Гистоморфометрическая оценка большеберцового нерва и мелких мышц стопы после внутреннего невролиза и аутогенной пластики большеберцовой порции седалищного нерва крыс

Повреждения нервов конечностей встречаются у 2,8-10 % [1, 2] травматологических больных. Такие пациенты требуют более длительной госпитализации и реабилитации, чем при травмах без повреждений нервов [3], так как денервация мышц и покровных тканей вызывает потерю движений и расстройства чув-

ствительности [4], что значительно снижает качество жизни пациентов.

Степень повреждений нервов варьирует от незначительного сдавления до полного перерыва всех его структур [5], что определяет исходы и тактику лечения. Даже при полных анатомических перерывах периферических нервов нервные волокна могут спонтанно регенерировать через небольшой дефект или рубец [6], однако в большинстве случаев это не приводит к восстановлению функций. Поэтому при отсутствии признаков восстановления частично повреждённого нерва и при полных анатомических перерывах нервов показана хирургическая ревизия и реконструкция пучков нервных волокон с применением внутреннего невролиза и интерфасцикулярной аутопластики [7].

Внутренний невролиз применяется как подготовительный этап интерфасцикулярной аутопластики, а при сохранении непрерывности пучков нервных волокон выступает как самодостаточная операция [8, 9, 10]. Однако данные о влиянии внутреннего невролиза при компрессионной нейропатии на реиннервацию в эксперименте и клинике противоречивы [11-14], что актуализирует прицельное экспериментальное изучение влияния распучковывания интактного нерва на состояние его дистальных ветвей и иннервируемых мышц.

Большинство экспериментальных исследований нейрорегенерации выполнено на седалищном нерве крыс [15]. Их актуальность и клиническая релевантность определяется высокой частотой повреждений седалищного нерва при боевой травме [16], а также при ятрогенных повреждениях [17-20]. Однако в доступной литературе мы не встретили данных о влиянии внутреннего невролиза и интерфасцикулярной аутопластики седалищного нерва экспериментальных животных на состояние нервов голени и мелких мышц стопы. Поскольку медленный регенераторный рост аксонов, задерживая реиннервацию мышц, снижает эффективность восстановления функций [21], состояние дистальных отделов конечности при травмах нервов на уровне проксимальных сегментов особенно критично для восстановления функций.

Цель исследования – гистоморфометрическая оценка большеберцовых нервов и подошвенных межкостных мышц после внутреннего невролиза и аутогенной пластики большеберцовой порции седалищного нерва крыс.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование выполнено на 21 лабораторной крысе линии Wistar мужского пола в возрасте 8–10 месяцев (масса 360–420 г). Животные содержались в двухэтажных проволочных клетках с гладким днищем и подстилом из древесных стружек в контролируемых гигиенических условиях. Они имели свободный доступ к воде и стандартному корму. Эксперимент выполнен согласно Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, Директиве 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях, и СП 2.2.1.3218-14; ГОСТ 33217-2014; ГОСТ 33215-2014. Дизайн исследования одобрен этическим комитетом учреждения (протокол № 2 (57) от 17.05.18). 14 крыс составили две опытные серии. В опытных сериях перед операцией животным вводили внутримышечно гидрохлорид ксилазин и тиле-тамин/золазепам (0,8 мг и 0,4 мг на 100 г веса крысы соответственно) и состригали шёрстный покров в области правого бедра и голени. В операционной обрабатывали кожу йодно-спиртовой настойкой. В серии 1 («внутренний невролиз») остро-тупым способом через двуглавую мышцу бедра осуществляли внепроекцион-ный доступ к правому седалищному нерву на уровне средней трети бедра. Под операционным микроскопом (OPMI-6, Germany) с помощью острого сосудистого зонда и ножниц для иридэктомии выполняли выделение большеберцовой порции седалищного нерва путём эпифасцикулярной продольной эпиневротомии на протяжении 2 см, после чего рану послойно ушивали. В серии 2 после аналогичного доступа к нерву и его распучковывания резецировали участок большеберцовой порции длиной 6 мм, затем с применением микрохирургической техники (увеличение операционного микроскопа 8-16×, шовный материал калибра 9-0) резецированный участок вшивали in situ. Серию контро- ля составили 7 интактных крыс (возрастной диапазон 16-18 месяцев – соответственно возрасту оперированных крыс на момент эвтаназии – через 6 месяцев после операции).

