взаимовыгодного растительно-микробного симбиоза оказывает влияние на качество урожая и свойства почвы в любой климатической зоне. Поэтому изучение биоразнообразия арктических ри-зобий имеет важное значение для развития сельского хозяйства в условиях Крайнего Севера.

В настоящей работе впервые описаны 13 штаммов порядка Hyphomi-crobiales (ранее Rhizobiales ), изолированных из клубеньков Oxytropis taimyrensis , Astragalus frigidus и A. tugarinovii , произрастающих в Арктической Якутии. Изучена способность девяти ризобиальных штаммов Rhizobium sp. 7/1-1, 191/1, 20-1/1 и 33-1/1, R. giardinii 20/1-1, M. norvegicum 20/1-4 и Mesorhizobium sp. 9-4/1, 25-2/1 и 32-2/1 нодулировать дикорастущие арктические бобовые Oxytropis adamsiana и Astragalus frigidus и кормовые бобовые Trifolium repens и Medicago sativa в условиях микровегетационного опыта.

Целью работы было выделение и изучение генетического разнообразия штаммов порядка Hyphomicrobiales , изолированных из клубеньков дикорастущих бобовых Oxytropis taimyrensis (Jurtz.) A. et D. Love, Astragalus frigi-dus (L.) A.Gray и Astragalus tugarinovii Basil., собранных в Арктической зоне Якутии, а также выявление способности ризобиальных штаммов формировать азотфиксирующие клубеньки на корнях кормовых и дикорастущих бобовых растений Trifolium repens L., Medicago sativa L., Oxytropis adamsiana (Trautv.) Jurtzev и Astragalus frigidus (L.) A. Gray в условиях микровегетаци-онного эксперимента по кросс-нодуляции.

Методика. В ходе российско-немецкой экспедиции в дельту р. Лена в 2021 году в окрестностях оз. Севастьян-Кюеле (71°31 ‘ 37.3 ’’ N 128°49 ‘ 20.1 ’’ E)

и на о. Тит-Ары (71°57 ‘ 32.7 ’’ N 127°05 ‘ 53.3 ’’ E) были собраны корневые клубеньки и семена дикорастущих популяций бобовых растений O. taimyrensis , A. frigidus и A. tugarinovii .

Штаммы микроорганизмов выделяли по стандартной методике с использованием маннито-дрожжевой питательной среды YMA (Novikova and Safronova, 1992) после стерилизации клубеньков в течение 1 мин в 96 % этаноле. Чистые культуры изолятов (после последовательного двойного клонирования) были помещены на длительное хранение на станцию низкотемпературного автоматизированного хранения биологических образцов при -80 °С («Liconic Instruments», Лихтенштейн). Информация о штаммах представлена в Интернет-базе данных Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства .

Геномную ДНК из чистых культур выделяли с помощью наборов DNeasy Blood&Tissue kit («QIAGEN N.V.», Германия) и Monarch® («New England Biolabs», США). Первичная идентификация штаммов была проведена методом ПЦР с последующим секвенированием последовательностей фрагмента маркерного гена 16S рРНК (900-1400 п.н.). Для амплификации использовали пару праймеров fD1 5´-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3´ и rD1 5´-AAGGAGGTGATCCAGCC-3´ (26). Условия ПЦР были следующими: 3 мин 30 с при 95 °С (первичная денатурация); 1 мин 10 с при 94 °С (денатурация), 40 с при 56 °С (отжиг праймеров), 2 мин 10 с при 72 °С (элонгация) (35 циклов); 6 мин 10 с при 72 °С (финальная элонгация). Состав реакционной смеси для ПЦР: 38 мкл milli-Q H 2 O («Евроген», Россия), 5 мкл буфера (ООО «Компания Хеликон», Россия), 5 мкл набора dNTP (ЗАО «Евроген», Россия), по 0,5 мкл праймеров (ЗАО «Евроген», Россия), 0,5 мкл Taq-полимеразы (ООО «Компания Хеликон», Россия) и 1 мкл (50100 нг) мДНК. Амплификацию проводили на приборе T100 Thermal Cycler («Bio-Rad», США). Количество ДНК оценивали визуально с помощью электрофореза в 1,0 % агарозном геле в 0,5½ TАE-буфере с использованием маркера молекулярной массы MassRuler («Fermentas», Литва). Очистку ПЦР-продукта из агарозного геля осуществляли с помощью набора Cleanup S-Cap (ЗАО «Евроген», Россия).

