Гистопатологии печени у плотвы (Rutilus rutilus ) и уклейки (Alburnus alburrnus) из р. Большой Черемшан

Различные патофизиологические нарушения могут быть выявлены у разных видов водных организмов, однако, именно показатели морфофизиологического состояния рыб чаще используются в диагностике последствий токсичного загрязнения вод в силу ряда причин. Рыбы являются типичными представителями водных экосистем и занимают верхнюю ступень в трофической системе водоемов. Они имеют длинный жизненный цикл, поэтому могут информативно отражать как последствия хронического загрязнения вод, так и стрессовые условия в периоды, предшествующие исследованиям [1]. Рыбы, как последнее звено в трофической цепи, способны накапливать в организме значительные количества токсикантов и принимать на себя основную тяжесть техногенной нагрузки, что приводит к сокращению их численности, ухудшению качественных показателей их популяций [2, 3].

Минеев Александр Константинович, доктор биологических наук, главный научный сотрудник.

Патоморфологические реакции клеток и тканей являются достоверным критерием оценки степени воздействия фактора окружающей среды, который негативно влияет на живой организм. Нарушения ткано-клеточного уровня организации дают представления о биохимических отклонениях, протекающих в организме, и способствуют пониманию механизма воздействия патогенного фактора [3].

Печень, выполняющая множество метаболических функций, в том числе и детоксикационную, является важнейшим гистофизиоло-гическим маркером состояния организма и его реакции на экологический фон [4].

В целом ряде исследований [5, 6, 7] у рыб разных возрастов и видовой принадлежности выявлены различные нарушения ткани печени, как под влиянием отдельных абиотических факторов, так и различных загрязнителей. Анализируя многочисленные работы [8, 9, 3] можно говорить о том, что под влиянием различных по происхождению загрязнителей (сырая нефть, пестициды, тяжeлые металлы и т. д.) у рыб обнаруживаются одни и те же типы гистопатологий печени: жировая дистрофия и некротические изменения [8, 9, 3], вакуольная дистрофия и пикноз ядер гепатоцитов [3], кариорексис ядер гепетоцитов, фиброз, гиперплазия желчных протоков [8, 9, 3], что свидетельствует о неспецифическом характере данных нарушений.

Р. Большой Черемшан, являющаяся одним из крупных левобережных притоков Куйбышевского водохранилища, испытывает определенный уровень хронической антропогенной нагрузки в районе таких крупных населенных пунктов как с. Чулпаново и г. Димитровград. При этом такие виды рыб как плотва и уклейка являются самыми массовыми аборигенными видами данного водотока и распределены равномерно на всем протяжении реки, что позволяет успешно использовать их в качестве модельных видов-индикаторов состояния окружающей среды. Таким образом, изучение морфофизиологического состояния печени данных видов рыб как индикатора уровня антропогенного воздействия на водную среду и являлось основной целью проведенного исследования .

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Ихтиологические исследования осуществлялись в летний период 2012 г. на всем протяжении р. Большой Черемшан, являющейся притоком Куйбышевского водохранилища первого порядка. Основной ихтиологический материал добыт при помощи набора крючковых снастей, гидробиологических сачков и ловушек в четырех створах реки (рис. 1): 1 – в устье реки (г. Димитровград), 2 –выше г. Димитровграда на 30 км, 3 – в районе пос. Новочеремшанск, 4 – в рай- оне с. Чулпаново. Для гистологических исследований отловлено 67 особей плотвы и 37 экземпляров уклейки – наиболее массовых видов рыб данного водотока. Распределение исследованных особей по станциям исследования являлось относительно равномерным (табл. 1).

