Гистологический краситель на основе антоцианов ягод черноплодной рябины (Aronia melanocarpa)

Введение. Антоциановые красители широко используются в пищевой (кондитерской), косметической, фармацевтической, текстильной и кожевенной промышленности. Известно немало способов извлечения антоциановых пигментов из растительного сырья в промышленных масштабах [1, 2, 3, 4, 5]. Однако сведений об их использовании в гистологической практике очень мало. Впервые основной краситель на основе антоцианидинов дельфинидина и цианидина был получен из ягод черники М.Д. Лавдовским в 1887 году [6]. В 2004 году был запатентован способ приготовления гистологического красителя из покровной чешуи луковиц лука, содержащей кверцетин, который наряду с антоцианидинами относится к флавоноидам [7]. В 2014 году нами был предложен способ получения красителя на основе свекольного сока, содержащего антоцианы и бетацианины [8].

Антоцианы представляют собой водорастворимые флавоновые гликозиды, которые при гидролизе распадаются на глюкозу и безуглевод-ный остаток – аглюкон. Последний также известен как антоцианидин, и относится к пироксониевым основаниям. Антоцианидины придают окраску розовым и красным сортам винограда, плодам вишни, черешни, черники, черноплодной рябины и др. Основными антоцианами ягод черноплодной рябины являются цианидин-3-галактозид, цианидин-3-арабинозид и, в меньшей степени, цианидин-3-глюкозид и цианидин-3-ксилозид [2]. В связи с тем, что агликон флавоноидов черноплодной рябины растворим в спирте, для выделения её антоциановых пигментов в качестве экстрагента чаще используют этиловый спирт или его смесь с водой [4]. Поэтому в настоящей работе для получения гистологического красителя мы использовали концентрированный спиртовой настой плодов черноплодной рябины. Приготовление растительных красителей не обходится без вспомогательных веществ – протрав, в качестве которых чаще выступают металлы-комплексо-образователи. Атомы таких металлов должны иметь вакантные d-орбитали и служить хорошими акцепторами электронов. Красящие вещества, выступающие в роли лигандов, должны предоставлять пары для образования связей с метал-лом-комплексообразователем. В этом случае происходит «закрепление» красителя на тканях, и краска не вымывается. У антоцианов донором электрона служит гетероциклический атом кислорода, входящий в состав хроменилиевого цикла, который и является хромофором. В качестве протрав мы апробировали железоаммонийные и хромокалиевые квасцы, сернокислый магний и медный купорос.

Цель исследования - создать новый гистологический краситель на основе антоцианов ягод черноплодной рябины.

Материал и методы исследования. Свежие или засушенные ягоды черноплодной рябины разминают в ступке и плотно укладывают в стеклянную ёмкость. Затем заливают 90% этиловым спиртом и настаивают 2-3 дня. Затем выкладывают содержимое в марлю и отжимают. Полученную выжимку сливают в отдельную чистую посуду, плотно закрывают крышкой, оборачивают фольгой для исключения воздействия света и хранят при комнатной температуре до процедуры окраски. Непосредственно перед гистологическим окрашиванием в 50 мл полученного спиртового настоя добавляют 1.5 - 2 грамма сернокислого магния, либо такое же количество медного купороса, тщательно размешивают (5-7 минут) и фильтруют через обеззоленные фильтры. Значение рН полученного красителя находится в интервале от 0 до 1. При употреблении в качестве протравы/ закрепителя сернокислого магния предпочтительнее использовать краситель через 1-2 недели. В этом случае окрашивание будет более интенсивным. Если в роли вспомогательного вещества выступает медный купорос, то более интенсивную окраску можно получить при использовании свежего раствора. Следует отметить, что в обоих случаях отчётливое окрашивание базофильных структур будет присутствовать при употреблении как свежих растворов, так и при их повторном использовании через несколько недель.

Новый способ получения антоцианового красителя для гистологических исследований достаточно прост и практичен и в значительной степени отличается от более сложных технологий, предложенных для лёгкой промышленности [1, 2, 3, 4, 5]. В ранее описанных методах для экстрагирования антоциановых пигментов из растительного сырья помимо этанола, нагретого до 50-55 градусов [5], используют смесь воды и глицерина [3], горячую воду с подкислением лимонной кислотой [1] и даже глину [2]. Иногда осуществляют предварительное ацилирование, метилирование и алкилирование исходного сырья (например, обработка йодистым метилом [1]). С целью концентрации экстракты красителя упаривают в вакууме [1, 3]. Иногда в технологические схемы включают полимеры, например, поли-N-винилпирролидон, и сульфат аммония [5]. В предлагаемом нами способе приготовления красителя в качестве экстрагента используется 90% этиловый спирт при комнатной температуре, а для получения стойкого окрашивания добавляется небольшое количество либо сернокислого магния, либо медного купороса.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов получен ещё один гистологический краситель растительного происхождения. К его преимуществам стоит отнести доступность и

Рис. 1. Головной мозг крысы (а - нейроциты; б - нейроглия). Окраска красителем на основе антоцианов ягод черноплодной рябины. Ув. 600.

Рис. 2. Паренхима лёгкого крысы. Окраска красителем на основе антоцианов ягод черноплодной рябины. Ув. 600.

низкую себестоимость сырья, простоту приготовления раствора и процедуры окраски, а также применение нетоксичных ингредиентов и отсутствие необходимости нагревания красящих растворов. Специальных методов фиксации не требуется. Краситель используется для материала, зафиксированного в 10% растворе формалина.