Гидрофобные свойства и пленкообразующая способность штаммов рода Pseudomonas, изолированных из разных экологических ниш

В природных экотопах основная часть микроорганизмов существует в виде ассоциаций, определяемых общим термином «биопленки»: пространственно и метаболически структурированных сообществ, расположенных на границе раздела фаз и заключенных во внеклеточный полимерный матрикс (Николаев, Плакунов, 2007). Развитие прикрепленных сообществ – одна из основных стратегий выживания бактерий не только в окружающей среде, но и в организмах инфицируемых хозяев (Ильина и др., 2006). Установлено, что многие хронические инфекции вызываются бактериями, растущими в виде биопленок (Радионович и др., 2006; Costerton et al., 1999).

Формирование микробных сообществ проходит несколько стадий развития. На первом этапе перехода от планктонной формы к прикрепленному состоянию происходит сначала обратимая, а затем необратимая адгезия к поверхности (Сидоренко, 2004). На этапе обратимого прикрепления действуют неспецифические физико-химические силы взаимодействия между молекулами и структурами на поверхностях микроорганизма и твердого субстрата (Николаев, Плакунов, 2009). Показатель гидрофобности является одной из ключевых характеристик клеточной поверхности, определяющий адсорбционную иммобилизацию микроорганизмов. Вместе с тем, диссоциативные варианты бактерий, отражающие различия/изменения в клеточной оболочке, могут значительно отличаться по гидрофобности и адгезивным свойствам (Милько, Егоров,

• 1996) . Ответить на вопрос, является ли гидрофобность свойством, определяющим исход неспецифического взаимодействия, представляется возможным по конечному результату – эффективности формирования биопленок разными штаммами.

Цель данной работы – изучение гидрофобности и пленкообразующей способности различных представителей рода Pseudomonas .

Материалы и методы исследования

В работе использовали 16 штаммов почвенных бактерий рода Pseudomonas (I группа) и 11 изоля-тов Pseudomonas aeruginosa (II группа) , выделенных из различного клинического материала.

Гидрофобность клеток оценивали по относительному распределению между водной фазой и фазой органического растворителя гексадекана (Коваленко и др., 1998; Rosenberg et al., 1980). Для этого к суспензии клеток (3 мл), термостатированной в течение 15 мин при 35°С, добавляли гексадекан (0.2 мл, 0.5 мл), интенсивно встряхивали в течение 1 мин, затем снова термостатировали в аналогичном режиме и регистрировали изменение оптической плотности в водной фазе при λ = 590 нм. Среднее значение относительного изменения (в %) оптической плотности клеточной суспензии в водной фазе по сравнению с ее первоначальной величиной служило мерой гидрофобности бактериальных клеток. Расчет осуществляли по форму-

ле: % гидрофобности = (А с – A г ) / А с х 100, где А с – ОП 590 суспензии до обработки гексадеканом, A г – ОП 590 суспензии после обработки гексадеканом.

Образование биопленок изучали на поверхности 96-луночной полистироловой планшеты согласно И.А. Шагиняну (Шагинян и др., 2007). Суточные бульонные культуры в разведении 1/100 инокулировали в лунки по 150 мкл в 4-х повторах. После 24-часовой инкубации при 37°C содержимое лунок (планктонную культуру) аккуратно удаляли, пленки окрашивали 0.1% раствором генци-анвиолета (170 мкл в лунку) в течение 45 мин. Затем после 3-кратного промывания в лунки для экстрагирования краски добавляли по 200 мкл 96% этанола. Уровень экстракции (абсорбции) генци-анвиолета этанолом измеряли на спектрофотометре Ultrоspec 3300 при длине волны 580 нм в единицах оптической плотности (Ед, ОП 580 ). Степень пленкообразования соответствовала интенсивности окрашивания содержимого лунок красителем. Пленкообразующими считали культуры, если значение ОП превышало контроль в 3 и более раз (ОП 580 ≥1.0), склонными к адгезии – в 2–3 раза (0.6≥ОП 580 <1.0), остальные оценивали как непленкообразующие. Контролем служили лунки с LB-бульоном (Луриа-Бертани) (ОП 580 ≤0.3).