Основную массу рыб, возраст которых определяли по отолитам, составляли особи в возрасте 2+, 3+ и 4+ [10]. Для гистологического анализа отбиралась печень рыб, как с признаками аномалий, так и лишенная внешних проявлений патологического процесса. Фрагменты печени сразу же фиксировались для того, чтобы задержать изменения, происходящие в тканях, изолированных от организма, и сохранить картину тканевой структуры, соответствующую исходному состоянию. Толщина фиксируемого фрагмента не превышала 1-1,5 см. В качестве фиксатора мы использовали смесь 40%-го формалина, 96%-го этилового спирта и ледяной уксусной кислоты. Обезвоживание и уплотнение гистологического материала производилось по стандартной методике [11] в этиловом спирте возрастающей концентрации, смеси 100%-го спирта и бензола, чистом бензоле и парафин-бензоле с последующей заливкой фрагментов в парафин. Серийные гистологические срезы изготавливались на салазочном микротоме МКБ–10, толщина их не превышала 8 микрон. Гистологические срезы окрашивались гематоксилином и эозином по стандартной методике с последующим заключением в канадский бальзам [11]. Ихтиотоксикологическое состояние рыб оценивали по пятибалльной шкале [7].

Рис. 1 . Расположение станций отбора ихтиогистологических проб в среднем и нижнем течении р. Большой Черемшан

Таблица 1. Распределение обследованных особей плотвы и уклейки из р. Большой Черемшан по станциям исследования

Вид рыб	Общее кол-во особей, экз.	Кол-во особей по отдельным станциям, экз.
		г. Димитровград	30 км выше по течению	с. Новочеремшанск	с. Чулпаново
Плотва	67	18	15	15	19
Уклейка	37	11	7	9	10

Снимки молоди рыб, гематологических и гистологических препаратов выполнены при помощи окулярной цифровой микрофотокамеры «Levenhuk C-Series» с разрешением C510 NG, бинокулярного микроскопа МБС–10 и микроскопа «Биолар».

Статистическую обработку полученных данных проводили общепринятыми методами [12] с применением программ Excel 2010, Statistica 12. Для графической иллюстрации результатов использовали программы: Statistica 12, Adobe Photoshop CS6, Paint.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Река Большой Черемшан – левобережный приток Куйбышевского водохранилища. Длина – 336 км (из них 160 км в Республике Татарстан), площадь бассейна – 11 500 км², средний расход воды в устье – 36,1 м³/с. Исток на Бугуль-минско-Белебеевской возвышенности. Питание снеговое. Весной река расходует 60–70 % годового стока. До 1970-х была судоходна, прекращено из-за обмеления. Песчаные берега реки почти на всем протяжении покрыты хвойными и смешанными лесами. В русле реки часты острова, перекаты, мели и рыбацкие заколы. Низовья реки затоплены при строительстве Куйбышевского водохранилища до города Димитровград [13].

Наблюдения за качеством реки проводятся в двух пунктах в среднем течении реки в районе пос. Новочеремшанск (2 створа) и в низовьях реки в районе г. Димитровграда (1 створ). В 2012 году, ежемесячно отмечаются превышения по легкоокисляемым (по БПК5) органическим веществам в диапазоне 1,2 ПДК – 3,2 Пдк, труд-ноокисляемым (по ХПК) органическим соединениям в диапазоне 1,2 ПДК – 3,9 ПДК, а также по соединениям меди в диапазоне 1,0 ПДК – 6,0 ПДК. весной отмечены превышения по нефтепродуктам на уровне 1,0 ПДК. По соединени- ям цинка превышение зафиксировано только в апреле – 6,5 ПДК. Превышения по марганцу находятся в диапазоне 4,1 ПДК – 22,9 ПДК. Максимальное превышение – 22,9 ПДК обнаружено в апреле, в период половодья. кислородный режим на протяжении всего года удовлетворительный [14].

В сложившихся экологических условиях у рыб из р. Большой Черемшан обнаружены четыре типа гистопатологий печени на фоне выраженной гиперемии у 13,4±4,19% особей плотвы и 16,2±6,14% уклейки (табл. 2), являющихся показателем хронической интоксикации особей под воздействием комплекса загрязняющих веществ, присутствующих в воде некоторых станций реки.

Печень, выполняющая множество метаболических функций, в том числе детоксикационную, является важнейшим гистофизиологи-ческим маркером состояния организма и его реакции на экологический фон. В обычных условиях печени свойственна высокая реактивность и большой резерв функциональной способности. При этом структура ткани печени выглядит однородной и равномерно окрашенной (рис. 2), а гепатоциты образуют ровные гексагональные печеночные дольки. В условиях патологии функции печени нарушаются, а морфологическим признаком этих нарушений являются различные дистрофии гепатоцитов, выявляемые у рыб [5, 15].

