Генотоксический мониторинг морских лагун залива Петра Великого

В морских лагунах залива Петра Великого сформировались наиболее высокопродуктивные водные экосистемы, в состав которых входит ряд хозяйственно важных и ценных видов растений и животных. В связи с этим состояние уникальных экосистем морских лагун требует комплексных исследований, направленных на сохранение среды обитания гидробионтов. Экосистемы морских лагун характеризуются уязвимостью, они испытывают сильные воздействия внешних факторов среды и постоянно изменяются при незначительных колебаниях уровня моря. Это объясняется тем, что при функционировании любой приливно устьевой области формируется собственный режим сезонной и короткопериодной циркуляции вод и биогеохимических характеристик. Помимо этого, они в значительной степени подвержены антропогенному влиянию. Вариабельность абиотических факторов может изменять биодоступность и токсичность поллютантов. Концентрация большого количества органического вещества в этих акваториях обычно приводит к истощению кислорода, что неблагоприятно сказывается на гидробионтах.

В нашей работе мы провели генотоксический мониторинг морских лагун залива Петра Великого с использованием метода ДНК-комет

Ранее метод применялся только в медицинских исследованиях на клетках млекопитающих, но в середине 90-х гг. стал широко использоваться в экологическом мониторинге [6-10]. Данный подход служит для оценки раннего проявления повреждающего действия негативных факторов среды и, по своей сути, является сигналом возникновения угрозы развития патологических процессов. Основное преимущество метода заключается в его способности регистрировать повреждения на уровне отдельной эукариотической клетки практически любого происхождения. Для анализа образца методом ДНК-комет необходимо наличие всего нескольких тысяч клеток. Также привлекает быстрота проведения экспериментов и относительная простота лабораторного протокола.

Цель работы: выявить генотоксические эффекты среды обитания на степень повреждения молекулы ДНК жаберных клеток двустворчатого моллюска Corbicula japonica методом ДНК-комет.

Материалы и методы исследования. В работе использовали половозрелых особей (размер 30-34 мм) двустворчатого моллюска Corbicula japonica . Вид распространен в Японском море от Восточно-Корейского залива до западного побережья Сахалина. Обитает в солоноватых водах эстуариев рек, приморских лагун и озер, соединяющихся с морем протоками. Отбор моллюсков проводился в весеннее время при температуре воды примерно 14-15^оС в лагунах Лебяжья и Тихая водолазным способом (рис. 1). Выловленных моллюсков доставляли в лабораторию в течение 2-х часов. После 2-х дневной адаптации при температуре 16-18ºС проводили исследование степени повреждения молекулы ДНК жаберных клеток

C. japonica , обитающей в разных лагунах залива Петра Великого. В работе использовали щелочной вариант кометного анализа, адаптированного к морским организмам [2].

Исходя из классификации, предложенной Коллинзом с коллегами [5], клетки жабр моллюсков обитающих в лагуне Лебяжья, в большинстве, образуют кометы класса С1. Принад-

Рис. 1. Места сбора проб моллюсков: 1 – лагуна Лебяжья; 2 – лагуна Тихая

лежность комет к данному типу характерна для неповрежденных и жизнеспособных клеток. Кометы, формируемые клетками жабр корбикулы, населяющей устье реки Раздольная, можно отнести преимущественно к классу С3, что свидетельствуют о высоком уровне фрагментации молекулы ДНК. В таблице мы привели усредненные параметры полученных комет (доля ДНК в хвосте кометы – %DNAt, длина хвоста кометы – Lt), отражающие степень повреждения ДНК клеток жабр C. Japon-ica (см. таблицу).