Очищенную ДНК секвенировали на генетическом анализаторе ABI PRISM 3500xl («Life Technologies», США) на базе Центра коллективного пользования «Геномные технологии, протеомика и клеточная биология» Всероссийского НИИ сельскохозяйственной микробиологии (ЦКП ГТПиКБ ФГБНУ ВНИИСХМ). Полученные последовательности анализировали с помощью программы ChromasLite 2.6.4 . Для множественного выравнивания и сравнения нуклеотидных последовательностей использовали программу ClustalOmega . Поиск последовательностей близкородственных типовых штаммов осуществляли в базе данных GenBank . Нуклеотидные последовательности были депонированы в GenBank под номерами PP512682-PP512693, PP578216.

Для постановки микровегетационного опыта (МВО) по кросс-ноду-ляции использовали семена дикорастущих арктических ( A. frigidus и O. adam-siana ) и кормовых ( T. repens и M. sativa ) бобовых растений, а также 9 бактериальных штаммов, полученных в настоящей работе и выделенных ранее из клубеньков арктических бобовых Lathyrus palustris L., Vicia cracca L. и Hedysarum arcticum B. Fedtsch. (27).

Семена растений скарифицировали и поверхностно стерилизовали в 98 % H 2 SO 4 в течение 5 мин, тщательно промывали стерильной водопро-930

водной водой и проращивали на фильтровальной бумаге в чашках Петри при 25 °С в темноте в течение 3-5 сут (в зависимости от вида растения). Растения культивировали в стерильных стеклянных сосудах объемом 50 мл, содержащих 3 г вермикулита. В каждый сосуд добавляли по 6 мл среды Красильникова-Кореняко (K 2 HPO 4 — 1,0 г/л, MgSO 4 •7H 2 O — 1,0 г/л, Ca 3 (PO 4 ) 2 — 0,2 г/л, FeSO 4 – 0,02 г/л), а также смесь микроэлементов по Федорову объемом 1 мл следующего состава: H 3 ВО 3 — 0,05, (NH 4 ) 2 MoO 4 — 0,05, KCl — 0,005, NaBr — 0,005, ZnSO 4 •7H 2 O — 0,003, MnSO 4 — 0,002 г/л.

Пробирки, содержащие по 2 проростка, инокулировали суспензиями индивидуальных штаммов в количестве 10⁶ клеток на сосуд. Каждый вариант инокуляции был представлен четырьмя-пятью повторностями в зависимости от качества и уровня всхожести семян конкретного вида растения. Положительным контролем служили коммерческие штаммы Rhizobium leguminosarum RCAM1365 и Sinorhizobium meliloti RCAM1750 из Сетевой био-ресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (ФГБНУ ВНИИСХМ, г. Санкт-Петербург). Неинокулированные растения использовались в качестве отрицательного контроля.

Растения выращивали в фитотроне при 18-22 °С в течение 30 сут при относительной влажности 50 % и четырехуровневом режиме освеще-ния/температуры: ночь (18 °С, 8 ч), утро (200 мкмоль квантов м ^{- 2}•с ^{- 1}, 20 °С, 2 ч), день (400 мкмоль квантов м " ²-с ^{- 1}, 23 °С, 12 ч), вечер (200 мкмоль квантов м ^{- 2} •с ^{- 1}, 20 °С, 2 ч). Освещение осуществлялось лампами L36W/77 FLUORA («OSRAM Licht AG», Германия). После окончания культивирования сырую биомассу растений взвешивали и подсчитывали образовавшиеся клубеньки. Азотфиксирующую активность клубеньков определяли ацетиленовым методом с помощью газового хроматографа GC-2014 («Shimadzu», Япония).

Данные МВО обрабатывали стандартным методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) в статистической среде R (v. 4.2.3; R Core Team, 2023). Определяли средние значения ( M ) и стандартные отклонения (±SD) для каждого из измеряемых симбиотических параметров в каждом варианте инокуляции. При статистически значимых результатах ANOVA (p < 0,05) проводился тест Дункана для множественного сравнения средних с помощью пакета agricolae.

Результаты. Арктическое озеро Севастьян-Кюеле (рис. 1) расположено в подзоне типичных тундр в 10 км южнее пос. Тикси среди невысоких гор Приморского кряжа. Территория относится к области сплошного распространения многолетнемерзлых грунтов. Почвы щебнистые маломощные криоземы. Растительность окрестностей озера представлена различными вариантами тундр от дриадовых и типчаковых на дренированных позициях до болотистых на понижениях вблизи озера с преобладанием кустарничковозеленомошных тундр. Большие площади заняты подвижными мелкощебнистыми осыпями с оригинальными слабо сомкнутыми растительными сообществами. Климат суровый. Продолжительность лета всего 2 мес, со средней температурой июля 11 °С (28).

