Гуманизированные животные как модели экспериментальной онкологии (обзор литературы)

Частота возникновения и тяжесть онкологических заболеваний в сочетании с проблемами химио-, радио- и иммунорезистентости ряда злокачественных опухолей (ЗО) определяют острую потребность в надежных способах лечения конкретных пациентов с распространенным опухолевым процессом. Современные экспериментальные модели злокачественного процесса, предусматривающие трансплантацию ксенографтов ЗО человека иммунодефицитным животным, не создают условий, адекватных тем, в которых происходит развитие опухолей в организме человека [1, 2]. Даже в случае ортотопической трансплантации материала биопсий (PDX, patient derived xenograft), то есть перемещения фрагментов опухоли конкретного пациента в аналогичные структуры и локусы тела животного, макро- и микроокружение ксенографта, а также системные влияния на опухолевый процесс значительно отличаются от того, что происходит в организме человека. Такие отличия обусловливают целый ряд отклонений молекулярно-генетических и гистологических показателей развивающихся ксенографтов, а также характеристик их роста, инвазии, ангиогенеза и метастазирования от параметров исходного злокачественного процесса [2]. Гуманизация иммунодефицитных животных моделей является необходимым дополнением трансплантации ксено-графтов ЗО человека, поскольку позволяет хотя бы отчасти приблизить условия их роста к условиям развития злокачественного процесса в организме человека [2, 3].

Как и во многих других случаях, мыши, благодаря своим размерам, короткому жизненному циклу и значительному генетическому сходству с человеком, являются основной исходной моделью для гуманизации. Существует два основных направления в создании гуманизированных моделей – трансгенез [4, 5] и трансплантация зрелых или стволовых клеток иммунной системы человека с последующим их восстановлением и развитием в организме иммунодефицитных животных [6–8]. Первое направление связано с интеграцией генов человека в наследственный аппарат иммунокомпетентных животных (мыши с человеческими HLA, иммуноглобулинами, цитокинами и ростовыми факторами) [9, 10]. Для инициации человеческого гемопоэза у лабораторных грызунов с ксенотрансплантатами человеческих опухолей оно менее востребовано, чем второе направление, в связи с высокой стоимостью и целым рядом методических и методологических проблем, затрудняющих адекватное воспроизведение процессов, обусловленных генами человека, в организме животного [4, 11, 12].

Второе направление в разработке гуманизированных моделей также использует генетически модифицированные объекты. Формирование данного направления стало закономерным этапом развития исследований на иммунодефицитных животных. Иммунная природа основных механизмов противоопухолевой резистентности [13, 14], участие клеток иммунной системы в онкогенезе и формировании микроокружения опухоли [15, 16], существование опосредованных иммунной системой механизмов действия противоопухолевых химиопрепаратов [17], а также перспективность методов иммунотерапии для лечения онкологических заболеваний [2, 18] определяют целесообразность формирования человеческого гемопоэза в организме иммунодефицитных животных, у которых развиваются ксенографты злокачественных опухолей человека.

Основные линии иммунодефицитных животных, используемые для транcплантации иммунных клеток человека

Уже на первых этапах развития данного направления возникли проблемы с выбором исходной животной модели. Результаты первых экспериментов на бестимусных мышах-нудах, единственной в то время иммунодефицитной животной модели, буквально обескуражили исследователей. Оказалось, что, несмотря на резко сниженный уровень Т-лимфоцитов и хорошую прививаемость ксено-графтов человеческих опухолей, наличие популяции В-лимфоцитов (хотя и неполноценной) и представленность компонентов врожденной иммунной системы не позволяли мышам-нудам поддерживать рост введенных мононуклеаров периферической крови человека [19, 20]. Приживление клеток крови человека в организме мыши впервые стало возможным благодаря открытию мутации тяжелого комбинированного иммунодефицита scid (severe combined immunodeficiency), у мышей линии CB17 более 35 лет назад [21]. Было показано, что эти мыши имеют выраженный дефицит по B- и T-клеткам в результате мутации в гене, кодирующем протеинкиназу, участвующую в репарации ДНК. Сравнительные исследования роста и метастазирования подкожных ксенографтов, полученных из клеточных линий опухолей рака мочевого пузыря, молочной железы и меланомы человека, выявили значительно более высокую частоту метастазирования у мышей Scid по сравнению с мышами nude – 96 и 27 % соответственно [22].