Результаты и их обсуждение

Показатель гидрофобности клеточной поверхности псевдомонад из различных экологических ниш не превышал 25%, M±σ составила 5.9±3.2% – для «почвенной» группы и 9.5±7.2% – для «клинической». Этот показатель варьировал у разных штаммов в обеих группах, причем более значительно во II группе.

При сравнении показателя пленкообразования в обеих группах выявлено следующее. Высокую пленкообразующую способность чаще проявляли клинические изоляты (81.8%). Основную часть почвенных бактерий составили штаммы, «склонные к адгезии» (таблица).

Биопленка, образованная штаммом P. aeruginosa 3–4 (в инвертированном варианте, увеличение 1×1500)

Отмечено, что как гидрофильные по BATH-тесту штаммы P. aeruginosa (в фазу гексадекана из водной фазы экстрагировалось не более 5–8% клеток), так и более гидрофобные псевдомонады (экстрагировалось до 24.2%) проявляли высокую пленкообразующую способность, т.е. не было обнаружено четкого взаимного соответствия между гидрофильно-гидрофобными свойствами клеточной стенки бактерий и степенью пленкообразова-ния. Учитывая, что псевдомонады разных видов подвергаются расщеплению на диссоцианты R-, S- и M-типов (Милько, Мартынкина, 1996), изучаемые штаммы были разделены по доминирую-щиму морфотипу колоний при росте на LB-агаре. Различные представители рода Pseudomonas формировали колонии преимущественно S-типа. Среди почвенных штаммов выявлены все три варианта, в то время как R-штаммы в группе клинических изолятов отсутствовали.

Прослежена взаимосвязь анализируемых показателей среди штаммов с разными морфотипами колоний. Оказалось, что гидрофобность клеток S-штаммов варьировала в широких пределах: выявлены как максимальные для данной выборки, так и нулевые показатели коэффициента гидрофобности. Клетки М-вариантов практически не переходили из суспензии в гексадекан (M±σ – 3.6±2.5%). Бактерии R-типа, изолированные из почвы, устойчиво проявляли гидрофобные свойства с минимальным разбросом показателей коэффициента гидрофобности. Важно подчеркнуть, что только для R-штаммов отмечена прямая зависимость между показателем гидрофобности и пленкообразо-ванием. В то же время, клинические штаммы с М-морфотипом колоний и низким коэффициентом гидрофобности все были отнесены к пленкообразующим. Как почвенные, так и клинические S-изоляты были вариабельны по обоим признакам.

Заключение

Псевдомонады относятся к убиквитарным микроорганизмам, которые отличает популяционная гетерогенность, обусловливающая возможность вида выжить практически в любых местах обитания. Такая вариабельность выявлена и по гидрофобности клеточной поверхности, и по пленкообразующей способности в обеих изученных группах, хотя у почвенных изолятов средние отклонения этих показателей были минимальными. По-видимому, это связано с относительно более постоянными условиями обитания бактерий в природных экосистемах, где отсутствуют агрессивные факторы, имеющие место в условиях ЛПУ (антибиотики, дезинфектанты, смена хозяина и др.).

Как показали наши исследования, закрепление этих микроорганизмов на поверхности и ее дальнейшая колонизация далеко не всегда детерминируется гидрофобностью клеток. Очевидно, что относительно низкую гидрофобность клеточной по- верхности у псевдомонад могут компенсировать P. aeruginosa и т.п. Это объясняет высокую плен-другие факторы адгезии, в том числе пили, жгути- кообразующую способность М- и S-вариантов. ки, альгинат, гемагглютинин, экзоэнзим S – для

Гидрофобные свойства и пленкообразующая способность штаммов рода Pseudomonas

Штаммоспецифичность показателя гидрофобности и независимо от этого высокая пленкообразующая способность клинических штаммов (особенно М-типа) еще раз указывает на высочайшую пластичность P. aeruginosae, способных устойчиво сохранять наиболее выгодный в конкретной экологической нише признак. Вместе с тем, можно полагать, что у природных штаммов доминируют механизмы неспецифической адгезии, а у клинических – фактором, определяющим колонизацию и пленкообразование в биотопах макроорганизма, служит специфическая адгезия. Сочетание этих двух механизмов обеспечивает выживание псевдомонад в нозокомиальных условиях.