Большеберцовые нервы иссекали, подвергали аль-дегидно-осмиевой фиксации и заключали в аралдит. Полутонкие срезы (толщина 0,5-1,0 мкм) изготавливали с помощью алмазных ножей на ультрамикротоме «Nova» LKB (Швеция), окрашивали метиленовым синим и основным фуксином. Подошвенные межкостные мышцы в области III плюсневой кости, иннервируемые подошвенным нервом, являющимся ветвью большеберцового нерва, фиксировали в 4 % растворе формалина, декальцинировали в смеси соляной и муравьиной кислот, обезвоживали в этаноле и заливали в парафин. Парафиновые срезы (5-7мкм) изготавливали на микротоме «Reichert» (Aвстрия), окрашивали трехцветным методом по Массону, гематоксилином и эозином. Микроскопию срезов и получение цифровых изображений осуществляли с помощью микроскопа «AxioScope.A1» и цифровой камеры «AxioCam» (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Германия).

В программе «ВидеоТесТ Мастер-Морфология, 4.0» определяли средние диаметры миелиновых волокон (выборка из 400-500 волокон у каждой крысы), их аксонов, коэффициент G (отношение диаметра аксона к диаметру волокна), толщину миелиновой оболочки, долю измененных миелиновых нервных волокон (в %), средние диаметры эндоневральных микрососудов, их просветов, толщину стенки и рассчитывали модифицированный индекс Керногана (отношение диаметра просвета к толщине сосудистой стенки), численные плотности миелиновых волокон и эндоневральных микрососудов в 1 мм2 площади среза. Строили гистограммы распределения миелиновых волокон по диаметрам (шаг – 1 мкм). С помощью программного обеспечения «Zen blue» (Carl

Zeiss MicroImaging GmbH, Германия) в полноцветных изображениях парафиновых поперечных срезов подошвенных межкостных мышц при увеличении ×400 измеряли средний диаметр каждого мышечного волокна (D, мкм), анализировали в среднем 200 волокон от одного случая. Строили гистограммы распределения волокон по диаметрам (шаг – 10 мкм). Определяли численную плотность микрососудов и мышечных волокон, рассчитывали индекс васкуляризации (Iv).

Статистическую обработку данных выполняли в компьютерной программе Attestat, версия 9.3.1 (разработчик И.П. Гайдышев, сертификат о регистрации в Роспатенте № 2002611109). С учётом значимых отличий распределения некоторых выборок от нормального, табличные данные представляли в виде медиан (Me) и квартилей (Q1; Q3). Для проверки статистических гипотез о различиях при попарном сравнении опытных серий между собой и с нормой применяли критерий Хи-квадрат, критерий Манна-Уитни, для выявления отличий функций распределения – критерий Смирнова.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Микроскопическое исследование поперечных по-лутонких срезов седалищных и большеберцовых нервов крыс серии 1 (внутренний невролиз) показало, что большинство миелиновых волокон, как и в интактных нервах, имело нормальную структуру, в некоторой части волокон отмечались демиелинизация либо утолщение, расслоение и неравномерная окраска миелина, а в отдельных волокнах – деформация и потемнение аксонов (рис. 1, а, б). В серии 2 (аутонейропластика) в трансплантате большеберцовой порции седалищного нерва, в большеберцовой порции дистальнее трансплантата, а также в большеберцовом нерве на уровне средней трети голени регенерировавшие миелиновые нервные волокна были более мелкими по сравнению с нормой и серией 1, некоторые волокна формировали регенерационные кластеры (рис. 1, в). В серии 2 в эн-доневрии чаще встречались фибробласты, макрофаги и тучные клетки, а также ядросодержащие профили миелиновых и безмиелиновых нервных волокон.

Анализ количественных показателей популяции миелиновых волокон большеберцового нерва (табл. 1) выявил в серии 1 снижение медианы их численной плотности по сравнению с нормой на 11,78 % (р = 0,041). Доля реактивно-деструктивно измененных волокон в серии 1 достоверно превышала норму на 3,19 % (р = 0,003). Медиана диаметров миелиновых волокон в серии 1 увеличена на 28,26 % (р = 0,002), медиана диаметров аксонов – на 9,22 % (р = 0,000), медиана толщины миелиновых оболочек – на 18,63 % (р = 0,000)

В серии 2 отличия от нормы имели противоположную направленность – численная плотность миелиновых проводников превышала норму на 34,36 % (р = 0,001) при достоверном снижении процента измененных волокон относительно нормы на 2,70 % (р = 0,000). Медиана диаметров миелиновых волокон уменьшена в сравнении с нормой на 52,00 % (р = 0,000), медиана диаметров аксонов – на 51,05 % (р = 0,000) и толщины миелиновых оболочек – на 52,94 % (р = 0,000) (табл. 1).

Рис. 1. Фрагменты поперечных эпоксидных полутонких срезов большеберцовых нервов крыс: а – интактный нерв; б – серия 1 (внутренний невролиз); в – серия 2 (аутонейропластика). Окраска метиленовым синим, азуром II и основным фуксином, ×500

Таблица 1

Численные и размерные характеристики миелиновых нервных волокон большеберцового нерва крыс в норме и опытных сериях Me (Q1; Q3)