Гены резистентности бактерий к антибиотикам

Введение. Микроорганизмы способны продуцировать вторичные метаболиты, синтез которых зависит от определенных внешних условий. В отличие от первичных, основных метаболитов, вторичные – не являются необходимыми для вегетативного роста микроорганизмов. Один из классов вторичных метаболитов составляют антибиотики – микробные продукты, подавляющие различные метаболические процессы у других организмов. Первым из них был открыт пенициллин, благодаря обнаруженному в 1929 г. Александром Флемингом подавлению роста стафилококка грибом Penicillium notatum ( P. chrysogenum ) [1]. В 1943 году был обнаружен стрептомицин, в 1945 – хлортетрациклин и др. Эти открытия и разработка способов промышленного производства пенициллина положили начало эре антибиотиков [1, 2].

Наиболее важное применение антибиотики имеют в качестве противомикробных средств для лечения инфекционных болезней человека. Кроме того, их применяют как цитотоксические агенты против определенных типов опухолей, а также в ветеринарии, фитопатологии, пищевой промышленности (для консервации продуктов) и сельском хозяйстве (в качестве стимуляторов роста растений). Промышленное получение антибиотиков основано главным образом на применении мецилиальных грибов ( Aspergillaceae и других Moniliales ) и бактерий, в основном родов Streptomyces и Bacillus . Примерно 120 типов антибиотиков производится с помощью промышленного культивирования продуцентов, и, кроме того, разработаны способы получения свыше 50 подобных антибиотикам полусинтетических соединений, также нашедших применение в медицине. Годовой объем мирового производства антибиотиков на 2005 год превышает 100 тыс. т, и общая рыночная стоимость этой продукции оценивается в 5 млрд. долларов [1]. По оценкам BusinesStat, в 2014 г мировой объем продаж антибиотиков составил 566,8 тыс т, что на 23,5% выше уровня 2010 г. Рост продаж стимулирует производство антибиотиков в мире. В 2014 г объем их производства увеличился относительно 2013 г на 8,1% и составил 789,1 тыс т. [3].

Александр Флеминг в результате серии опытов также заметил, что бактериальные патогены могут быть устойчивы к пенициллину при его применении в течение короткого времени или в низких дозах. Еще до начала клинического применения пенициллина, в 1940 году появились первые сведения об обнаружении штамма кишечной палочки, устойчивой к пенициллину. Уже тогда стало известно, что причиной ее резистентности является способность к образованию ферментов, разрушающих пенициллин. Одними из первых информировали об устойчивости бактерий к антимикробным препаратам C.H. Rammelkamp, T. Maxon (1942), W.W. Spink, V. Ferris (1947), M. Barber (1961) [4].

J.W. James уже в 1957 г. назвал угрозу стафилококковой инфекции в больницах и родильных домах «стафилококковой чумой», а в конце 1960-х годов в одной из публикаций «Illustrated London News» появилось мнение, что «медицина может лишиться плодов своей победы в результате неправильного применения антибиотиков, которое приводит к инфекционно передаваемой микробами сопротивляемости лекарствам» [4].

Первые плазмидные бета-лактамазы описаны в начале 60-х годов среди грамотрицательных бактерий, вскоре после широкого внедрения аминопенициллинов. Они также быстро распространились среди представителей семейства Enterobacteriaceae и других грамотрицательных микроорганизмов в разных регионах мира. С 2001 г. Отмечено возрастание резистентности пневмококков к макролидам, которое в некоторых регионах Земного шара достигло 30 %. В соответствии с данными глобального микробиологического мониторинга (1997 г.) от 10,4 до 38,6 % внебольничных и госпитальных штаммов пневмококков устойчивы к макролидам. С конца 60-х и до середины 80-х годов прошлого века наблюдалось активное развитие бета-лактамных антибиотиков, в медицинскую практику внедряются карбокси- и уреидопенициллины, цефалоспорины трех поколений. По уровню и спектру антимикробной активности, фармакокинетическим свойствам они значительно превосходили аминопенициллины. Большинство цефалоспоринов II и III поколения проявили резистентность к бета-лактамазам широкого спектра. Однако уже в начале 80-х годов появились первые сообщения о штаммах с плазмидной локализацией детерминант устойчивости к этим антибиотикам [4].