Остров Тит-Ары (см. рис. 1) расположен в южной части дельты Лены и сформирован преимущественно песчаными аллювиальными отложениями. Это один из наиболее крупных островов Нижней Лены и самая северная область распространения лесов на территории Восточной Сибири. Растительность острова представлена редкостойными лиственничными лесами в сочетании с сообществами кустарниковых тундр, ольшатниками и гигрофильными злаковниками. Территория входит в состав государственного природного заповедника «Усть-Ленский» и относится к ресурсному резервату «Лена-Дельта» (29, 30).

Рис. 1. Места сбора растений Oxytropis taimyrensis (Jurtz.) A. et D. Love, Astragalus frigidus (L.) A. Gray и Astragalus tugarinovii Basil. на о. Тит-Ары (дельта реки Лены) и в районе оз. Сева-стьян-Кюеле (окрестности Тикси).

• 1.    Изоляты, выделенные из клубеньков Astragalus tugarinovii Basil., Oxytropis tai-myrensis (Jurtz.) A. et D. Love и Astragalus frigidus (L.) A. Gray, собранных в районе оз. Севастьян-Кюеле и на о. Тит-Ары (2021 год)

  Место сбора	¹ штамма	Ближайший типовой штамм	Сходство гена rrs , %	Результат идентификации
  		Astragalus tugarinovii
  оз. Севастьян-	7/1-1	R. brockwellii CC275e	100	Rhizobium sp.
  Кюеле		R. sophorae LMG 27901
  		R. anhuiense CCBAU 23252
  		R. indicum JKLM 12A2
  	7/2-2	T. robiniae R-45977	99,93	Tardiphaga robiniae
  	7/4-2	T. robiniae R-45977	99,93	Tardiphaga robiniae
  		Oxytropis taimyrensis
  оз. Севастьян-	9/1-5	T. robiniae R-45977	99,93	Tardiphaga robiniae
  Кюеле	9/3-1	T. robiniae R-45977	99,93	Tardiphaga robiniae
  	9-4/1	M. jarvisii ATCC 33669	99,93	Mesorhizobium sp.
  		M. carmichaelinearum MonP1N1	99,92
  	9/5-1	T. robiniae R-45977	99,93	Tardiphaga robiniae
  		Astragalus frigidus
  о. Тит-Ары	25А/1-3	B. lathyri R-46060	99,13	Bosea sp.
  	25-2/1	M. shangrilense CCBAU 65327	99,85	Mesorhizobium sp.
  		M. qingshengii CCBAU 33460
  	25А/2-1	B. lathyri R-46060	100	Bosea lathyri
  	25А/2-2	B. psychrotolerans 1131	99,93	Bosea sp.
  		B. vaviloviae Vaf18	99,86
  	25А/4-1	B. psychrotolerans 1131	100	Bosea sp.
  		B. vaviloviae Vaf18	99,78
  	25А/5-1	M. shangrilense CCBAU 65327	99,92	Mesorhizobium sp.
  		M. qingshengii CCBAU 33460

• 2.    Эффект инокуляции бобовых растений Oxytropis adamsiana (Trautv.) Jurtzev и Astragalus frigidus (L.) A. Gray арктическими изолятами в условиях стерильного микровегетационного опыта ( M ±SD)

• 3.    Эффект инокуляции бобовых растений Trifolium repens L. и Medicago sativa L. арктическими изолятами и коммерческими штаммами Rhizobium leguminosarum bv. viciae RCAM1365 и Sinorhizobium meliloti RCAM1750 в условиях стерильного микровегетационного опыта ( M ±SD)

  Вариант инокуляции	Число клубеньков на растение	Сырая биомасса, мг/растение			Ацетилен-редуктазная активность, мкмоль C 2 H 4• растение - 1• сут - 1
  		побег	корень	общая масса

