Гены и белки холодового шока у Vibrio cholerae различных серогрупп

Постоянное выделение Vibrio cholerae различных штаммов в процессе мониторинговых исследований из водных объектов на территории РФ представляет потенциальную опасность возбудителя для общественного здравоохранения [Москвитина и др., 2012; Носков и др., 2021]. При этом факты преимущественного выделения в ходе мониторинга штаммов вибрионов ctxAB – tcpA – О1 и неО1/неО139 серогрупп могут указывать на существование у этих культур дополнительных факторов, обусловливающих их персистенцию [Титова и др., 2015; Монахова, Архангельская, 2016]. Поскольку для большинства территорий Российской Федерации, в отличие от эндемичных по холере регионов, характерна низкая температура осенне-зимнего периода, то в число потенциальных детерминант персистенции могут входить факторы, обусловливающие выживание возбудителя при низкой температуре.

Микроорганизмы в целом однотипно реагируют на понижение температуры; адаптация включает в себя изменения в составе мембран, в механизме трансляции и транскрипции. Происходит индукция набора специфических белков, помогающих перестроить клеточный метаболизм [Barria, 2013]. Например, на модели Escherichia coli установлено, что понижение температуры приводит к синтезу ряда белков, называемых белками холодового шока (Csps). При этом протеины CspA, CspB, CspG и CspI играют главную роль в защите клетки при холодовом шоке. Кроме того, важно, что Csps придают организму способность адаптироваться к различным стрессам, таким как лишение питательных веществ, окислительный, тепловой, кислотный и антибиотический стрессы [Cardoza, 2021]. На этом фоне механизмы, обусловливающие устойчивость холерных вибрионов к низким температурам, изучены недостаточно. Показано существование у холерных вибрионов двух белков холодового шока, кодируемых генами cspA и cspV , причем эти генетические структуры присутствовали у токсигенных и нетоксигенных штаммов [Carroll et al., 2001; Datta, Bhadra, 2003; Заднова и др., 2014].

Ранее нами при изучении нуклеотидной последовательности ctxAB – tcpA – штамма Vibrio cholerae O1 20000 (GenBank: CP036500.1), выделенного из водоема Ростовской обл. в 2016 г., в составе второй хромосомы был идентифицирован дополнительный ген холодового шока сsh1 [Бородина и др., 2021]. Данный геном был использован в последующем как референс.

В последние годы значительно возросла возможность секвенирования полных геномов бактериальных изолятов. Использование этих данных открывает перспективы для нового понимания особенностей биологии бактериальных патогенов [Didelot, Parkhill, 2022].

Цель исследования – изучение распространения генов семейства холодового шока у холерных вибрионов О1, O139 и неО1/неО139 серогрупп различного происхождения по данным анализа полногеномных нуклеотидных последовательностей, полученных на базе ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора.

Материалы и методы

В работе использованы данные о 553 полногеномных сиквенсах штаммов Vibrio cholerae О1, О139 и неО1/неО139 из лаборатории «Коллекция патогенных микроорганизмов» ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора. Секвенирование проведено в ходе выполнения стратегической инициативы социально-экономического развития Российской Федерации до 2030 г. «Санитарный щит страны – безопасность для здоровья (предупреждение, выявление, реагирование)». Выборка была представлена 449 штаммами серогруппы О1, 18 штаммами О139, а также 86 штаммами неО1/неО139 серогруппы.

Библиотеку фрагментов ДНК готовили с использованием набора реагентов Nextera DNA Flex (Illumina, США) согласно инструкции производителя. Ампликоны метили с применением Nextera Index Kit (Illumina, США) также согласно инструкции. Секвенирование проводили на платформе MiSeq (Illumina, США) с набором реагентов MiSeq Reagent Kit v2. Сборка геномов осуществлялась программой Spades v. 3.15.4 [Bankevich et al., 2012]. Поиск генов проводился авторскими программами. Аминокислотные замены были вычислены с помощью модифицированного авторского скрипта [Герасименко, Водопьянов, Писанов, 2021]. Расчет статистических показателей был проведен с помощью Libre Office Calc. Необходимая информация о свойствах культур, месте и сроках их выделения получена из паспортов коллекционных штаммов.

Результаты и обсуждение

Первоначально установлено присутствие в выборке двух описанных ранее белков холодового шока, кодируемых генами cspA и cspV . Ген cspA присутствовал у 552 штаммов и отсутствовал лишь у одного штамма О1 серогруппы, ген cspV присутствовал у 548 культур и отсутствовал у пяти штаммов (три культуры О1 и два вибриона неО1/неО139). Полученные результаты согласуются с литературными данными о крайне широком распространении генов холодового шока cspA и cspV [Datta, Bhadra, 2003].