Стафилококки остаются одним из ведущих факторов гнойновоспалительных и септических заболеваний. Конец ХХ века и начало ХХI ознаменовались тенденцией резкого увеличения роли коагулазоотрицательных (КОС) стафилококков, и в первую очередь эпидермального стафилококка, в возникновении гнойно-воспалительной патологии человека с поражением разнообразных органов и систем человеческого организма [5]. Штаммы S.аureus и S.еpidermidis в значительной доле случаев вызванных ими заболеваний резистентны к метициллину и, как следствие, обладают не только высокой перекрестной устойчивостью ко всем бета-лактамам, но и ассоциированной устойчивостью к антибиотикам других групп. Полирезистентность представляет собой очень серьезную клиническую проблему, так как существенно затрудняет выбор препаратов для эффективной, безопасной и длительной антибактериальной терапии [6].

Для преодоления разрыва между мировыми представлениями о том, насколько серьезна проблема сегодня и как может ухудшиться, если текущая тенденция не изменится, проведена оценка глобальных экономических издержек из-за устойчивости бактерий к противомикробным препаратам к 2050 году. Первоначальные исследования показали приблизительные прогнозы – значительные человеческие и экономические потери. Только от продолжающегося роста резистентности к 2050 году приведет к смерти 10 миллионов человек каждый год и снижению на 2% - 3,5% в валовом внутреннем продукте (ВВП). Это обойдется миру в 100 триллионов долларов [7].

Антибиотики как сигнальные молекулы. Почти все противомикробные препараты имеют химическое сходство с соединениями окружающей среды. А гены антибиотикорезистентности были найдены в вечной мерзлоте, что свидетельствует о возникновении резистентности задолго до способности человека синтезировать антибиотики [8].

Бактерии в естественных условиях образуют коммуникативные сообщества, включающие представителей разных таксонов, в которых и между которыми обмен информацией осуществляется посредством диффундирующих сигнальных молекул (diffusible signal molecules). Данные молекулы используются бактериями для:

• 1)    мониторинга своей популяционной плотности (the process of quorum sensing);

• 2)    защиты своей экологической ниши;

• 3)    координации своего поведения в отношении  каких-то

изменившихся условий внешней среды;

• 4)    «наблюдения» за другими коммуникативными сообществами.

Приобретение резистентности к какому-либо антибиотику ведет к изменению реакции бактерии на определенный сигнал. Антибиотикорезистентные мутанты бактерий, также, как и исходные чувствительные штаммы, реагируют на данный антибиотик. Но набор транскриптов у них иной, чем у исходных штаммов. Спонтанное приобретение резистентности способствует образованию других бактериальных экотопов [9].

Комбинации и последовательность терапии могут создавать условия, которые ограничивают динамику возникновения устойчивых мутантов. Эти стратегии основаны на принципе, согласно которому адаптация к одному классу противомикробных препаратов может иметь побочную чувствительность к другому, так что их скоординированное использование создает препятствия для возникновения и распространения резистентности [8].

Механизмы резистентности к антибиотикам.

Существуют следующие механизмы резистентности:

• 1)    модификация антибиотика / детоксикация. Например, резистентность к пенициллинам и цефалоспоринам. Она обусловлена наличием у бактерий ферментов пенициллиназ (бета-лактамаз), которые разрывают бета-лактамные связи в молекулах пенициллинов, приводя к образованию неактивных производных;

• 2)    уменьшение проницаемости стенки бактерий для антибиотиков;

• 3)    выкачивание антибиотика из клетки (эффлюкс сиситема). Выкачивание происходит быстрее, чем антибиотик поразит свои мишени;

• 4)    структурные изменения в молекулах, являющихся мишенями для антибиотика. При устойчивости к хинолам антибиотик не может связаться с измененной мишенью, а именно с ДНК-гиразой;

• 5)    продукция бактерией альтернативных мишеней, которые резистентны к ингибирующему действию антибиотика [9].

Гены устойчивости могут локализоваться как на хромосоме, так и на плазмиде, и на транспозонах. Также интегроны (мобильные элементы), захватывающие гены устойчивости к антибиотикам, являются одним из факторов распространения лекарственной устойчивости у бактерий [10].

Резистентность к аминогликозидам. Для защиты от данной группы антибиотиков бактериальной клеткой могут использоваться активный эффлюкс, модификация рибосомы, инактивация антибиотика. Первый идентифицированный плазмидный ген устойчивости к аминогликозидам armA . Известные на сегодняшний день гены – npmA, rmtA, rmtB, rmtC, rmtD , кодирующие метилазы. Метилазы делятся на классы в зависимости от типа катализируемых модификаций: AAC (ацетилтрансфераза), ANT

(нуклеотидилтрансфераза или аденилтрансфераза), APH (фосфотрансфераза), МЕТ (метилтрансфераза). Другие гены, также кодирующие трансферазы, содержат в названии описание фермента. Например, ген аас(6’) кодирует ацетилтрансферазу, которая модифицирует субстрат в 6’ позиции [11].

