Гистологические изменения структур переднего фасциального пространства голени при её удлинении на уровне верхней трети

Большинство экспериментальных исследований, посвящённых удлинению голени методом дистракционного остеосинтеза, решало задачу определения оптимального для остеогенеза и состояния мягких тканей суточного темпа и дробности дистракции, что потребовало разработки стандартной экспериментальной модели, которая предусматривала нарушение целостности кости с сохранением содержимого костно-мозговой полости и формирование дистракционного регенерата на уровне середины диафиза большеберцовой кости [4]. В клинике методом выбора является технология удлинения на уровне верхней трети голени, которая, по мне- нию клиницистов, позволяет создать оптимальные условия для формирования костного регенерата. Проблема полноценного восстановления функции конечности после удлинения была и остаётся актуальной. Её решение невозможно без изучения закономерностей структурной реорганизации нервов, сосудов и мышц в экспериментальных исследованиях.

Цель работы – выявить особенности структурных изменений передней большеберцовой мышцы, одноимённой артерии и глубокой ветви малоберцового нерва, иннервирующей эту мышцу, при удлинении голени на уровне верхней трети.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперимент проведен на 7 беспородных собаках обоего пола с массой тела 11-20 кг, в возрасте 3-5 лет. Собаки содержались в виварии, оперативные вмешательства и эвтаназию осуществляли в соответствии требованиями Министерства здравоохранения Российской Федерации к работе экспериментально- биологических клиник, а также «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей». Все манипуляции, проводимые на животных, были рассмотрены и одобрены этическим комитетом. Оперативные вмешательства проводили в условиях операционной, под внутривенным комбинированным наркозом долотом производили остеотомию костей голени и осуществляли чрескостный остеосинтез аппаратом Илизарова. Через 5 дней после операции начинали дистракцию костных фрагментов в аппарате Илизарова с суточным темпом 1 мм, разделённом на 4 приёма (по 0,25 мм). После удлинения голени на 15-17 % и фиксации в аппарате в течение 30-35 дней аппарат снимали. Животные выведены из опыта в конце периода дистракции – Д28 (дистракции 28 дней, срок опыта 33 дня) и через 30 дней после снятия аппарата – БА30 (срок опыта 93-98 дней). Для морфологического исследования иссекали участки передней большеберцовой мышцы, одноимённой артерии и глубоких ветвей малоберцового нерва на уровне зоны удлинения. Материал фиксировали в смеси 2 % растворов глутарового и параформальдегидов на фосфатном буфере (рН 7,4) с добавлением 0,1 % пикриновой кислоты, после чего часть материала по стандартной методике заливали в парафин и изготавливали поперечные срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином, по методу ван Гизона, Харта и Массона в модификации Лилли. Для изготовления полутонких срезов другую часть материала постфиксировали в 1 % растворе тетраоксида осмия с 1,5 % красной кровяной солью и заливали в аралдит. Полутонкие срезы окрашивали метиленовым синим и основным фуксином. Световую микроскопию гистологических препаратов проводили на большом исследовательском микроскопе Opton, цифровые изображения получали на аппаратно-программном комплексе «Диаморф». По цифровым изображениям полутонких срезов проведены морфометрические исследования передней большеберцовой мышцы. При инструментальном увеличении 500× в выборке полей зрения, содержащей не менее 200 мышечных волокон, определяли численные плотности микрососудов и мышечных волокон, рассчитывали индекс васкуляризации (Iv). Измеряли средний ортогональный диаметр каждого мышечного волокна и строили гистограммы распределения мышечных волокон по диаметрам, в выборке от каждого опыта рассчитывали средний диаметр мышечных волокон (Dmv). Проверку статистических гипотез о различиях осуществляли с помощью параметрических и непараметрических критериев в программе AtteStat, версия 1.0 [1] в электронных таблицах Microsoft Excel 97.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В ходе эксперимента у 2 собак из 7 (№ 5143 и 5128 – табл. 1) произошло запрокидывание проксимального фрагмента остеотомированной большеберцовой кости, нарушавшее формирование костного дистракционного регенерата. Однако при взятии материала для гистологического исследования установлено, что во всех экспериментах передний сосудисто-нервный пучок голени сохранял анатомическую непрерывность.

При микроскопии микропрепаратов от животных, эвтаназированных через 28 дней дистракции, в 1 опыте из 4 выявлен обтурирующий тромбоз артерии на уровне дефекта её стенки (преимущественно адвентиции и медии), замещённого фиброзным рубцом. В зоне дефекта и в прилежащих участках медии имелись очаги регенерационной гиперплазии продольно ориентированных гладких миоцитов (рис. 1). Ещё у 2 собак выявлен синдром сдавления передней большеберцовой артерии, что доказывалось гиперваскуляризацией адвентиции, врастанием сосудов в медию и дегенеративными изменениями её мышечных элементов (рис. 2). Только у одной собаки из 4 на этом сроке наблюдения грубых патологических изменений сосудов не было. Определялись лишь микроскопические участки субинтимального фиброза, а также эласто-лиза и гиперплазии продольно ориентированных гладких миоцитов во внутреннем слое адвентиции.

