Генотипические особенности радужной форели (Oncorhynchus mykiss) породы камлоопс разного происхождения

Современные технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР) активно применяются в различных областях молекулярной биологии для решения разнообразных исследовательских и практических задач (1).

Высокопродуктивные стада и породы радужной форели не всегда подходят для товарных рыбоводных хозяйств, а отечественный посадочный материал не соответствует требованиям рынка. В связи с этим необходимо исследовать и сравнить отечественный и импортный генофонд, чтобы использовать его в качестве исходного материала для селекционной работы (2, 3). Ключевые аспекты успешности этой работы — оценка генотипов, определение групп с высоким полиморфизмом и разработка методики отбора производителей с учетом их генетических особенностей. Для этого необходимо изучить все породы и группы радужной форели, используемые в товарном рыбоводстве (4, 5).

Молекулярно-генетические маркеры служат эффективными популяционными генетическими инструментами для решения таких вопросов, как механизмы адаптации рыб к условиям окружающей среды, защита биоразнообразия, резистентность рыбы к болезням, оценка последствий инбридинга и т.д. (6-8). Информация о специфике формирования генетической структуры объектов аквакультуры создаст платформу для получения локальных групп особей с желаемыми ценными характеристиками (9-11).

Основной задачей при разработке таких программ становится изучение полиморфизма на внутривидовом уровне. ISSR-ПЦР-маркеры (inter simple sequence repeat, межмикросателлитные повторы) — один из наиболее удобных и дешевых инструментов молекулярно-генетического анализа для решения этой проблемы. В основе селекционно-племенной работы с объектами аквакультуры всегда лежит задача повышения генетического разнообразия популяций и сохранения генотипов, ассоциированных с высокой продуктивностью особей (11-13). Значительный интерес представляет изучение генетической структуры популяций всех имеющихся групп форели породы камлоопс с целью выявления и идентификации наиболее высокопродуктивных линий, изучения особенностей их генетической изменчивости и создания условий для эффективной селекционной работы с этой породой (14-16).

Мультилокусный межмикросателлитный анализ (ISSR-ПЦР) позволяет изучать генетическое биоразнообразие и выявлять видоспецифичные особенности, которые могут быть использованы для создания стандарта генофонда породы на основе ISSR-фингерпринтинга (2, 5, 8). Генетическая сертификация становится неотъемлемой частью современных стандартов селекции и, несомненно, облегчает борьбу с фальсификациями. Маркеры ISSR широко используются для изучения различных видов рыб: радужной форели (17-19), стерляди (21, 22), тиляпии (23-25), карповых (26-28). Мульти-локусный анализ популяций рыб позволяет определять генетическое разнообразие между популяциями и линиями, используемыми в селекционном процессе (29-31). С помощью этого метода также исследовано генетическое разнообразие популяций сома в естественных условиях (32). Ряд работ посвящен изучению генетического профиля морских и, в большей степени, экзотических видов рыб, например семейства Osphronemidae (макроподо-вые), виды пангасиуса, рыба-попугай (33-35), рыба-ангел (36).

Для повышения эффективности селекционно-племенной работы с радужной форелью крайне важно задействовать группы рыб различного происхождения. Это позволяет сформировать необходимый для селекции резерв генотипов и создает предпосылки для увеличения генетического разнообразия популяций, а также способствует сохранению лучших породных особенностей (37-39). Однако, несмотря на сходство генетических структур, каждая группа форели имеет свои уникальные характеристики, что также важно учитывать при организации селекционной работы и управлении рыбными хозяйствами.

В России популяционный генетический анализ с использованием межмикросателлитных локусов был проведен на осетровых (40). Однако выращиваемая в России радужная форель до сих пор не изучена с использованием маркеров ISSR.