Ген холодового шока сsh1 , по данным биоинформационного анализа, относился к семейству CspA и был идентифицирован в 120 нуклеотидных последовательностях. 99 (22.0%) из изученных 449 штаммов О1 серогруппы содержали ген сsh1 . При этом 98 штаммов csh1 + имели генотип сtxAB – tcpA –. Из изученных культур 86 представляли вибрионы неО1/неО139 ( сtxAB – tcpA –), а 21 геном содержал ген сsh1 (24.4%). У представителей серогруппы О139 независимо от наличия генов сtxAB и tcpA отсутствовал ген сsh1 (табл. 1).

Таблица 1

Встречаемость генотипа csh1 + у штаммов Vibrio cholerae [Occurrence of the csh1 + genotype in Vibrio cholerae strains]

Серогруппы	Наличие гена csh1 , кол-во штаммов	Всего штаммов	Встречаемость, %
V. cholerae O1	99	449	22.0
V. cholerae O139	0	18	0.0
V. cholerae неO1/неO139	21	86	24.4
Всего	120	553	21.7

При анализе источника выделения csh1 + вибрионов серогруппы О1 установлено, что 300 штаммов были выделены из различных поверхностных водоемов Российской Федерации, при этом 94 из 99 имели в своем составе искомый ген (95.0%). Полученный результат, на наш взгляд, может быть объяснен очевидным селективным преимуществом csh1 + культур О1 серогруппы в водоемах по сравнению с csh1 – вариантами. Наиболее вероятно, что csh1 + варианты лучше переносят низкую температуру водоемов, характерную для нашей страны.

При анализе места изоляции csh1 + вибрионов неО1/неО139 серогруппы, выделенных из поверхностных водоемов, установлено, что из 23 штаммов 5 имели в своем составе искомый ген (21.7%). Отсутствие гена сsh1 у 18 изученных представителей серогруппы О139, несущих гены холодового шока cspA и cspV , можно рассматривать как отсутствие дополнительного эффективного фактора выживаемости в стрессовых условиях или наличии у данной серогруппы других факторов адаптации к холодовому стрессу. Данные предположения нуждаются в дальнейшей проверке.

При изучении первичной нуклеотидной последовательности гена csh1 у Vibrio cholerae О1 и неО1/неО139 была выявлена значительная вариабельность изучаемой структуры. При использовании в качестве референс-последовательности гена csh1 размером 213 нуклеотидов ранее изученный штамм Vibrio cholerae О1 20000 [Бородина и др., 2021], у вибрионов О1 и неО1/неО139 также установлена вариабельность нуклеотидной структуры. Общая длина гена у всех изученных штаммов была стабильна и составила 213 нуклеотидов, но в 17 позициях были выявлены замены: 17 (C→A), 20 (G→A), 74 (G→T), 77 (G→A), 83 (C→A), 105 (T→A), 112 (G→A), 113 (C→G), 122 (G→A), 143 (G→A/T), 144 (T→C), 153 (C→T), 165 (C→T), 166 (G→A), 183 (C→T), 197 (A→G) и 208 (G→A/C). В структуре протеина Csh1 размером 70 аминокислотных остатков было выявлено 12 замен, сформировавших в итоге 13 типов белкового продукта. При этом 68 геномов относились к референс-типу, белковая последовательность которых совпадала с последовательностью штамма Vibrio cholerae О1 20000. Замены аминокислот в позиции 38 (A→T), 70 (A→T) приводили к формированию мажорного типа 1 (35 структур). Остальные варианты были представлены в единичном количестве (табл. 2).

Таблица 2 Варианты белка, кодируемого геном холодового шока csh1 различных типов у Vibrio cholerae О1 и неО1/неО139

[Protein’s variation, encoded by variative csh1 cold-shock types of Vibrio cholerae O1 and nonO1/nonO139]

Кол-во штаммов	Тип Csh1	Замена аминокислоты белка Csh1, позиция
		6	7	25	26	28	35	38	41	48	56	66	70
68	референс	T	G	S	G	S	N	A	G	G	E	N	A
35	1	-	-	-	-	-	-	T	-	-	-	-	T
4	2	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	S	-
2	3	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	P	-
2	4	-	-	-	-	-	-	-	-	V	-	-	-