При этом даже у мышей CB17-Scid наблюдался довольно низкий уровень приживления гемопоэтических клеток человека из-за достаточно сильной врожденной иммунной системы [23]. Этот результат был улучшен путем использования модели NOD (non-obese diabetes), сочетающей scid-мутацию и диабет, не связанный с ожирением. Пятикратное усиление восстановления иммунных клеток человека у мышей линии NOD/SCID по сравнению с показателями у исходной модели CB-17-Scid было обусловлено кумуляцией дефектов в активности естественных киллерных клеток, макрофагов и системы комплемента [2, 23]. Следующий шаг в улучшении качества и повышении уровня человеческого гемопоэза был связан с нокаутом гена общей ɣ-цепи рецептора к ИЛ-2 (IL-2Rɣc), приводящим к потере мышиных функционально активных естественных киллерных клеток [2, 6, 24]. Новая линия животных была обозначена как NSG (NOD scid gamma mouse). Мыши NSG лишены адаптивной иммунной функции, имеют множественные дефекты врожденного иммунитета и обеспечивают повышенный уровень приживления гематолимфоидных ксенографтов человека – в 50 000 раз превышающий таковой у бестимусных мышей-нудов.

Комбинация мутаций scid, а также мутаций Rag1 и Rag2 с мутацией IL-2Rɣc позволила в период 2002–05 гг., кроме линии NSG, получить и другие новые генерации мышиных моделей с тяжелыми иммунодефицитами, названные NOG (также на базе NOD-scid) и BRG (на базе BALB/c Rag2) [2, 25, 26], демонстрирующие сходные уровни приживления гемопоэтических стволовых клеток человека и функциональной активности иммунных клеток после их восстановления в организме животного. Интересно, что мыши линии C57BL/6 с теми же мутациями Rag и ɣc, в отличие от мышей NSG, NOG и BRG, оставались способными к отторжению человеческих ксенографтов, что указывало на существование у них иного механизма отторжения на аналогичном генетическом фоне.

В настоящее время за рубежом существует целая индустрия по производству более 20 различных линий гуманизированных иммунодефицитных животных для медико-биологических исследований [2, 26]. Учитывая высокие уровни приживления человеческих клеток, которые достигаются у мышей с генотипом NOD-Scid IL-2Rɣc, валидность и распространенность соответствующих моделей, следует иметь в виду, что именно таких животных рекомендуют для изучения практически всех аспектов функционирования иммунной системы человека. Однако многие исследователи также продолжают использовать более ранние и менее совершенные иммунодефицитные модели, например мышей CB17-Scid и NOD/Lt-scid.

Различия в условиях развития опухолей человека в организме иммунодефицитных животных и онкологических больных обусловливают целый ряд отличий молекулярно-генетических, структурных и кинетических характеристик ксенографтов от показателей исходных ЗО. Выраженность таких отличий зависит от источника ксенографта (PDX или клеточные линии), структуры (фрагмент ткани, суспензия клеток), наличия и формы клеточных носителей-скаффолдов, а также локусов трансплантации [2, 5, 27]. В значительном числе случаев продолжительность жизни ограничена иммунодефицитностью животных и не используется в качестве показателя эффективности противоопухолевых воздействий. При подкожном ксенографировании часто (хотя и не всегда) наблюдается линейный рост трансплантата без заметной инвазии и метастазирования. Развитие, наиболее приближенное к исходному процессу, демонстрируют PDX при их ортотопической трансплантации в организм животных [28]. Такая модель в ряде случаев даже позволяет осуществить персонифицированную диагностику развития опухоли и эффективности лечения.

Основные технологии гуманизации и расширение возможностей использования иммунодефицитных животных в онкологии

Для формирования человеческого гемопоэза в организме иммунодефицитного животного используют две категории трансплантируемых клеток и две основные модели их приживления [1, 2, 26]. Каждая модель может иметь несколько вариантов и модификаций в зависимости от задач исследования и доступных линий иммунодефицитных животных и материалов. При создании модели Hu-PBL (human peripheral blood leukocytes) для трансплантации могут быть использованы мононуклеарные клетки периферической крови, РВМСs (peripheral blood mononuclear cells), взрослых доноров. При формировании Hu-CD34+ модели применяют гемопоэтические стволовые клетки человека, HSCs

Таблица/table

Сравнение характеристики основных моделей гуманизации иммунодефицитных линейных мышей comparison of the characteristics of the main models of humanization of immunodeficient linear mice

