Гистотопография тучных клеток кожи ожоговой области в условиях применения молекулярного водорода

MOLEKULAR VODOROD QO‘LLANGANIDA KUYGAN HUDUD TERISI SEMIZ HUJAYRALARI GISTOPOGRAFIYASI

Maqolada molekulyar vodorod bilan boyitilgan suvni mahalliy qo‘llanganida kuyish joyidagi terini eksperimental o‘rganish natijalari aks ettirilgan. Kuyishning turli joylarida semiz hujayralarning (SH) gistotopografiyasi keltirilgan: perifokal zona alteratsiyaga eng moyili ekanligi aniqlandi. SH ning sekretor faolligi, yara jarayonining barcha bosqichlarida terining tolali tarkibiy qismi taqsimlashining o‘ziga xosligi aniqlandi.

Kalit so‘zlar: kuyish, semiz hujayralar, fibrillogenez, sekretor faollik.

Актуальность. Длительный период ожоговая травма и связанные с ней повреждения кожного покрова являются важной медицинской проблемой. Вопросы восстановления кожи при термической травме остаются актуальной задачей современной науки и клинической медицины. Исследования по проблемам полноценного восстановления разрушенных тканей при ожогах являются приоритетными в современной фундаментальной и прикладной медицине. [1]. Определение эффективности методов лечения возможно лишь после изучения морфологических особенностей регенерации кожи в условиях использования разнообразных методов местного воздействия. Бесспорным является тот факт, что качество жизни пациентов напрямую зависит от скорости и полноценности восстановления поврежденной кожи [2]. Регенерация тесным образом связана с состоянием внеклеточного матрикса соединительной ткани дермы. Помимо компонентов, обеспечивающих целостность кожи, экстрацеллюлярный матрикс включает в себя широкий спектр высокоактивных молекул, участвующих в морфогенезе тканевого микроокружения. Тучные клетки (ТК) способствуют формированию соединительнотканной основы, влияют на состояние внеклеточного матрикса посредством вырабатываемых биологически активных веществ. Однако, возможность ТК оказывать влияние на фибриллогенез при репаративной регенерации кожи вследствие термического повреждения в настоящий момент не изучено.

Целью исследования явилось: изучение распределения и секреторной активности тучных клеток и волокнистого компонента кожи на этапах репаративной регенерации вследствие ожоговой травмы. Оценка структурно – функциональной характеристики ТК с учетом зонирования области термического ожога на фоне применения молекулярного водорода.