  	Trifolium repens ( n = 5)
  Без инокуляции	0	47,6±4,3ab	46,0±19,5bc	93,6±23,1	0
  R. leguminosarum bv. viciae RCAM1365	6,6±1,8b	58,0±8,4a	29,0±8,9c	87,0±16,4	0,9±0,5
  Rhizobium sp. 19-1/1*	5,4±1,5b	53,0±14,8a	60,0±12,2abc	113,0±24,4	0
  Rhizobium sp. 33-1/1*	5,4±1,1b	43,6±8,6ab	50,0±18,7ab	93,6±24,0	0
  Rhizobium sp. 20-1/1*	2,2±0,8c	44,0±7,1ab	45,0±11,2bc	89,0±13,4	0
  Mesorhizobium sp. 32-2/1*	3,0±1,0c	50,0±15,2a	46,0±18,2bc	96,0±20,7	0
  R. giardinii 20/1-1	0	54,0±20,7a	52,0±25,9abc	106.0±42,2	н/о
  Mesorhizobium sp. 9-4/1	0	44,0±5,5ab	64,0±23,0ab	108,0±22,8	н/о
  Mesorhizobium sp. 25-2/1	0	32,0±13,0b	70,0±12,2ab	102,0±21,7	н/о
  Rhizobium sp. 7/1-1	0	44,0±8,9ab	76,0±18,2a	120,0±22,4	н/о
  M. norvegicum 20/1-4**	0	44,0±11,4ab	58,0±21,7ab	102,0±26,8	н/о
  Без инокуляции	Medicago s 0       42,0±8,4ab		ativa ( n = 57,6±18,4	5) 99,6±16,5	0
  S. meliloti RCAM1750	9,0±3,4a	48,8±19,6a	40,4±8,0	89,2±25,2	0,9±0,4
  Rhizobium sp. 19-1/1*	2,0±0,7c	38,0±11,0abc	66,4±20,3	104,4±26,7	0
  Rhizobium sp. 33-1/1*	2,4±0,5c	36,0±11,9abc	48,6±17,5	84,6±22,6	0
  Rhizobium sp. 20-1/1*	2,4±0,4c	26,0±15,2bc	46,4±20,1	72,4±33,6	0
  Mesorhizobium sp. 32-2/1*	0	26,0±5,5bc	44,0±13,4	70,0±18,7	н/о
  R. giardinii 20/1-1**	0	24,0±4,2c	31,8±16,2	55,8±14,8	н/о
  Mesorhizobium sp. 9-4/1***	0	33,0±14,8abc	46,0±17,1	79,0±26,6	н/о
  Mesorhizobium sp. 25-2/1***	5,2±1,3b	38,0±11,0abc	50,0±15,8	88,0±25,9	0
  Rhizobium sp. 7/1-1***	3,2±0,4c	36,0±11,4abc	52,0±19,2	88,0±17,9	0
  M. norvegicum 20/1-4**	0	28,0±4,5bc	52,0±19,2	80,0±17,3	н/о

Из клубеньков бобовых растений O. taimyrensis , A. tugarinovii и A. frigidus , собранных в районе оз. Севастьян-Кюеле и на о. Тит-Ары, было выделено соответственно 4, 3 и 6 изолятов. Штаммы 7/1-1, 9-4/1, 25-2/1 и 25А/5-1 формировали колонии на 3-4-е сут, остальные — на 5-6-е сут. На основании анализа гена rrs изоляты были отнесены к родам Rhizobium (сем.

Rhizobiaceae ), Mesorhizobium (сем. Phyllobacteriaceae ), Bosea (сем. Boseaceae ) и Tardiphaga (сем. Bradyrhizobiaceae ) порядка Hyphomicrobiales (табл. 1).

Штамм 7/1-1 из клубенька A. tugarinovii показал 100 % сходство по rrs гену сразу с девятью типовыми штаммами: R. brockwellii CC275e, R. sopho-rae LMG 27901, R. indigoferae CIP 108029, R. anhuiense CCBAU 23252, R. in-dicum JKLM 12A2, R. ruizarguesonis UPM1133, R. laguerreae FB206, R. legumi-nosarum LMG 14904, R. leguminosarum bv. viciae USDA 2370. Уточнение видовой принадлежности штамма 7/1-1 будет определено по результатам секвенирования и анализа его полного генома.

Штамм 9-4/1 из клубенька O. taimyrensis показал более 99,9 % сходства по rrs гену с типовыми штаммами M. jarvisii ATCC 33669 и M. carmi-chaelinearum MonP1N1 . Штамм M. jarvisii ATCC 33669 впервые был выделен из клубеньков лядвенца рогатого ( Lotus corniculatus L.) (31), тогда как штамм M. carmichaelinearum MonP1N1 выделен из клубеньков монтигены новозеландской ( Montigena novae-zelandiae (Hook.f.) Heenan), произрастающей на Южном острове в Новой Зеландии (32).

Штаммы 25-2/1 и 25А/5-1 из клубеньков A. frigidus демонстрировали наибольшее сходство по гену rrs (более 99,85 %) с типовыми штаммами M. shangrilense CCBAU 65327 и M. qingshengii CCBAU 33460, выделенными соответственно из клубенька караганы двуцветной ( Caragana bicolor Kom.) и астрагала китайского ( A. sinicus L.) (33, 34).