В настоящей работе на радужной форели породы камлоопс разного географического происхождения (Финляндия и США) с помощью межмик-росателлитных ДНК-маркеров впервые установлено, что около 50 % особей в обеих популяциях имеют уникальные генотипы. Это указывает на высокое генетическое разнообразие породы камлоопс. Также определены уровни гетерозиготности для обеих популяций (0,71 для финской и 0,85 для американской), что позволяет оценить адаптивный потенциал групп рыб.

Нашей целью было изучение генетических особенностей культивируемой радужной форели породы камлоопс разного происхождения по межмикросателлитным локусам.

Методика. Работу проводили в хозяйствах аквакультуры Республики Карелия в 2021 году. Для выращивания радужной форели ( Oncorhynchus mykiss ) породы камлоопс использовали посадочный материал, подрощенный из икры (компании-производители «Hanka-Taimen Oy», Финляндия и «Troutlodge, Inc.», США).

Для анализа использовали образцы мышечной ткани от 10 особей возрастом 0+ (сеголетки, Финляндия) и 10 особей возрастом 1 год (годовики, США). Биоматериал отбирали с учетом положений, рекомендованных Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986). Фрагменты мышечной ткани площадью 1 см2 хранили в 96 % спирте при -20 °С.

ДНК выделяли с помощью реагентов фирмы ООО НПО «Синтол» (Россия) из серии ДНК-экстран 2 согласно рекомендациям производителя.

Особей двух популяций радужной форели генотипировали по ISSR-маркерам с использованием праймеров (CTC) 6 G, (GAG) 6 C, (АСС) 6 G (1). Полные последовательности праймеров: (CTC) 6 G — 5´-CTC-CTC-CTC-CTC-CTC-CTC-G-3´; (GAG) 6 C — 5´-GAG-GAG-GAG-GAG-GAG-GAG-C-3´; (АСС) 6 G — 5´-АСС-АСС-АСС-АСС-АСС-АСС-G-3´. В реакционную смесь, состоящую из буфера для ПЦР, MgC l2 , Taq ДНК-полимеразы и деионизированной воды, вносили по 1 мкл праймера и 1,5 мкл ДНК. Амплификацию осуществляли на оборудовании BIO-RAD Tetrad 2 («Bio-Rad», США). Полимеразную цепную реакцию проводили в условиях первичной денатурации при 95 °C в течение 5 мин; далее следовали 37 циклов: 93 °C, 62 °C, 72 °C в течение 1 мин каждый; финальная элонгация проходила при 72 °C в течение 5 мин.

Ампликоны разделяли по молекулярным массам с помощью горизонтального электрофореза на оборудовании BIO-RADSub-Cell GT System («Bio-Rad», США) в 1 % агарозном геле.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программного обеспечения GenALEx (R. Peakall, P.E. Smouse, 2012). Рассчитывали частоту встречаемости аллелей и генотипов в популяциях, степень родства между особями, генетические дистанции между аллелями, определяли генетические вариации между популяциями, среднюю гетерозиготность.

Результаты. С помощью праймера (CTC) 6 G у финской популяции форели мы выявили 10 амплифицированных фрагментов ДНК, у американской — 12. В среднем число амплифицированных фрагментов составило соответственно 7,3 и 6,9 (рис., А).

У радужной форели финского происхождения чаще всего встречались 6 фрагментов ДНК — 1, 2, 3, 4, 5 и 6, у форели американского происхождения — 1, 3, 4, 5, 6 и 9 (см. рис., А). У всех особей первой популяции был обнаружен межмикросателлитный участок ДНК длиной 760 п.н. (локус 5), у форелей второй популяции этот участок также встречался в 100 % случаев и имел длину около 900 п.н. (локус 6).

Частота встречаемости межмикросателлитных локусов в популяциях радужной форели ( Oncor-hynchus mykiss ) породы камлоопс финского («Hanka-Taimen Oy», Финляндия) (а) и американского («Troutlodge, Inc.», США) (б) происхождения при использовании разных праймеров: А — (CTC) 6 G, Б — (GAG) 6 C, В — (ACC) 6 G (хозяйства аквакультуры, Республики Карелия, 2021 год).