Материалы и методы исследования. Эксперимент выполнен на 36 половозрелых белых крысах-самцах линии Wistar массой 190–220 г в НИИ экспериментальной биологии и медицины Воронежского государственного медицинского университета им. Н.Н. Бурденко. Животных содержали в стандартных условиях вивария, при 14-часовом световом режиме с неограниченным доступом к пище и воде. Манипуляции с животными проводили в соответствии с правилами, изложенными в приказе Минздравсоцразвития №708-н «Об утверждении правил лабораторной практики» от 23.08.2010 г. На проведение исследования получено разрешение локального этического комитета ВГМУ им. Н.Н. Бурденко (протокол №6 от 17.11.2016 г.). Исследуемых животных разделили на 2 группы: контрольную группу (n=18) с моделированием ожоговой раны без лечебного воздействия со спонтанным заживлением и экспериментальную группу (n=18) с использованием в качестве регионарного воздействия воды с повышенным содержанием молекулярного водорода, которой орошалась поверхность раны. Раствор молекулярного водорода готовили в соответствии с инструкцией производителя на установке aquela blue c использованием картриджа aquela 8.0. Концентрация водорода в используемом для орошения ран растворе достигала 4.0 ppm (измерение производили с помощью анализатора растворенного водорода МАРК-501, с датчиком водородным ДВ-501 (ООО «Взор», Нижний Новгород, Россия). Орошение ожоговой раны в соответствующих экспериментальных группах проводили ежедневно. Результаты оценивали на 3-и, 7-и 14-е сутки раневого процесса. Животных выводили из эксперимента путем передозировки средства для ингаляционной анестезии «Аерран» (Baxter Helthcare, США) на ветеринарной наркозной станции TEC – 3 Zoomed Minor Vet Optima (КНР). Экспериментальным животным термический ожог наносили под ингаляционным наркозом с помощью ветеринарной наркозной станции с испарителем ТЕС-3 Zoomed Minor Vet Optima (КНР). Для моделирования ожоговой травмы использовали портативную паяльную станцию термовоздушного типа марки Yihua 8858 (КНР). Ожоговую травму наносили путем экспозиции нагревательного элемента, разогретого до температуры 80°С, на расстоянии 10 мм от поверхности предварительно выбритого участка кожи в межлопаточной области животного в течение 40 секунд. Для морфологического исследования иссекали участок кожи с ожоговой поверхностью и прилежащими тканями. Образцы фиксировали в нейтральном растворе 10% формалина в течение 48-72 часов. Фиксированный материал подвергался процедуре пробоподготовки с заливкой в парафиновую среду с использованием гистологического процессора МТР SLEE (Германия). Из парафиновых блоков на ротационном микротоме Accu-Cut SRM 200 (Япония) готовили срезы толщиной 5 мкм для гистохимического анализа и 2 мкм для иммуноморфологического окрашивания. Для рутинного гистологического анализа проводили стандартное окрашивание гематоксилином и эозином. С целью исследования активности фибриллогенеза использовали раствор Гимзы. Для оценки солокализации ТК и волоконного компонента кожи проводили комбинированное окрашивание толуидиновым синим с импрегнацией серебром или иммуноморфологической детекцией триптазы ТК. После стандартной процедуры обезвоживания срезы заключали в постоянную монтажную среду. Планиметрическим методом определяли содержание тучных клеток на мм2 кожи. Тканевые структуры, в которых ТК не могли находиться в силу гистотопографических особенностей, удаляли из анализа. Подсчитывали общее количество ТК с метахромазией, определяли их секреторный профиль с учетом различных морфофункциональных состояний с помощью подсчета относительной частоты встречаемости различных механизмов секреции от общего количества ТК в относительных значениях (%).Морфологический анализ проводился на исследовательском микроскопе ZEISS Axio Imager.А2, оснащенном цифровой камерой Camera Axiocam 506 color при увеличении объективов на ×10, ×20 и ×40. Полученные фотографии обрабатывали с помощью программы ZEN 2.3 (Carl Zeiss,Germany). Проверку данных на нормальность распределения оценивали с помощью критерия Колмогорова–Смирнова. Для выявления достоверности различий использовался t-критерий Стьюдента в случае нормального распределения или непараметрический U-критерий Манна–Уитни при его отсутствии. Достоверными считали различия при p<0,05.