Штаммы 25А/1-3, 25А/2-1, 25А/2-2 и 25А/4-1 из клубеньков A. frigidus на основании анализа rrs гена были отнесены к роду Bosea. Штаммы 25А/1-3 и 25А/2-1 показали соответственно 99,13 и 100 % сходства с ближайшим типовым штаммом B. lathyri R-46060, выделенным из клубенька чины широколистной ( L. latifolius L.), произрастающей в Бельгии (35). Штаммы 25А/2-2 и 25А/4-1 были родственны на уровне 99,86-100 % сходства с типовыми штаммами B. psychrotolerans 1131 и B. vaviloviae Vaf18. Штамм B. psychrotolerans 1131 был выделен из воды оз. Мичиган (США) и описан как психротроф-ный представитель класса Proteobacteria , тогда как штамм B. vaviloviae Vaf18 был выделен из клубенька вавиловии прекрасной ( Vavilovia formosa (Steven) Fed) , произрастающей на Северном Кавказе (Российская Федерация) (36, 37). Следует отметить, что представители рода Bosea присутствуют в клубеньках различных видов бобовых растений: Lupinus , Lathyrus , Robini a, Vavilovia , Caragana, Spartocytisus , Vicia , Astragalus , Oxytropis , Hedysarum (24, 26, 35-40). Однако способность штаммов Bosea к самостоятельному формированию клубеньков до сих пор не установлена.

Изоляты 7/2-2, 7/4-2 и 9/1-5, 9/3-1, 9/5-1, выделенные соответственно, из A. tugarinovii и O. taimyrensis , показали 99,93 % сходства по гену rrs с ближайшим типовым штаммом T. robiniae R-45977. Представители вида T. robiniae встречаются в клубеньках узколокальных эндемиков рода Остролодочник, реликтового растения вавиловии прекрасной ( Vavilovia formosa (Steven) Fed. ), робинии ложноакациевой ( Robinia pseudoacacia L.) (25, 41 ), а также в клубеньках других видов бобовых (24, 26, 40) . Показано, что геномы некоторых штаммов T. robiniae могут содержать отдельные симбиотические гены ( nod, nif и fix ) (25) .

Способность девяти ризобиальных штаммов Rhizobium sp . 7/1-1, 191/1, 20-1/1 и 33-1/1, R. giardinii 20/1-1, M. norvegicum 20/1-4 и Mesorhizobium sp. 9-4/1, 25-2/1 и 32-2/1 нодулировать дикорастущие арктические бобовые O. adamsiana и A. frigidus (табл. 2) и сельскохозяйственные кормовые бобовые T. repens и M. sativa (табл. 3) изучали в условиях стерильного микрове-гетационного опыта.

Вариант инокуляции	Число клубеньков на растение	Сырая биомасса, мг/растение			Ацетилен-редуктазная активность, мкмоль C 2 H 4• растение - 1• сут - 1
		побег	корень	общая масса
Без инокуляции	Oxytropis adamsiana ( n = 4) 0       33,2±8,6    17,7±4,4bcd         50,8±10,6					0
Rhizobium sp. 19-1/1*	0	42,4±11,4	26,2±10,9ab	68,6±13,5		н/о
Rhizobium sp. 33-1/1*	0	45,9±7,7	27,9±5,9a	73,8±11,3		н/о
Rhizobium sp. 20-1/1*	0	40,2±12,6	22,0±7,4abcd	62,2±19,4		н/о
Mesorhizobium sp. 32-2/1*	0	28,5±7,8	14,8±2,0d	43,3±7,9		н/о
R. giardinii 20/1-1**	0	40,6±6,8	15,5±4,5cd	56,1±10,4		н/о
Mesorhizobium sp. 9-4/1***	2,0±0,0b	43,7±19,3	17,9±5,3abcd	62,4±21,4		0,6±0,12a
Mesorhizobium sp. 25-2/1***	4,8±0,8a	44,7±5,2	24,5±6,8abc	69,2±6,3		0,6±0,24a
Rhizobium sp. 7/1-1***	0	44,7±13,4	15,2±4,0cd	59,8±12,3		н/о
M. norvegicum 20/1-4**	4,0±1,4a	41,0±4,0	16,7±3,9bcd	57,7±8,2		0,6±0,18a
Без инокуляции	As 0	tragalus 51,2±2,2ab	frigidus ( n 14,2±4,9c	= 5) 65,4±5,8b	c	0
Rhizobium sp. 19-1/1*	0	41,0±7,4bc	21,8±4,9bc	62,8±8,0b	c	н/о
Rhizobium sp. 33-1/1*	0	26,0±8,9e	36,0±15,2a	62,0±21,7bc		н/о
Rhizobium sp. 20-1/1*	0	54,6±7,1a	33,2±9,3ab	87,8±4,4a		н/о
Mesorhizobium sp. 32-2/1*	0	42,0±8,4bc	28,0±8,4ab	70,0±15,8b		н/о
R. giardinii 20/1-1**	0	24,0±5,5e	22,2±7,4bc	46,2±10,6	c	н/о
Mesorhizobium sp. 9-4/1***	1,8±0,4a	30,0±10,0de	23,0±6,7bc	53,0±13,0bc		0,1±0,02b
Mesorhizobium sp. 25-2/1***	1,8±0,4a	30,0±7,1de	22,0±4,5bc	52,0±4,5b	c	0,2±0,02a
Rhizobium sp. 7/1-1***	0	20,0±7,1e	26,0±5,5abc	46,0±5,5c		н/о
M. norvegicum 20/1-4**	0,8±0,4b	38,0±10,4cd	23,0±9,7bc	61,0±18,8bc		0