Резистентность к бета-лактамам . Основной механизм резистентности к бета-лактамам, используемый бактериями – это экспрессия бета-лактамаз. Данные ферменты делятся на сериновые и металлоферменты [11]. Кодирующие их гены находятся на плазмидах ( bla TEM, bla SHV , bla CTX-M – сериновые бета-лактамазы, bla VIM , bla IMP , bla SPM , bla_GIM – металлоферменты) [13].

Резистентность к хлорамфениколу. Основной механизм резистентности – ферментативная модификация антибиотика. Существует 2 типа генов, кодирующих ацетилтрансферазы хлорамфеникола (CATs) catA и catB . Также фенотип устойчивости к хлорамфениколу возможен благодаря эффлюкс системе. Наличие гена cmlA приводит к фенотипу устойчивости к флорфениколу и хлорамфениколу, а гена floR – только к флорамфениколу [11].

Резистентность к гликопептидам. Резистентность к ванкомицину возникает из-за модификации предшественника пептидогликана, к которому гликопептид проявляет низкую аффинность. Опосредующие резистентность лигазы кодируются генами vanA и vanB (опероны находятся на плазмиде и на хромосоме), vanC1, vanC2/3, vanD, vanE и vanG (до настоящего времени были найдены исключительно на хромосоме) [11].

Резистентность к стрептомицину. Устойчивость возникает благодаря работе ацетилтрансфераз (sat2-sat4) и других метилаз [11]. Устойчивость к стрептомицину у современных штаммов бактерий, как правило, определяется наличием генов strA-strB, кодирующие аминогликозидфосфотрансферазы и гена aadA, кодирующего аминогликозидаденилилтрансферазы [12].

Резистентность к макролидам-линкозамидам-стрептограмину В (MLS). Основной механизм устойчивости (MLS) связан с наличием РНК метилазы, которая кодируется генами erm . Этот фермент метилирует остаток аденина, что предотвращает связывание антибиотика и 50S субъединицы рибосомы. Другие 2 механизма – эффлюкс и инактивацию – кодируют гены msr, ere [11].

Резистентность к сульфаниламидам. Резистентность возникает из-за наличия генов на хромосоме (мутация в folP ) или на плазмиде ( sul1 и sul2 ) [11].

Резистентность к тетрациклину. Бактериями используется 3 механизма – эффлюкс система, рибосомальные защитные белки, ферментативная модифификация. Первый механизм кодируют 25 типов гена tet , 2 otr , 1 tcr , второй механизм -10 tet 1 otr , третий – 3 tet [11].

Современные методы изучения резистентности к антибиотикам . В последнее десятилетие благодаря появлению высокой пропускной способности полногеномного секвенирования (WGS) были сделаны существенные успехи в понимании динамики эволюции устойчивости к антибиотикам и ее распространения в бактериальных популяциях [8].

Поиск и изучение генов, ответственных за возникновение антибиотикорезистентности, помимо теоретического имеют также огромное практическое значение. Быстрое определение антибиотикорезистентности клинических штаммов микроорганизмов очень важно при выборе оптимального лечения пациентов. Методы поиска генов и мутаций, основанные на анализе ДНК, гораздо быстрее и точнее классических методов определения резистентности. Для быстрой детекции генов ферментов, отвечающих за устойчивость к различным антибиотикам, используют метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) [14].

Методы метагеномики и биоинформатики позволяют идентифицировать виды членов сообщества и оценить их относительные плотности, а также функциональные способности. Являясь сложной адаптивной системой, микробное сообщество демонстрирует свойства более высокого порядка, которые не присутствуют в отдельных микробах, но возникают из их взаимодействия. Предсказательные математические и компьютерные модели помогают выявить закономерности эволюции микробов и микробных сообществ, возникающие на генетическом уровне и распространяющиеся в дальнейшем на все прочие уровни функционирования микробного сообщества [15].

Заключение. Таким образом, проблему антибиотикорезистентности невозможно игнорировать или пытаться противостоять ей все более мощными противомикробными препаратами. Хотя и невозможно остановить адаптацию бактерий, но реально предсказать и направить ее. Благодаря скоординированным усилиям, разумному эпидемиологическому надзору, а также фундаментальным знаниям природы резистентности к антибиотикам возможно более эффективное и более долговременное использование противомикробных препаратов [8].