Визуальный осмотр печени исследованных рыб и последующий гистологический анализ показал, что у значительной части особей печень в различной степени гиперемирована (табл. 2), что свидетельствует об ее интенсивном функционировании. При этом гепатоциты и печеночные дольки на препаратах могут выглядеть деформированными, но отсутствуют признаки других патологий. Этот вид повреждений относят к нарушениям циркуляторного типа, которые

Таблица 2. Встречаемость особей плотвы и уклейки из р. Большой Черемшан c различными типами гистопатологий печени

Тип патологии печени плотва уклейка Гиперемия 13,4±4,19 16,2±6,14 Инфильтрация клеток крови в ткань печени 5,9±2,92 - Дисплазия гепатоцитов 5,9±2,92 16,2±6,14 Жировая дистрофия гепатоцитов 2,9±2,10 - Дегенерация кубического эпителия желчных проток 1,5±1,49 - обычно являются первыми признаками патологических процессов в органе, и по пятибалльной системе [7] оценивается как легкий, не угрожающий животным гибелью (2 балла).

Жировая дистрофия гепатоцитов (рис. 2.2а), зафиксированная только у плотвы рыб (табл. 2), также относится к дегенеративным (с разрушением клеток) типам изменений. Мелкие капельки жира обнаруживаются и в нормальных клетках печени, однако в патологических условиях накопление липидов резко увеличивается, что нередко обнаруживается у рыб в результате воздействия широкого диапазона поллютантов органической и неорганической природы, а также паразитарной инвазии [4]. Причинами дегенеративного ожирения органа могут выступать как нарушения обменных процессов, развивающиеся вследствие ограничения кровотока, так и действие токсичных веществ [6, 15]. Одной из причин дегенеративного ожирения органа является повреждение, вызванное воздействием токсинов, из которых наиболее сильнодействующими являются соединения мышьяка и фосфора [16]. Подобный эффект может аналогичным образом проявляться в разных внутренних органах, что объясняется способностью токсичных соединений изменять скорость окислительных процессов, влияющих на утилизацию жира, одинаково во всем организме, [17].

Дисплазия (некроз) гепатоцитов (рис. 2.3б, 2.4б), обнаруженный у обоих исследованных видов рыб (табл. 2), относится к наиболее серьез-

Рис. 2. Гистопатологии печени у рыб р. Большой Черемшан (окрашивание гематоксилином Вейнгарта и эозином):

1 - плотва, с. Чулпаново, гистологическая картина печени без патологий (х100) - гепатоциты образуют ровные гексагональные печеночные дольки, все клетки имеют ровные выраженные ядра и не имеют вакуолей; 2 - плотва, с. Новочеремшанск, (х40) - обширный очаг жировой клетчатки, заместивший большую часть гепатоцитов; 3 - плотва, с. Чулпаново (х100) - очаги инфильтрации клеток крови в ткань печени;

4 - плотва, г. Димитровград (х100) - нарушение структуры кубического эпителия желчного протока, а - деформация, дегенерация и дисплазия кубических клеток, б - некроз окружающих гепатоцитов, сопровождающийся пигментацией

ным патологиям и по степени тяжести для организма оценивается максимально – в 5 баллов. При некрозе отдельные гепатоциты или группы клеток теряют свою структуру в результате разрушения клеточной оболочки и внутренних структур. Скопления гепатоцитов, подверженных некрозу, выделяются на фоне специфического рисунка здоровой ткани печени в виде темных пятен с аморфной структурой. Микроскопическими признаками некроза являются изменения как клеточного ядра (кариопикноз, кариорексис, кариолизис), так и цитоплазмы гепатоцитов [15]. Наличие подобного типа патологии в любых внутренних органах является доказательством сильнейшего негативного внешнего воздействия на отдельную особь. Наличие некрозов всегда свидетельствует о тяжелом, обычно прогрессирующем течении патологического процесса, причинами которого выступают загрязнения вод тяжелыми металлами, либо паразитарные инвазии [18].

