Грамотрицательные галофильные бактерии - деструкторы ортофталевой кислоты

в частности, в отходах и избыточных рассолах соледобывающих производств (г. Березники, Соликамск, Пермский край). Обогащение и переработка калийных руд сопровождается использованием ряда реагентов, продуктами трансформации которых являются фталаты [Бачурин, Одинцова, 2006].

Фталаты и их метаболиты обладают гепатоток-сичными, канцерогенными свойствами, способны накапливаться в организме и признаны опасными для здоровья человека и животных [Куценко, 2002].

Способность к деструкции данных веществ обнаружена у ряда бактерий различных родов, в том числе Pseudomonas, Burkholderia, Sphingomonas, Arthrobacter , Rhodococcus [Liang, Zhang, Fang, 2008; Jin et al., 2010; Stanislauskienė et al., 2011]. Описан метаболический путь деструкции орто фталевой кислоты ( орто -ФК) грамотрицательны-ми штаммами (родов Pseudomonas, Burkholderia ) через цис -4,5-дигидро-4,5-дигидроксифталат и 4,5-дигидроксифталат до протокатеховой кислоты [Chang, Zylstra, 1998; Vamsee-Krishna, Mohan, Phale, 2006]. В то же время, биодеградация фталатов в средах с экстремальными физическими или химическими параметрами, в частности, при повышенном засолении среды, изучена недостаточно. В ряде исследований показано, что значительную долю культивируемых микроорганизмов гиперсоленых местообитаний составляют грамотрица-тельные бактерии классов Gammaproteobacteria и Alphaproteobacteria [Ventosa, Nieto, Oren, 1998; Oren, 2008] . В литературе представлены немного-

Таблица 1

Штаммы бактерий, выделенные из образцов шламов и донных отложений (г. Березники)

Образец	Штаммы	Типовой штамм ближайшего родственного вида и номер в базе данных GenBank	Сходство генов 16S рРНК, %
Донные отложения промышленных стоков, Промканал	PG2	Pseudomonas xanthomarina KMM 144T (AB176954)	100
Поверхность шламохрани-лища, БКПРУ-3	PSH17–1	Idiomarina fontislapidosi F23T (AY526861)	99.43
	PSH17-52	Martelella radices BM5-7T (KF560339)	96.72
Донные отложения рассо-лосборника, БКПРУ-3	PP22–31	Breoghania corrubedonensis UBF-P1T (CQ272328)	99.37
	B23	Alcanivorax dieselolei B5T (DSM16502)	100

Среды и условия культивирования. Для роста микроорганизмов использовали минеральную среду Раймонда (МСР) [Raymond, 1961] без NaCl и c добавлением 30–100 г/л соли. В качестве субстрата использовали орто-ФК или одно из следующих соединений (1 г/л): дибутилфталат (ДБФ), диэтилфталат (ДЭФ), протокатеховую кислоту (ПКК), бензоат, салицилат, нафталин. Для приготовления богатой среды Раймонда (БСР) в минеральную среду Раймонда добавляли 5 г/л триптона и 2.5 г/л дрожжевого экстракта в качестве росто- численные данные о способности бактерий данных классов (в частности, родов Alteromonas, Marinomonas, Marinovum) к росту на орто-ФК в условиях осмотического стресса [Iwaki, Nishimura, Hasegawa, 2012]. Не исследованы физиологические и молекулярно-биологические особенности деструкции фталатов данными бактериями. Такие исследования представляют интерес как для получения новых данных о механизмах солеустойчиво-сти, так и для разработки методов биоремедиации природных и техногенных экосистем с высоким засолением среды, загрязненных устойчивыми ксенобиотиками.

Цель работы – идентификация, физиологические и деградационные характеристики грамотри-цательных бактерий-деструкторов орто -фталата, выделенных из района солеразработок (г. Березники, Пермский край).