Пр и м еч ани е. н/о — не определялось; * — штаммы, ранее изученные на способность формировать азотфиксирующие клубеньки на кормовых бобовых растениях V. cracca , V. sativa , L. sativus и L. pratensis (22); ** — штаммы, ранее выделенные из клубеньков арктического дикорастущего бобового H. arcticum (42); *** — штаммы, полученные в настоящей работе.

a, b, c, d, e Разными латинскими буквами отмечены варианты, различия между которыми статистически значимы (критерий Дункана, p < 0,05). В вариантах без буквенного ранжирования статистически значимых групповых различий (р > 0,05) выявлено не было и тест Дункана не проводился.

Пр и м еч ани е. н/о — не определялось.

— штаммы, ранее изученные на способность формировать азотфиксирующие клубеньки на кормовых бобовых растениях V. cracca, V. sativa, L. sativus и L. pratensis (22); ** — штаммы, ранее выделенные из клубеньков арктического дикорастущего бобового H. arcticum (42); *** — штаммы, полученные в настоящей работе.

• ^{a, b, c, d, e} Разными латинскими буквами отмечены варианты, различия между которыми статистически значимы (критерий Дункана, p < 0,05). В вариантах без буквенного ранжирования статистически значимых групповых различий (р > 0,05) выявлено не было и тест Дункана не проводился.

Ранее штаммы Rhizobium sp. 19-1/1 и 33-1/1, Rhizobium sp. 20-1/1 и Mesorhizobium sp. 32-2/1, R. giardinii 20/1-1 и M. norvegicum 20/1-4 были выделены соответственно из клубеньков арктических дикорастущих бобовых чины болотной ( L. palustris ), вики мышиной ( V. cracca ) и копеечника арктического ( H. arcticum ), собранных в дельте р. Лены и окрестностях п. Тикси в Арктической зоне Якутии (27, 42). У штаммов Mesorhizobium sp. 32-2/1 и Rhizobium sp . 19-1/1, 20-1/1 и 33-1/1 обнаружена способность формировать преимущественно неазотфиксирующие клубеньки на корнях сельскохозяйственных бобовых V. cracca , V. sativa , L. sativus и L. pratensis (27). Для двух штаммов R. giardinii 20/1-1 и M. norvegicum 20/1-4 была установлена видовая принадлежность на основе молекулярно-филогенетических методов (42).

Мы показали, что на растениях O. adamsiana клубеньки (рис. 2, в, г) эффективные образовывались в трех вариантах инокуляции штаммами Meso-rhizobium sp. 9-4/1, 25-2/1 и M. norvegicum 20/1-4. Несмотря на одинаковую азотфиксирующую активность, число клубеньков в вариантах варьировалось. Средние значения массы побегов и общей сырой массы растений в большинстве вариантов инокуляции были выше по сравнению с вариантом без инокуляции, однако статистически значимых групповых различий между вариантами не наблюдалось (см. табл. 2). Следует отметить, что штаммы Mesorhizobium sp. 9-4/1, 25-2/1 и M. norvegicum 20/1-4 были выделены соответственно из клубеньков O. taimyrensis , A. frigidus и H. arcticum , что указывает на широкую специфичность растений O. adamsiana и, предположительно, позволяет этому виду лучше адаптироваться к различным почвенноклиматическим условиям Арктики. Интересно, что наиболее высокие симбиотические параметры (общая сырая биомасса, масса побегов и корней) были отмечены в варианте инокуляции штаммом Rhizobium sp. 33-1/1, хотя клубеньков на O. adamsiana он не образовывал. Для объяснения этого эффекта необходимо изучить способность штамма Rhizobium sp. 33-1/1 к продукции фитогормонов ауксинов и цитокининов, влияющих на восприимчивость корневой системы растений.