У всех животных этого срока в поперечных срезах передней большеберцовой мышцы многие артерии перимизия имеют стенозированный или закрытый просвет, окружены отложениями колла- гена. Степень стенозирования определяется выраженностью повреждений интимы и субинтималь-ного слоя сосуда и репаративной реакцией на эти повреждения. Некоторые артерии в составе интимы имеют небольшое представительство веретё-новидных гладкомышечных клеток, непрерывную внутреннюю эластическую мембрану, незначительные очаги фиброза или скопления продольно ориентированных гладкомышечных клеток в составе субинтимального слоя (рис. 3, слева). Это свидетельствует о незначительных повреждениях эндотелия и субэндотелиального слоя. Другие полностью лишены эндотелия (рис. 3, в середине и справа); в участках с сохранившейся эластической мембраной у них сформирована неоинтима, представленная модифицированными гладкомышечными клетками, в участках с разрушенной эластической мембраной формируется миоинти-мальное утолщение, частично или полностью закрывающее просвет.

Во многих пучках мышечных волокон выражен фиброз перимизия и отдельных прослоек эндоми-зия, увеличено количество меж- и интрафасци-кулярных скоплений адипоцитов. Мионы имеют атрофичные контуры, встречаются пустые трубки базальных мембран мышечных волокон – следы их гибели. В каждом поле зрения имеются мышечные волокна с «ангулярными» контурами, свидетельствующие о наличии денервационных изменений. Вместе с тем, глубокие веточки малоберцового нерва и даже внутримышечные нервные стволики содержат малоизменённые нервные волокна.

Только в некоторых из них можно выявить признаки умеренно выраженного пенистого субпериневрального отёка (рис. 4, слева) и валлеровской дегенерации единичных нервных волокон. В опытах с признаками сдавления передней большеберцовой артерии мышца содержит участки с массовыми некротическими изменениями мышечных волокон. В двух других опытах доля некротизированных мышечных волокон и ядерных кластеров на месте атрофированных денервированных волокон (рис. 5, справа) не превышает 15 %. На продольных срезах часто встречаются мышечные волокна с нарушением периодичности поперечной исчер-ченности, частичным или полным её отсутствием, что свидетельствует о дезинтеграции сократительного аппарата.

Через 30 дней после снятия аппарата признаки сдавления передней большеберцовой артерии выявлены в одном опыте из трёх. В передней большеберцовой мышце у всех собак этого срока выражено утолщение и фиброз перимизия, периваскулярный фиброз, в некоторых пучках фиброз эндомизия. Просветы многих артерий перимизия сужены – либо за счёт гиперплазии медии, либо выражен интралюминальный стеноз в результате значительного развития миоинтимальных бляшек.

У всех собак этого срока большинство мышечных волокон имеют атрофические контуры, встречаются нормотрофические и «ангулярные» волокна, увеличено содержание экстра- и ин-трафасцикулярных адипоцитов (липоматоз). В большинстве мышечных волокон свойственная интактной мышце поперечная исчерченность восстановлена, но регулярно выявляются волокна с изменёнными тинкториальными свойствами: при окраске гематоксилином-эозином – в виде ослабления окрашивания гематоксилином в центральных участках мышечных волокон (рис. 5 слева), при окраске трёхцветным методом Массона – в виде голубовато-синей центральной части волокна при сохранении нормальной для мышечной ткани красной периферической части (рис. 5, справа). Эти изменения были наиболее выражены в опыте с признаками сдавления передней большеберцовой артерии и свидетельствовали о наличии денер-вационно-реиннервационного синдрома.

Рис.1. Фрагменты поперечных парафиновых срезов передней большеберцовой артерии собаки № 5027. Слева – гематоксилин-эозин, справа – Массон-трихром. Увеличение 120×

Рис.2. Фрагменты поперечных парафиновых срезов передней большеберцовой артерии собаки № 5128. Слева – гематоксилин-эозин, увеличение 120×, справа – окраска по ван Гизону, увеличение 480×

Рис.3. Фрагменты поперечных парафиновых срезов передней большеберцовой артерии собаки № 5152. Слева и в середине – Массон-трихром, увеличение 120×, справа – гематоксилин-эозин, увеличение 480×

Рис. 4. Фрагменты поперечных парафиновых срезов передней большеберцовой мышцы собаки № 5207. Слева – окраска гематокси-лином-эозином, увеличение 120×, справа – окраска по ван Гизону, увеличение 1200×

Рис. 5. Фрагменты продольного и поперечного парафиновых срезов передней большеберцовой мышцы собаки № 5151. Слева – окраска гематоксилином-эозином, увеличение 120×, справа – Массон-трихром, увеличение 1200×

По данным морфометрии мышц (табл. 1), в конце периода дистракции во всех опытах наблюдается уменьшение среднего диаметра мышечных волокон и снижение индекса васкуляризации мышцы. Последнее более выражено в опытах со сдавлением передней большеберцовой артерии (коэффициент корреляции Пирсона -0,78).