Инфильтрация клеток крови (2.3а), которая, как правило, предшествует дисплазии гепатоцитов, относится к воспалительным (связанным с иммунными процессами) типам изменений, так как некоторые виды лейкоцитов (нейтрофилы и эозинофилы) выполняют фагоцитарную функцию [4]. При инфильтрации различные клетки крови: эритроциты, эозинофилы, нейтрофилы, лимфоциты и т.д., инфильтруются из сосудов печени в пространство между гепатоцитами и печеночными дольками. Срез печени имеет ярко выраженный мраморный рисунок, так как сгустки клеток крови образуют в ткани темнокрасные образования в виде прожилок и пятен вдоль мелких кровеносных сосудов. По степени тяжести данная патология может оцениваться в 3-4 балла в зависимости от степени выраженности. Однако в наших исследованиях данная патология зарегистрирована только у плотвы.

Дегенерация кубического эпителия желчных протоков (рис. 2.4а) обнаружена лишь у одной особи плотвы из устьевого участка реки (г. Димитровград). В норме стенки желчного протока выстланы одним ровным слоем кубических клеток, окрашивающихся в темно-фиолетовый цвет и имеющих характерную кубическую или призматическую форму. В случае патологии клетки имеют неправильную форму (рисунок) и выстилают желчный проток неравномерно. Клетки могут располагаться как в несколько слоев, что мы называем разрастанием, либо отсутствовать в местах характерной локализации. В нашем случае наблюдается ещё и дисплазия части клеток кубического эпителия желчного протока (рисунок), что является результатом негативных воздействий на печень и последовавших дегенеративных процессов.

Согласно данным таблицы 3 наибольшее число особей с различными типами гистопатологий печени среди обоих видов рыб зафиксировано в районах наибольшей антропогенной нагрузки. Так, в устье русловой части реки в городской черте г. Димитровград среди плотвы 41,7% обследованных рыб имели такие нарушения, а среди уклейки данный показатель достигал 28,6%. Доля таких особей в популяциях обоих массовых видов рыб была значительной и в районе с. Чулпаново, где располагается действующий завод по производству сахара. В благополучных с точки зрения антропогенной нагрузки районах рыб с гистопатологиями печени не обнаружено, либо они встречены единично (табл. 3).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные ихтиологические исследования показали, что качество воды р. Большой Че-ремшан в двух створах (с. Чулпаново и г. Димитровград) находится в неудовлетворительном состоянии и это отрицательно проявляется на морфофизиологическом состоянии печени двух исследованных массовых видов рыб данного водотока – плотвы и уклейки. В данных экологических условиях у рыб обоих видов наблюдаются признаки хронического токсикоза. Согласно пятибалльной системе оценки ихтиотоксикологи-ческого состояния животных степень выраженности токсикоза соответствовала 2–5 баллам.

В то же время, на станциях, удаленных от крупных населенных пунктов, либо не испытывающих выраженной антропогенной нагрузки (с. Новочеремшанск, выше г. Димитровграда по течению на 30 км) у обследованных особей уклейки не обнаружено патологий печени, а у плотву такой экземпляр зафиксирован единично.

Таблица 3. Встречаемость особей плотвы и уклейки с гистопатологиями печени на обследованных станциях р. Большой Черемшан

Станция исследования	Доля рыб с гистопатологиями, %
	плотва	уклейка
с. Чулпаново (среднее течение)	15,0±8,19	16,7±11,25
с. Новочеремшанск (среднее течение)	4,8±4,76	0,0
30 км выше г. Димитровград (нижнее течение)	0,0	0,0
г. Димитровград (устье)	41,7±14,86	28,6±12,53

Примечание: 0,0 – особей с гистопатологиями печени не обнаружено

Наиболее вероятно, что основным фактором, обусловливающим патологические изменения печени рыб, является качество водной среды, учитывая уровень загрязнения реки в период исследования. В условиях хронического воздействия на гидробионтов целого комплекса поллютантов, способных как усиливать, так и нейтрализовать действие друг друга, любые гистопатологии печени, достаточно чувствительной к внешним негативным воздействиям, обнаруживаемые у особей массовых видов рыб можно успешно использовать в качестве надежного критерия экологического состояния водоема.