Особенности/Characteristics	Hu-PBL	Hu-CD34
Источник иммунных клеток человека/ Source of human immune cells	Мононуклеары периферической крови (PBMCs)/ Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)	Пуповинная кровь, костный мозг взрослого человека, мобилизованные клетки периферической крови, фетальная печень, фетальный тимус (HSCs)/ Umbilical cord blood, adult bone marrow, mobilized peripheral blood cells, fetal liver, fetal thymus (HSCs)
Способ введения/ Injection method	Внутрибрюшинно или внутривенно/ Intraperitoneal or intravenous injection	Взрослым животным – внутривенно или интрафеморально. Новорожденным – внутривенно, в сердце или в печень/ For adult animals – intravenously or intrafemorally. Newborns – intravenously, in the heart or in the liver. Модель BLT – субренально, внутривенно/ BLT model – subrenal, intravenous
Линия мышей/Line of mice	NSG/NOG	NSG/NOG
Предподготовка/Pre-prepa-ration	Нет/No	Сублетальное облучение/Sublethal radiation
Иммунная реконструкция: подтипы и состояние клеток/ Immune reconstruction: subtypes and state of cells	Зрелые лейкоциты человека с активированным фенотипом/ Mature human leukocytes with an activated phenotype	Все человеческие кроветворные линии в разной степени/ All human hematopoietic lines to varying degrees
GvHD, сроки развития/ GvHD, terms of development	4–6 нед/ 4–6 weeks	>2 мес/ >2 months
Время приживления/ Engraftment time	Короткое (3–5 дней)/ Short (3–5 days)	Длинное (3–4 нед)/Long (3–4 weeks)
Стоимость/Cost	$	$$$
Доступность тканей/ Accessibility of tissues	Высокая/High	Низкая/Low
Сложность/Complexity	Низкая/Low	Средняя/Medium

(hematopoietic stem cells), в том числе полученные из фетальных тимуса и печени.

Вариантом частичной гуманизации является одновременное с трансплантацией PDX введение мезенхимальных стволовых клеток человека. Эти клетки продуцируют ростовые и иммунорегуля-торные факторы [29] и способны усилить сходство микроокружения ксенографта с микроокружением исходной опухоли человека [30]. Такая модификация ткани перитуморальной зоны обеспечивает фенотипическую стабильность трансплантатов, усиливает ангиогенез и ускоряет рост опухоли, приближая его характеристики к показателям, отмеченным в клинике. При этом было выявлено прогностическое значение модели в отношении прогрессирования рака молочной железы у конкретных пациентов.

Модель Hu-PBL является наиболее простой и экономичной моделью гуманизации, предусматривающей введение мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека иммунодефицитным мышам. Этот подход впервые применен в 1988 г. у мышей CB17-Scid [2]. PBMCs получают из крови здоровых доноров (реже используют селезенку или лимфоузлы), главный комплекс гистосовместимости (HLA) которых сопоставим с HLA ксенографтов опухоли. У мышей без мута- ции IL-2Rɣc приживление лейкоцитов человека при внутривенном введении затруднено, но легко реализуемо при внутрибрюшинном ведении [26]. Т-лимфоциты составляют основную субпопуляцию иммунокомпетентных клеток, которая сохраняется и функционирует у мышей. Так, введение 20*106 клеток мышам линии NSG через 4 нед приводит к замещению 50 % лейкоцитов периферической крови человеческими CD45+ клетками [2]. Приблизительно 90 % этих CD45+ клеток составляли CD3+ Tлф с фенотипом активированных клеток или клеток памяти. Наблюдаемый после приживления низкий уровень В-лимфоцитов и миелоидных клеток человека, вероятно, обусловлен недостатком человеческих цитокинов, необходимых для выживания этих клеток [31]. Альтернативные протоколы реализации данной модели описывают дополнительный способ доставки PBMCs непосредственно в селезенку, что предполагает оперативное вмешательство и кратковременное извлечение селезенки из брюшной полости [26].

К сожалению, введение мононуклеаров периферической крови человека способно лишь в весьма ограниченной степени восполнить недостаток клеток иммунной системы в организме иммунодефицитных животных-опухоленосителей. Кроме того, серьезная проблема, связанная с данной моделью, состоит в том, что трансплантация PBMCs человека неизменно приводит к развитию заболевания «трансплантат против хозяина», GvHD (graft-versus-host disease,), которое легко может быть оценено по потере массы тела [37]. Потеря массы более 15 % от исходной является признаком развития GVHD и требует эвтаназии животных. При этом CD4+ T-лимфоциты, по-видимому, играют главную роль в индукции GvHD у Hu-PBL мышей, поскольку истощение вводимых PBMCs по CD4+ клеткам перед введением ослабляет клинические симптомы и увеличивает выживаемость мышей [32]. Таким образом, интервал тестирования лечебного воздействия при использовании данной модели ограничен несколькими неделями до появления явных признаков GvHD – обычно 4–6 нед после инъекции РВМСs. При этом следует отметить отдельные свидетельства возможности усовершенствования рассматриваемой модели. Так, в случае дополнения введенных РВМСs человека аутологичными дендритными клетками у мышей-опухоленосителей линии NSG не было отмечено проявления симптомов GVHD в обычные сроки [34].