Материалы и методы исследования

Объекты исследования . Для проведения исследований из рабочей коллекции микроорганизмов лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии «Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН» было отобрано 5 штаммов грамотрицательных бактерий-деструкторов фталатов, выделенных из донных отложений водных объектов и поверхности шламохранилища, расположенных в районе добычи и переработки калийных солей (г. Березники, Пермский край) (табл. 1).

вых субстратов. Культивирование бактерий в жидких средах проводили при 28°С на термостатируемой качалке при 100 об/мин. Длительность культивирования – 2–7 сут.

Для получения агаризованных сред использовали агар («Helicon», Россия) до конечной концентрации 15 г/л. Культивирование микроорганизмов осуществляли в термостате при 28 ° С.

Рост бактерий на орто-фталате при разных концентрациях хлорида натрия. Ростовые характеристики бактерий изучали в периодической культуре в жидкой МСР с орто-ФК (1 г/л) в качестве субстрата в присутствии NaCl (30, 50, 70 и 90 г/л) и без соли в среде.

Культуры бактерий выращивали в колбах Эр-ленмейера объемом 250 мл (объем среды – 100 мл) при 28 ° С, с аэрацией на термокачалке при 100 об/мин.

В качестве инокулята использовали культуры в экспоненциальной фазе роста, выращенные на среде Раймонда, содержащей 3% NaCl, с орто -ФК в качестве субстрата.

Оптическую плотность (ОП) культуральной жидкости определяли на спектрофотометре UV-Visible BioSpec-mini («Shimadzu», Япония) при длине волны 600 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см.

Расчет удельной скорости роста (μ) и длительности lag -фазы (T l ) проводили по стандартным формулам [Нетрусов и др., 2005].

Рост бактерий при разных рН среды определяли при концентрации 3%-ного NaCl в буферных системах, приготовленных на основе БСР. Штаммы культивировались на чашках Петри на агари-зованной среде при рН 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0. Рост учитывали на седьмой день культивирования [Методы общей бактериологии, 1983].

Идентификацию бактерий проводили на основании анализа генов 16S рРНК. Амплификацию гена 16S рРНК осуществляли с использованием бактериальных праймеров 27F (5`-AGAGTTTGATC (A/C)TGGCTCAG-3`) и 1492R (5`-АСGG(C/T) TACCTTGTTACGACTT-3`) на амплификаторе My Cycler “Bio-Rad Laboratories” (США) согласно описанию [Lane, Stackebrandt, Goodfellow, 1991]. Определение нуклеотидных последовательностей проводили с применением набора реактивов Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v. 3.1 на автоматическом секвенаторе Genetic Analyser 3500XL “Applied Biosystems” (США) согласно рекомендациям производителя, в лаборатории молекулярной биологии и генетики при кафедре ботаники и генетики растений ПГНИУ. Филогенетический анализ полученных нуклеотидных последовательностей 16S рДНК осуществляли с использованием программ CLUSTAL W clustalw), Sequence Scanner v 2.0. Поиск гомологичных последовательностей проводили при использовании баз данных GenBank и EzTaxon .

Статистическая обработка результатов . Э ксперименты были выполнены в трехкратной повторности. Полученные данные обрабатывали с использованием стандартных пакетов компьютерной программы Microsoft Excel.

Результаты и их обсуждение

Идентификация штаммов-деструкторов орто-ФК

Отобранные для исследований грамотрица-тельные бактерии были выделены из образцов донных отложений и шламов района солеразработок методом накопительного культивирования в минеральной среде с добавлением 3%-ного NaCl и орто- ФК в качестве субстрата. Было показано, что все пять штаммов, обозначенные как PSH17-1, PG2, B23, PSH17-52 и PP22-31, были способны к эффективному росту в жидкой минеральной среде на орто -ФК (1 г/л) в качестве единственного источника углерода и энергии.

На основании проведенного анализа гена 16S рРНК три штамма были отнесены к классу Gammaproteobacteria филума « Proteobacteria »: штамм PSH17–1 имеет наибольшее филогенетическое сходство (99.43%) со штаммом типового вида Idi-omarina fontislapidosi F23^T , штамм PG2 – 100%-ное сходство с типовым штаммом Pseudomonas xanthomarina KMM 144^T, штамм B23 – 100%-ное сходство с типовым штаммом Alcanivorax dieselolei B5^T.