Частота встречаемости локусов различалась в исследованных выборках. У форели финского происхождения локус 2 встречался на 43,0 % чаще, локус 5 — на 7,0 %, локус 8 — на 46,0 %. У форели американского происхождения локус 1 встречался чаще на 14,0 %, локус 3 — на 7,0 %, локус 6 — на 3,0 %, локус 9 — на 30,0 %, локус 10 — на 37,0 % по сравнению с форелью финского происхождения. Локусы 11 и 12 имелись только у форели американского происхождения. Локус 4 встречаелся в 100 % случаев в обеих популяциях, локус 7 — лишь на 0,03 % чаще у форели американского происхождения, чем у форели финского происхождения.

При использовании праймера (GAG) 6 С у форели финского происхождения выявили 10 амплифицированных фрагментов ДНК. Среднее число фрагментов составило 6,5 у форели финского происхождения, 6,8 — у форели американского происхождения (см. рис., Б).

У форели финского происхождения наиболее часто встречались 7 фрагментов — 3, 4, 6, 7, 8, 9 и 10, американского — 5 фрагментов: 3, 6, 8, 10 и 11. Локус 11 встречался у всех особей финского происхождения (710 п.н., межмикросателлитный участок ДНК).

Частота встречаемости фрагментов ДНК также различалась между двумя популяциями. В финской локусы 4, 6, 8, 9 и 10 встречались соответственно на 66,6; 3,3; 3,3; 53,3 и 20,0 % чаще, чем в американской. В американской популяции чаще встречались локусы 1, 2 и 5 — соответственно на 43,3; 6,6 и 6,7 %. Локусы 11 и 12 имелись только у форели американского происхождения, а локус 3 встречался в обеих популяциях с одинаковой частотой — 83,3 %. Локус 11 встречался у всех особей американского происхождения в 100 % случаев.

При использовании праймера (ACC) 6 G у радужной форели финского и американского происхождения амплифицировалось соответственно 11 и 12 фрагментов ДНК, а среднее число фрагментов составило 5,3 и 5,8 (см. рис., В). У форели финского происхождения чаще всего встречались 4 фрагмента ДНК — 2, 5, 7 и 8, американского — 5 фрагментов: 2, 5, 7, 9 и 12. Кроме того, в первой популяции локус 3 встречался чаще на 40,0 %, локус 4 — на 10,0 %, локус 7 — на 6,7 %, локус 8 — на 56,7 %. Во второй популяции наиболее распространенными были локус 1 (встречался на 23,3 % чаще), локус 5 (на 10,0 %), локус 6 (на 3,3 %), локус 9 (на 30,0 %) и локус 11 (на 13,4 %). Локус 12 встречался только у форели американского происхождения, а локусы 2 и 10 были обнаружены в обеих популяциях с одинаковой представленностью — соответственно 96,7 и 10,0 %.

Таким образом, при генотипировании радужной форели с помощью трех ISSR-маркеров было обнаружено от 10 до 12 амплифицированных фрагментов ДНК. Их молекулярная масса значительно различалась в зависимости от праймера (табл.).

Результаты генотипирования радужной форели Oncorhynchus mykiss породы кам-лоопс разного происхождения с помощью ISSR-маркеров (хозяйства аквакультуры, Республики Карелия, 2021 год)

Праймер

Всего фрагментов

Среднее число фрагментов на локус

Молекулярная масса амплифи-цированных фрагментов, п.н.