Таблица. Основные параметры ДНК-комет клеток жабр моллюсков C. japonica, собранных в разных районах залива Петра Великого

Места сбора моллюсков	Lt	% DNAt
лагуна Лебяжья	36,25±14,92	20,79±8,40
Лагуна Тихая	91,18±38,1	40,90±12,05

Результаты и обсуждение. На рис. 2

представлены микрофотографии комет, формируемые клетками жабр С. japonica собранной с разных лагун залива Петра Великого (рис. 2). При визуальном анализе полученных изображений, видно, что молекула ДНК клеток жабр C. japonica собранной в лагуне Лебяжьей практически не имеет деструктивных изменений (рис. 2 а ), т.к. ДНК образует симметричное яркое ядро с незначительным количеством повреждений. В то же время, в клетках жабр моллюсков, отобранных в лагуне Тихая, молекула ДНК образует хорошо выраженные кометы, что, очевидно, обусловлено глубокой деградацией генома и миграцией низкополимер-ных фрагментов ДНК (рис. 2 б ).

Рис. 2. Микрофотографии комет, формируемые клетками жабр C. Japonica собранных с разных лагун залива Петра Великого: а – лагуна Лебяжья; б – лагуна Тихая

При анализе этих данных отчетливо видно, что в клетках жабр у животных собранных в лагуне Тихая, значения указанных параметров существенно выше, чем у животных обитающих в лагуне Лебяжья (см. таблицу). Для наглядности, полученные экспериментальные данные, из которых были рассчитаны усредненные значения (таблица), были представлены на рис. 3 в виде зависимости между % ДНК и длиной «хвоста» кометы. Этот вид бивари-антного распределения обычно используется для характеристики популяций и наглядно демонстрирует пределы значений параметров, характеризующих кометы, и их взаимосвязь. При этом доля ДНК, мигрирующей из ядра кометы, в клетках моллюсков, обитающих в лагуне Лебяжья, не превышает 10 и 15%, тогда как в клетках корбикул, полученных из лагуны Тихой, этот показатель для основной массы комет составляет 40-45%. Также обращает на себя внимание высокая вариабельность данных параметров, что свидетельствует о гетерогенности всех выборок комет и обусловлено влиянием негативных факторов среды. Похожая картина была отмечена авторами при аккумуляции кадмия клетками жабр C. japonica и Mizuhopecten yessoensis [2, 11].

На основе проведенного генотоксического мониторинга морских лагун, находящихся в разных районах залива Петра Великого, можно судить об уровне антропогенной нагрузки на водные экосистемы данных акваторий. Наши данные позволяют сделать вывод о том, что моллюски, обитающие в лагуне Тихая, находятся под давлением мощного антропогенного прессинга, т.к. практически 1/3 часть молекулы ДНК жаберных клеток имеет повреждения.

Рис. 3. Корреляция между % мигрированной ДНК (%DNAt) и длиной хвоста (Lt) комет, формируемых клетками жабр моллюсков обитающих в лагунах Лебяжья и Тихая

сопровождается эвтрофикацией водоема [1]. На это также указывает разрушенный периост-ракум моллюсков, населяющих данную акваторию, что говорит о неблагоприятных (кислых) условиях среды [4]. Следует отметить, что периостакум моллюсков, собранных в лагуне Тихой, разрушен не был.

Выводы: любое вмешательство человека в окружающую среду откладывает свой отпечаток на функционирование биологических систем. Наше исследование показало, что не только загрязнение водной среды, но и бездумная «перекройка» прибрежных акваторий определяют условия обитания гидробионтов. При этом неблагополучная среда обитания может инициировать серьезные нарушения в структуре молекулы ДНК, которые могут привести к возникновению мутаций и злокачественных трансформаций клетки. Учитывая исключительную роль генома в функционировании биологической системы, выявленные повреждения в структуре молекулы ДНК следует отнести к наиболее важным проявлениям неблагоприятного воздействия среды. Потенциальные экологические последствия такого влияния на отдельные особи могут реализовываться через нарушение динамики на популяционном уровне и уровне сообществ. Генотоксический мониторинг прибрежных акваторий с использованием метода ДНК-комет является объективным критерием оценки качества среды, так как позволяет фиксировать изменения на ранних этапах развития необратимых патологий.

Работа выполнена при поддержке гранта Правительства Российской Федерации № 11.G34.31.0010.