Через 30 дней после снятия аппарата средний диаметр мышечных волокон достоверно увеличивается по сравнению с предыдущим сроком и в одном опыте не отличается от интактной нормы. Однако распределение мышечных волокон по диаметру именно в этом опыте имеет свойственный денервированным мышцам бимодальный характер. Кроме того, в этом опыте остаётся сниженным индекс васкуляризации, в то время как в двух других васкуляризация мышцы по сравнению с предыдущим сроком существенно возрастает, хотя остаётся достоверно меньшей, чем в интактной мышце. Имеется сильная отрицательная корреляционная связь степени повреждения передней большеберцовой артерии с индексом васкуляризации мышцы, а также выраженности нарушений иннервации с индексом васкуляризации мышцы (коэффициент корреляции Пирсона -0,99).

Таблица 1

Экспертная оценка изменений передней большеберцовой артерии, нарушений иннервации и данные морфометрического анализа передней большеберцовой мышцы в сопоставлении с интактной нормой

Срок/опыт	A.tibialis	Нарушения иннервации	Dmv (M±SD)	Iv (M)
Д28/№ 5152	Без грубых патологических изменений	++	29,91±11,92**	0,74**
Д28/№ 5027	Механическое повреждение, тромбоз	+	25,44±7,54**	0,72**
Д28/№ 5128	Сдавление II	++	31,8±11,05**	0,68**
Д28/№ 5143	Сдавление II	+	19,15±9,09**	0,58**
БА30/№ 5075	Без грубых патологических изменений	+	36,7±12,9**	1,28*
БА30/№ 5076	Без грубых патологических изменений	+	32,2±8,69**	1,21*
БА30/№ 5151	Сдавление II	+++	41,1±8,69	0,76**
Интактная			43,4±6,51	1,40

Примечание: *- статистически значимые отличия от интактной мышцы на уровне значимости 0,05, ** - на уровне значимости 0,01.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Известно, что саркомерогенез, обеспечивающий удлинение и продольный рост мышечных волокон в процессе дистракционного остеосинтеза, не сопровождается признаками повреждения мышечных волокон только при очень низком суточном темпе дистракции – 0,4-0,7 мм [7].

В экспериментах с удлинением голени собак на уровне средней трети диафиза доля деструктивно изменённых мышечных волокон в конце дистракции составила 9,6 % [2], однако была прослежена весьма высокая сохранность проводниковой части большеберцового нерва [6], в том числе при удлинениях более 15 % исходной длины голени [3], что определялось адаптационным ростом и дифференцировкой эпи-периневрия и усилением периневрального морфофункционального барьера [5].

Полученные в данном исследовании результаты свидетельствуют, что при удлинении голени собак на уровне верхней трети во всех опытах наблюдаются денервационные изменения мышечных волокон, но сохранное состояние глубоких веточек малоберцового нерва и внутримышечных нервов в совокупности с выраженными изменениями артерий перимизия и снижением численной плотности микрососудов заставляет предположить, что они носят вторичный характер. По-видимому, главным фактором денервации является ишемизация концевых разветвлений нервов, лишённых периневрия.

В опытах с удлинением голени собак на уровне средней трети при таком же режиме дистракции (1 мм за 4 приёма) развивалась гиперваскуляризация передней большеберцовой мышцы [2]. В данном исследовании – при удлинении на уровне верхней трети голени – индекс васкуляризации передней большеберцовой мышцы снижался по сравнению с интактной нормой в 2 раза и более. Очевидными причинами явились гемодинамические повреждения и стенотическое ремоделирование артерий перимизия, а также изменения передней большеберцовой артерии, соответствующие синдрому сдавления II степени по классификации S.J.Nayler, L.J.Levien, K.Cooper [7], который выявлен в трёх опытах из семи (42,9 %). Предполагаемая анатомическая предпосылка этих изменений – особенности топографии передней большеберцовой артерии, а именно, её расположение под углом к оси большеберцовой кости и направлению тяги при дистракции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Удлинение голени на уровне верхней трети повышает вероятность развития ишемических и денервационных изменений мышц, поэтому в плане возможностей восстановления функции конечности представляется менее выгодным, чем удлинение на уровне средней трети диафиза.