Финляндия («Hanka- Taimen O y»)

(CTC) 6 G	10	7,3	130-1950
(GAG) 6 С	10	6,6	200-1900
(ACC) 6 G	11	5,3	210-2110
		США («Troutlodge, Inc.»)
(CTC) 6 G	12	8,0	150-2400
(GAG) 6 С	12	6,9	370-2500
(ACC) 6 G	12	5,8	350-2270

Анализ частоты генотипов двух популяций радужной форели позволил выявить схожесть паттернов у некоторых особей и, следовательно, обнаружить в геноме похожий сайт локализации микросателлитных последовательностей. Уникальные генотипы имели около 50 % особей из исследованных выборок, а соотношение гетерозиготности межмикросателлитной ДНК у финской (0,71) и американской (0,85) популяций указывало на значительное гетерозиготное разнообразие.

Мы проверили эффективность ISSR-праймеров с тринуклеотидным микросателлитным мотивом, содержащих один якорный нуклеотид на 3´-конце, что, как отмечали E. Zietkiewicz с соавт. (13), препятствует проскальзыванию по длине комплементарной области микросателлита при амплификации. ISSR-маркер позволяет установить специфичность аллельного профиля, обусловленную специфичностью генотипов радужной форели, выращиваемой в аквакультуре Республики Карелия.

В дальнейшем изучение различий между профилями аллельной специфичности в двух группах форели при помощи ISSR-маркеров позволит дифференцировать популяции финского и американского происхождения и индивидуальных особей в процессе селекции.

В настоящем исследовании мы обнаружили, что форель камлоопс американского и финского происхождения демонстрирует значительные генетические различия, что подтверждается вариабельностью длин фрагментов ДНК и уровнем гетерозиготности. Это соответствует ранее установленным данным о способности породы успешно адаптироваться к различным условиям содержания (41, 42).

Уровень гетерозиготности (0,710 для финской и 0,850 для американской популяции) коррелирует с ранее полученными данными о высокой эффективности выращивания этой породы. Более высокий показатель у американской популяции может объяснять лучшие производственные характеристики.

Данные о высокой частоте уникальных генотипов (50 % в обеих популяциях) дополняют информацию о биологических особенностях породы камлоопс: о более высокой эффективности использования корма, большем валовом приросте, более высокой прибыли при выращивании (на 82,3 % выше по сравнению с обычной радужной форелью, не входящей в породную группу) (43, 44)

В заключение следует отметить, что наши результаты не только подтверждают ранее установленные преимущества породы камлоопс, но и предоставляют новые данные о ее генетическом разнообразии, что имеет важное значение для дальнейшей селекционной работы и оптимизации производственных процессов в аквакультуре (45). Для более полного понимания генетической структуры породы рекомендуется проведение дополнительных исследований с включением большего числа популяций и использованием современных методов генотипирования.

Итак, в геноме радужной форели финского и американского происхождения, выращиваемой в Республике Карелия, с помощью праймеров (CTC)6G, (GAG)6C и (ACC)6G обнаружено от 10 до 12 фрагментов ДНК, расположенных между микросателлитами. При исследовании генетической структуры обнаружено преобладание фрагмента участка ДНК размером от 260 до 630 п.н. у особей финского происхождения и от 410 до 1030 п.н. у форели американской происхождения. У 100 % финской популяции с праймером (CTC)6G выявлены участки длиной 630-770 п.н. (локус 5) и участки длиной 770-900 п.н. (локус 6). У 100 % особей американского происхождения при использовании праймера GAG)6C отмечено преобладание участка ДНК размером 1702-2000 п.н. (локус 11). Почти 50 % особей радужной форели в обеих популяциях имели уникальные генотипы. Средний уровень гетерозиготности составил 0,71 для финской и 0,85 — для американской популяции, что указывает на разнообразие их генома. ISSR-праймеры были охарактеризованы как информативные для изучения генофонда радужной форели и мониторинга его состояния. Полученные генетические профили позволят осуществлять внутри- и межвидовую идентификацию, а также в будущем применить стандарты генофонда породы, разработанные и утвер- жденные в Российской Федерации. Использование ДНК-маркеров может быть полезным для мониторинга генетического разнообразия и инбридинга радужной форели в аквакультуре.