На A. frigidus клубеньки (см. рис. 2, а, б) образовывались в трех вариантах инокуляции штаммами M. norvegicum 20/1-4, Mesorhizobium sp. 252/1 и 9-4/1, тогда как эффективный симбиоз был отмечен только в двух последних случаях (см. табл. 2). В большинстве вариантов средние значения массы побега были достоверно (p < 0,05) ниже по сравнению с контролем без инокуляции. Однако в вариантах с Rhizobium sp. 20-1/1, 33-1/1 и Meso-rhizobium sp. 32-2/1 средние значения массы корня оказались выше (p < 0,05) по сравнению с неинокулированным контролем. В случае со штаммом Rhi-zobium sp. 20-1/1 и средние значения общей массы растения также были достоверно (p < 0,05) выше по сравнению с другими вариантами инокуляции.

На T. repens неэффективные клубеньки (рис. 3, в, г) образовывались в четырех вариантах инокуляции штаммами Mesorhizobium sp. 32-2/1, Rhizobium sp. 19-1/1, 33-1/1 и 20-1/1 (см. табл. 3). В вариантах инокуляции Mesorhizobium sp. 32-2/1 и Rhizobium sp. 20-1/1 среднее количество клубеньков было достоверно (p < 0,05) меньше по сравнению с коммерческим штаммом R. leguminosarum RCAM1365. Отметим, что в варианте инокуляции Rhizobium sp. 7/1-1 среднее значение массы корня было достоверно выше, тогда как среднее значение общей биомассы растения оказалось недостоверно выше в сравнении с положительным контролем. В варианте со штаммом Mesorhizobium sp. 25-2/1 также показано, что среднее значение массы побега выше по сравнению с вариантом инокуляции с R. leguminosarum RCAM1365 (p < 0,05).

Рис. 2. Клубеньки на корнях Astragalus frigidus (L.) A.Gray (а, б) и Oxytropis adamsiana (Trautv.) Jurtzev (в, г) , полученные при инокуляции растений штаммами Mesorhizobium sp. 9-4/1 (б, г) и 25-2/1 (а, в) (микровегетационный опыт) .

Рис. 3. Клубеньки и клубенькоподобные формирования на корнях Medicago sativa L. (а, б) и Trifolium repens L. (в, г) , полученные при инокуляции растений штаммами Rhizobium sp. 20-1/1 (а) , 19-1/1 (в) , и 33-1/1 (б, г) (микровегетационный опыт) .

На M. sativa неэффективные клубеньки формировались в пяти вариантах инокуляции штаммами Mesorhizobium sp. 25-2/1, Rhizobium sp. 19-1/1, 33-1/1, 20-1/1 и 7/1-1. Помимо типичных клубеньков, в некоторых вариантах инокуляции на корнях M. sativa формировались клубенькоподобные образования (см. рис. 3, а, б). В варианте инокуляции штаммом Rhizobium sp. 19-1/1 среднее значение массы корня и общей биомассы было выше в сравнении с остальными вариантами и коммерческим штаммом S. meliloti RCAM1750, однако статистически значимых различий между ними не наблюдалось. При инокуляции штаммом R. giardinii 20/1-1 отмечали пони- женные значения всех симбиотических параметров в сравнении с S. meliloti RCAM1750, однако достоверные (p < 0,05) отличия были зафиксированы только для средних значений массы побега.

Ранее в работе А.Е. Крисс и соавт. из клубеньков дикорастущих бобовых Oxytropis nigrescens (Pall.) Fisch., O. maydelliana Trautv., Astragalus alpinus L., A. umbellatus Bunge и Hedysarum obscurum L., произрастающих в тундре Чукотского полуострова, о-ва Колючин и Врангеля, было изолировано 8 бактериальных штаммов, не способных в вегетационных опытах образовывать клубеньки на корнях кормовых бобовых растений клевера, донника, люцерны, гороха и вики. Однако наблюдалась способность некоторых штаммов образовывать клубеньки на дикорастущих бобовых H. alpinum L., H. sibiricum Poir. и A. trautvetteri Bunge., при этом азотфиксирующая активность клубеньков не изучалась (43). В корневых клубеньках дикорастущих популяций бобовых растений Lathyrus pratensis L., Vicia cracca L., Trifolium repens L. и Astragalus schelichowii Turcz., собранных в окрестностях города Норильска, были обнаружены представители родов Rhizobium (сем. Rhizobi-aceae ), Bosea (сем. Boseaceae ) и Tardiphaga (сем. Bradyrhizobiaceae ), однако изучение симбиотических параметров (общая сырая биомасса растений, уровень азотфиксирующей активности и т.д.) бобово-ризобиального симбиоза не проводилось (40).