Два штамма отнесены к классу Alphaproteobacteria : штамм PSH17-52 показал наибольший уровень филогенетического сходства (96.72%) со штаммом Martelella radices BM5-7^T; и штамм PP22-31, наиболее филогенетически близкий типовому штамму Breoghania corrubedonensis UBF-P1^T (99.37%) (см. табл. 1).

Физиологические характеристики и способность штаммов расти на ароматических субстратах

Поскольку штаммы были выделены из донных отложений и шлама района солеразработок, была исследована способность штаммов к росту в условиях повышенной минерализации среды. Установлено, что штаммы-деструкторы были способны к росту в богатой среде Раймонда как без добавления соли, так и при повышенном засолении среды (до 90–100 г/л NaCl) (табл. 2) и относятся к гало-толерантным микроорганизмам [Кашнер 1981]. Штаммы Idiomarina sp. PSH17-1 и Martelella sp.PSH17-52 растут на БСР в присутствии до 120 г/л NaCl.

Установлено, что исследуемые штаммы способны к росту на БСР в диапазоне рН 6.0–8.0 с оптимальным значением рН 7.0. Штамм Idiomarina sp. PSH17-1 рос на БСР при рН 5.0.

Все исследуемые штаммы-деструкторы ортоФК способны к росту на протокатеховой кислоте (ПКК) – основном метаболите разложения фталатов, который утилизируется с расщеплением ароматического кольца по мета- или орто-пути до основных метаболитов клетки [Liang, Zhang, Fang, 2008]. Три штамма (PG2, PSH17-1 и PSH17-52) растут на сложном эфире фталевой кислоты – дибутилфталате (ДБФ), а штаммы PG2 и PSH17-52

растут на диэтилфталате (ДЭФ). Штамм Breogha-nia sp. PP22-31 способен также к росту на бифениле, нафталине и салицилате.

Таблица 2

Рост бактерий в присутствии различных концентраций соли

Штамм	Концентрация NaCl (г/л), БСР
	Без NaCl	30	60	100	120
Idiomarina sp. PSH17-1	++	+++	++	++	+
Pseudomonas sp. PG2	++	++	+	+	–
Alcanivorax sp. B23	++	+++	++	+	–
Martelella sp. PSH17-52	++	+++	++	+	+
Breoghania sp. PP22-31	++	+++	++	+	–

Примечание. «–» – отсутствие роста бактерий; слабый рост «+» – колонии размером менее 1 мм; средний рост «++» – колонии размером 1–2 мм; хороший рост «+++» – колонии размером более 3 мм.

Рост бактерий на орто-ФК при разной солености среды

Установлено, что все штаммы способны к эффективному росту в жидкой минеральной среде на орто- ФК в присутствии до 70 г/л NaCl в среде культивирования. Для штамма PG2 наблюдался слабый рост при 90 г/л NaCl.

Для всех исследованных штаммов установлена прямая зависимость между повышением содержания соли в среде культивирования и увеличением длительности лаг-фазы роста. Наиболее продолжительная лаг-фаза роста наблюдалась при содержании 70 г/л NaCl в среде культивирования (от 30 ч.

Таблица 3

Удельная скорость роста μ (ч-1) и максимальная оптическая плотность (ОП600) бактерий в присутствии различных концентраций хлорида натрия

Штамм	Без NaCl		30 г/л		50 г/л		70 г/л		90 г/л
	μ	ОП 600	μ	ОП 600	μ	ОП 600	μ	ОП 600	μ	ОП 600
PP22-31	0,012	0,74	0,019	0,75	0,012	0,73	0,011	0,72	0,001	0,22
PSH17-52	0,011	0,79	0,032	0,95	0,005	0,56	0,002	0,32	0,001	0,15
PSH17-1	0,012	0,73	0,007	0,72	0,011	0,75	0,013	0,76	0,001	0,25
PG-2	0,026	1,04	0,024	1,06	0,018	0,96	0,012	0,94	0,004	0,45
B23	0,015	1,01	0,023	0,88	0,016	0,93	0,020	0,89	0,001	0,22

Скорость экспоненциального роста культуры (μ) также незначительно менялась с повышением концентрации соли в среде культивирования штаммов (табл. 3). Наиболее высокая удельная скорость роста зафиксирована для штамма Mar-telella sp. PSH17-52 (μ=0.032ч^-1) в присутствии 30 г/л NaCl в среде.