Результаты, обсуждение. В группе контрольных животных на 3-и сутки при спонтанном заживлении в дне раны определялся некроз тканей. Поверхность ожоговой раны покрыта струпом, состоящим из некротизированных элементов эпидермиса и дермы, пропитанных фибринозным экссудатом. Наблюдалась умеренная нейтрофильная инфильтрация. Зона поверхности ожоговой раны представлена бесструктурной эозинофильной массой, инфильтрированной лейкоцитами. При использовании водородной воды отмечалась схожая гистологическая картина, наблюдались некротические изменения, полнокровные сосуды, выраженная нейтрофильно-эозинофильная инфильтрация, рыхлый струп. После нанесения ожоговой раны количество ТК в коже возрастало в обеих группах во все сроки наблюдения. К 3-м суткам эксперимента эпидермальный слой клеток в области ожога практически отсутствовал, располагаясь лишь по краям фрагмента ткани. В контрольной группе обращал на себя внимание факт неактивного участия TK в процессах фибриллогенеза при морфологических признаках секреции. Лишь иногда можно было обнаружить признаки рыхлой сети тонких волокон в области секреции. Использование воды с повышенным содержанием молекулярного водорода приводило к более высокой численности ТК в коже. Они обладали интенсивной степенью секреции. Крупные TK, которые локализовались в перифокальной зоне, часто контактировали с сателлитными фрагментами цитоплазмы более мелких размеров, заполненных гранулами, между которыми определялись ретикулярные волокна. На 7-е сутки в группе спонтанного заживления в центральных участках ожога сохранялся сформировавшийся струп, который прорастал регенерирующий эпителий в виде надвигающегося вала. Подлежащая грануляционная ткань не зрелая с преобладанием фибробластов. TK располагались между пучками коллагеновых волокон. Некоторые их них представляли собой крупные фрагменты цитоплазмы или безъядерные участки клетки. При использовании водородной воды воспалительные процессы были менее выражены по сравнению со спонтанным заживлением, отмечались мелкие кровоизлияния и рыхлый струп. При спонтанном заживлении численность ТК была максимальной по сравнению с другими видами воздействия. К данному сроку слой эпителиальных клеток распространялся на зону термического повреждения с краев раны, иногда занимая практически половину пораженного участка. Примечательно, что непосредственно под раной ТК практически отсутствовали, располагаясь преимущественно в гиподерме. Тучные клетки, расположенные под эпителием, представляли собой мелкие формы с малым количеством секреторных гранул в цитоплазме, которые располагались преимущественно по периферии. ТК, расположенные ближе к гиподерме, представляли собой гораздо более крупные формы, с высокой степенью метахромазии, часто полностью заполненные гранулами. Следует отметить, что при использовании молекулярного водорода, TK часто формировали миграционные группы, которые располагались по определённой траектории в соединительнотканной основе кожи. При спонтанном заживлении на 14-е сутки эпителизация ожоговой поверхности не завершена, в центральных зонах ожога сохранились небольшие элементы струпа, под которыми очагово прорастал регенерирующий слой эпидермиса. В грануляционной ткани преобладали клеточные элементы над волокнистыми. Отмечалась наибольшая миграция TK в перифокальные области раны по сравнению с более ранними периодами заживления. При орошении раны водой, обогащенной молекулярным водородом, выявлялась наибольшая, по сравнению с контрольной группой, фибриллообразующая активность TK. Это происходило как в перифокальной области раны, так и вокруг нее, на значительном расстоянии от места повреждения. TK часто формировали группы, которые активно секретировали с помощью выведения отдельных гранул за пределы клетки. Тучные клетки иногда формировали крупные скопления на значительной площади, принимая активное участие в прямой или опосредованной регуляции ремоделирования дермы кожи. Гистотопографически TK локализовались по периферии зоны ожога, однако часть из них располагалась в зоне регенерации, под ожоговой поверхностью. При этом заметно возрастало участие TK в формировании коллагеновых волокон, в тесной функциональной связи с фибробластами и фиброцитами. При использовании водородной воды наблюдалась диффузная лимфоцитарная инфильтрация. Струп был плотным и истонченным. Отмечалось наплывание эпидермального пласта на раневую поверхность.

Исследование морфофункционального состояния популяции ТК показало, что моделирование ожога характеризовалось усилением дегрануляционной активности ТК, особенно при спонтанном заживлении. К 3-м суткам содержание ТК с дегрануляцией возрастало практически в 3 раза по сравнению с уровнем контрольной группы. В то же время, лекарственное воздействие снижало секреторную активность. К 7-м суткам эксперимента активность выведения компонентов секретома во внеклеточный матрикс была наиболее низкой при использовании молекулярного водорода. В то же время, количество свободно лежащих гранул при использовании воды с повышенным содержанием водорода было более высоким на 7-й и 14-й день эксперимента по сравнению с аналогичными показателями при использовании мази [3].

Заключение. В результате проведенного исследования установлено, что количество крупных тучных клеток с высоким содержанием секретома было наибольшим преимущественно на периферии раны. Секреторная активность тучных клеток на периферии раны приводила к системной реконструкции внеклеточного матрикса, способствуя устранению дефекта. Таким образом, участие TK в образовании внеклеточного матрикса и координации механизмов ремоделирования в случае спонтанного заживления нарастала от 3 суток эксперимента к 14 суткам наблюдения. Это достигалось как за счет увеличения интраорганного количества TK в дерме кожи, так и их активности в волокнообразовании. Процесс ремоделирования может рассматриваться как системная реакция, с использованием регуляторных свойств TK не только в зоне повреждения, но и окружающих областей нормальной кожи. Терапевтические эффекты молекулярного водорода проявлялись улучшением регенерации в области термического повреждения и перифокальной зоне с интенсификацией восстановления внеклеточного матрикса, опосредованные участием TK в ремоделировании внеклеточного матрикса дермы кожи. [4, 5].