Окончание табл. 2

Кол-во штаммов	Тип Csh1	Замена аминокислоты белка Csh1, позиция
		6	7	25	26	28	35	38	41	48	56	66	70
2	5	K	-	I	-	-	-	-	-	-	-	-	-
1	6	-	D	-	-	-	-	T	-	-	-	-	T
1	7	-	-	-	-	-	-	S	-	-	K	-	T
1	8	-	-	-	D	-	-	-	-	D	-	-	-
1	9	-	-	-	-	-	-	-	-	D	-	-	-
1	10	-	-	-	-	-	K	-	-	-	-	-	-
1	11	-	-	-	-	Y	-	-	-	-	-	-	-
1	12	-	-	I	-	-	-	-	-	-	-	-	-

Поиск по базе данных NCBI позволил выявить 10 геномов Vibrio cholerae , содержащих в своем составе ген csh1 (табл. 3), совпадающий с таковым у штамма Vibrio cholerae 20000 (референс-тип). Примечательно, что превалирующие типы у штаммов из международной базы данных – минорные, по вышеприведенной классификации, типы 9 (замена G48D) и 12 (замена S25I). Например, доминирующий тип на территории США – 12, а на территории Гаити – 9. Один штамм от человека из Японии имел референстип, преобладающий среди штаммов нашей выборки. На наш взгляд, подобное различие может быть следствием влияния определенных условий внешней среды на возбудителя.

Таблица 3

Типы протеина Csh1 у штаммов из международной базы данных [Protein types of strains from the international database according to the csh1 gene]

Номер штамма в GenBank	Источник выделения	Страна	Мутации в белке Csh1	Тип белка Csh1
CP053807.1	вода	США	S25I	12
CP053745.1	вода	США	S25I	12
CP104357.1	-	США	S25I	12
CP104355.1	-	США	S25I	12
CP042300.1	-	Гаити	G48D	9
CP013013.1	-	Гаити	G48D	9
CP012997.1	вода	Гаити	G48D	9
CP010812.1	человек	Филиппины	A38T, A70T	1
AP024968.1	человек	Япония		референс

Анализ происхождения штаммов, несущих типовой белок Csh1 штамма Vibrio cholerae 20000 О1 (референс-тип) и первого типа, показал, что они преимущественно выявляются у штаммов серогруппы О1 (65 из 68 и 33 из 35 соответственно). При этом до 2000 г. выявлено 10 протеинов Csh1 референс-типа, а с 2001 по 2022 г. их число составило уже 55. Для мажорного протеина Csh1 первого типа была характерна иная динамика: до 2000 г. им обладало всего два штамма, далее следует своеобразный «провал», а начиная с 2011 г., этот тип идентифицирован уже у 31 штамма. Столь «взрывное» распространение протеина Csh1 первого типа может указывать на селективное преимущество, сообщаемое этим типом белка холодового шока. В этом случае 10 минорных типов белка Csh1, представленных одной или двумя последовательностями, можно рассматривать как фактор приспособления к температурным условиям места оби-тания/персистенции вибрионов путем вариационной изменчивости гена холодового шока. Это предположение отчасти согласуется с данными о выявлении протеинов Csh1 типов 9 и 12 у штаммов на территориях Гаити и США, для которых не характерны низкие температуры окружающей среды в противовес более «холодным» регионам.

Заключение

Исследовано 553 полногеномных сиквенсов штаммов Vibrio cholerae O1, О139 и неО1/неО139 на наличие генов холодового шока cspA , cspV и csh1 . Гены cspA и cspV присутствовали практически у всех изученных штаммов. Ген csh1 присутствовал у 99 штаммов серогруппы О1 из 449 изученных и у 21 культуры из 86 вибрионов неО1/неО139. Штаммов csh1+ генотипа среди представителей O139 серо-группы не выявлено. Обнаружены различные варианты гена csh1 , обусловливающие структурные различия белка холодового шока Csh1.

Учитывая, что 95% нетоксигенных штаммов О1 серогруппы, выделенных из различных водоемов, со- держат в себе ген холодового шока csh1, предполагается, что данный ген сообщает вибрионам селективное преимущество путем обеспечения выживания при низких температурах водоемов. Вместе с тем, это предположение относительно штаммов О139 и неО1/неО139 серогрупп требует дальнейших исследований на увеличенных выборках штаммов.

Вариационная изменчивость аминокислотной структуры протеина Csh1 является фактором приспособления холерного вибриона к изменчивым температурным условиям среды обитания. Не исключено, что эволюционно с геном холодового шока могут соседствовать и другие факторы, обеспечивающие персистенцию вибрионов. Данные положения нуждаются в дальнейшей проверке.