Как показано в ряде исследований для штаммов родов Pseudomonas, Halomonas, снижение параметров роста, а также степень утилизации ксенобиотиков в условиях повышенного засоления среды могут быть обусловлены адаптационными процессами, протекающими в клетках, а также снижением доступности ароматических субстратов при засолении среды [Xu, Li, Gu, 2007; Oie, Al- для штамма Martelella sp. PSH17-52 до 118 ч. для штамма Idiomarina sp. PSH17-1) (рисунок).

При этом с повышением засоления среды величина максимальной оптической плотности культуры для исследуемых штаммов снижалась незначительно (табл. 3). Для большинства штаммов наиболее высокие значения максимальной ОП 600 зафиксированы при росте в среде с 30 г/л NaCl, а для штамма Idiomarina sp. PSH17-1 – в среде с 50 и 70 г/л соли. Максимальная оптическая плотность штамма Alcanivorax sp B23В зафиксирована в среде без добавления соли. Наиболее высокие значения максимальной оптической плотности наблюдались у штамма Pseudomonas sp PG-2 (ОП 600 = 1.06 при концентрации соли 30 г/л).

baugh, Peyton, 2007].

Заключение

Исследованные грамотрицательные штаммы разных таксономических групп (родов Pseudomonas, Idiomarina, Alcanivorax, Martelella, Breogha-nia), выделенные из района солеразработок, являются галотолерантными микроорганизмами и способны к росту на полноценной среде в присутствии до 100 г/л NaCl, а также к росту на орто-ФК в качестве субстрата при содержании до 70 г/л соли в среде культивирования. Для большинства исследуемых штаммов зафиксированы более высокие ростовые показатели при выращивании в среде с по- вышенным засолением (30 г/л NaCl), чем в среде без добавления соли. Штамм Idiomarina sp. PSH17-1 имеет наиболее высокие ростовые характеристики в среде с 50 и 70 г/л соли. Ранее не были описаны особенности деструкции орто-ФК для штаммов рода Martelella. Наши исследования по- казали, что рост штамма Martelella sp. PSH17-52 на орто-ФК наблюдался практически без подготовительной фазы, при этом максимальная удельная скорость роста и максимальное значение ОП600 зафиксированы в среде с 30 г/л NaCl.

Б

А

Рост штаммов Pseudomonas sp. PG2 (А), Alcanivorax sp. B23 (Б), Breoghania sp. PP22-31 (В), Idiomarina sp. PSH17-1 (Г), Martelella sp. PSH17-52 (Д) в МСР на орто- ФК (1 г/л) при разных концентрациях хлорида натрия (г/л): 1 – без NaCl; 2 – 30; 3 – 50; 4 – 70; 5 – 90

Три исследуемых штамма способны к росту на сложных эфирах орто- ФК – дибутилфталате

(ДБФ) и диэтилфталате (ДЭФ). Наибольшей субстратной специфичностью обладает штамм Breoghania sp. PP22-31, способный к росту на орто- ФК, бифениле, нафталине и салицилате. Показано, что данные штаммы-деструкторы орто -ФК способны к росту на протокатеховой кислоте – основном метаболите разложения фталатов.

Приведенные результаты исследования галото-лерантных штаммов-деструкторов фталатов могут быть использованы для разработки новых инновационных биотехнологических методов мониторинга и очистки объектов окружающий среды от устойчивых токсичных ароматических соединений (в том числе, фталатов) в условиях высокого засоления.

Работа выполнена в рамках государственного задания, номер госрегистрации темы: 01201353247.