В работах D. Prevost с соавт. (44, 45) была продемонстрирована способность штаммов, выделенных из клубеньков арктических видов бобовых Astragalus и Oxytropis , произрастающих в Канаде, эффективно нодулировать кормовое бобовое растение эспарцет виколистный ( Onobrychis viciifolia ), произрастающий в умеренных широтах. Показано, что арктические ризобии были более эффективны, чем ризобии (коммерческие штаммы) умеренных широт, в улучшении роста и продуктивности эспарцета в условиях низкотемпературных лабораторных и полевых опытов. По мнению некоторых авторов (46, 47), АТФаза, транспортирующая β-глюкан, который участвует в прикреплении бактериальных клеток к корням растений для инициирования симбиотического взаимодействия, может играть решающую роль в инициировании симбиоза при низких температурах. Повышенный уровень синтеза белков холодового шока у арктических ризобий также может быть одной из причин их адаптации к экстремальным условиям Севера (47). Изучение эффективности симбиоза бобовых с арктическими ризобиями позволяет отбирать наиболее эффективные азотфиксирующие штаммы, адаптированные к местным экстремальным почвенно-климатическим условиям, а также использовать их в качестве основы для селекции и направленного генетического конструирования штаммов, перспективных для внедрения в сельскохозяйственную практику на Крайнем Севере (27).

Таким образом, из клубеньков арктических дикорастущих бобовых растений Oxytropis taimyrensis, Astragalus frigidus и Astragalus tugarinovii было выделено 13 изолятов, относящихся к родам Rhizobium, Mesorhizobium, Bosea и Tardiphaga из порядка Hyphomicrobiales (α-Proteobacteria). Штаммы Rhizo-bium sp. 7/1-1, Tardiphaga robiniae 7/2-2 и 7/4-2 были выделены из A. tuga-rinovii, штаммы Mesorhizobium sp. 25-2/1, 25А/5-1, Bosea sp. 25А/1-3, B. lathyri 25А/2-1, B. psychrotolerans 25А/2-2 и 25А/4-1 — из A. frigidus, тогда как штаммы Mesorhizobium sp. 9-4/1, T. robiniae 9/1-5, 9/3-1 и 9/5-1 — из клубеньков O. taimyrensis. В результате постановки микровегетационного опыта с участием дикорастущих арктических (Oxytropis adamsiana и Astragalus frigidus) и сельскохозяйственных кормовых (Trifolium repens и Medicago sativa) бобовых растений штамм R. giardinii 20/1-1 был единственным, не сформировавшим клубеньки ни в одном из вариантов инокуляции. В целом в отношении местных арктических видов O. adamsiana и A. frigidus были более активны штаммы, выделенные из местных же видов бобовых (O. taimyrensis, A. frigidus, H. arcticum), в то время как культурные растения M. sativa и T. repens оказались более отзывчивы на инокуляцию штаммами Rhizobium sp. 191/1 и 33-1/1, Rhizobium sp. 20-1/1 и Mesorhizobium sp. 32-2/1, выделенными соответственно из заносных бореальных растений L. palustris и V. cracca. Наблюдаемый симбиоз во всех случаях инокуляции характеризовался относительно низкой азотфиксирующей активностью и не приводил к статистически значимому увеличению массы побегов и общей массы растений, хотя прибавка в ряде случаев достигала 34-36 % относительно неинокулирован-ного контроля. Однако необходимо отметить существенный позитивный эффект в отношении массы корней, выявленный у ряда штаммов (M. nor-vegicum 20/1-4, Mesorhizobium sp. 9-4/1, 25-2/1 и 32-2/1, Rhizobium sp. 7/1-1 и 20-1/1, 33-1/1), которые не образуют симбиоз в отдельных вариантах или формируют неактивные клубеньки. Для понимания механизма этого эффекта необходимо секвенирование полногеномных последовательностей штаммов, а также поиск и функциональное изучение соответствующих рост-стимулирующих генов синтеза ауксинов, гиббереллинов и цитокининов. Следует отметить, что способность распространенного на Таймыре и в Якутии вида O. adamsiana формировать эффективный симбиоз с тремя арктическими ризобиальными штаммами позволяет рассматривать его в качестве перспективного компонента при создании высокопродуктивных бобово-злаковых агрофитоценозов в различных почвенно-климатических условиях Арктики.

Выражаем благодарность руководству и координаторам экспедиции «Лена 2021» за организацию и проведение экспедиции в район дельты реки Лены. Искренне благодарим Сергея Александровича Правкина (ААНИИ) за помощь в сборе и транспортировке семян бобовых культур. Выражаем благодарность коллективу научно-исследовательской станции «Остров Самойловской» и лично Федору Виссанионовичу Селяхову за предоставленный транспорт.