Другой подход к гуманизации животных, известный как создание Hu-CD34+ модели, состоит в инъекции человеческих гемопоэтических стволовых клеток (HSCs) CD34+, новорожденным или взрослым иммунодефицитным реципиентам [2, 26, 36]. Модель позволяет исследовать формирование компонентов иммунной системы, реакции наивных лимфоцитов и обеспечивает более полное воспроизведение элементов иммунной системы человека в организме иммунодефицитных животных-опухоленосителей по сравнению с Hu-PBL моделью. Преимущество Hu-CD34+ модели состоит в том, что T- и B-лимфоциты, развивающиеся из человеческих стволовых клеток, индуцируют толерантность в организме-реципиенте, что значительно отодвигает сроки развития GvHD. Это повышает информативное значение такого пока- зателя, как продолжительность жизни животных-опухоленосителей.

Используемые для гуманизации гемопоэтические стволовые клетки могут быть получены из нескольких источников (пуповинная кровь, костный мозг взрослого человека, тимус и печень плода) [2, 38], а также могут быть мобилизованы из крови взрослых доноров с помощью гранулоцитарного колониестимулирующего фактора [23]. Успешность приживления HSCs зависит от источника стволовых клеток, способа введения, линии и пола животных. Взрослым мышам (например, самцам и самкам NOG в возрасте 5–12 нед) HSCs вводят внутривенно или интрафеморально (в бедренную кость), у новорожденных животных применяют внутривенное введение, а также введение внутрь сердца или печени [2, 26].

Реализация данной модели требует предварительного сублетального облучения всего тела животного, а также истощения источника HSCs по Т-лимфоцитам (во избежание GvHD). При этом режимы облучения могут сильно варьировать в зависимости от используемой линии и возраста животных, и даже доза, необходимая для мышей одной линии и одинакового возраста, может различаться [23, 39, 40]. Так, радиорезистентность мышей NOD/Lt-scid IL2rγ значительно ниже, чем мышей Rag1/Rag2, что определяет кратную разницу в дозах облучения как для взрослых – 2,4 и 9 Гр, так и для новорожденных животных – 1–1,1 и 4 Гр соответственно.

Интервал между облучением мышей и введением им стволовых клеток человека составляет 4–24 ч для взрослых и до 4 ч для новорожденных мышей [26]. Контроль приживления HSCs проводят в период от 10 до 12 нед с помощью проточной цитометрии для выявления клеток CD45+ человека в периферической крови мыши. Эти клетки могут обнаруживаться в периферической крови уже через 4 нед после введения человеческих HSC, но в малом количестве и при отсутствии CD3+ Т-клеток. Самое высокое приживление лейкоцитов наблюдается в костном мозге, где уровни CD45+ клеток человека обычно превышают 75 %. У новорожденных или молодых мышей (до 4 нед) развитие Т-лимфоцитов ускорено по сравнению с взрослыми животными [41].

Модели Hu-CD34+ открывают дополнительные возможности для воспроизводства основных ростков кроветворения человека, что способствует приближению условий развития ксенотрансплантатов в организме животных к условиям развития исходных опухолей и их реакциям на лечение у онкологических больных [15, 36]. Так, после обработки пуповинной крови факторами, стимулирующими пролиферацию и ингибирующими апоптоз, получена фракция CD34+ клеток с сохраненной способностью дифференцироваться не только в лимфоидные, но и в миелоидные клетки. Это по- зволило увеличить сходство ксенотрансплантатов опухолей головы и шеи с исходными ЗО по показателям экспрессии генов, управляющих процессами во внеклеточном матриксе, связанными с эпителиально-мезенхимальным переходом, а также с развитием иммунного ответа [42]. Кроме того, отмечено появление таких ранее отсутствовавших в моделях признаков исходных опухолей, как лимфангиогенез и передача управляющих сигналов с помощью хемокинов. Позже было показано, что человеческие HSCs трансформируются в иммунные клетки, которые проникают в опухоль и помогают копировать ее естественную микросреду [43]. Таким образом, удается сохранить значительное сходство показателей экспрессии эпителиальных, стромальных и иммунных факторов в ксенографтах гуманизированных мышей с показателями исходных опухолей человека, обратить вспять первоначальный генетический дрейф, наблюдаемый после пассажа на негумани-зированных мышах, и предоставить более точную модель опухоли, её роста и метастазирования для оптимизации лечебных воздействий.

В связи с отсутствием адекватного микроокружения усовершенствование с помощью гуманизации моделей гетеротопических, подкожных, ксенотрансплантатов опухолей человека является более сложной задачей, чем при ортотопической перевивке PDX. Так, даже в случае гуманизации новорожденных животных с помощью HSCs, последующей подкожной перевивки ксенотрансплантатов на основе клеточной линии рака легкого, их роста и инфильтрации клетками иммунной системы человека не отмечается значительных различий в характеристиках развития и гистотипе опухолей у гуманизированных и негуманизирован-ных животных [44].

Модели гуманизированных мышей можно использовать для изучения сложной взаимосвязи между развитием опухоли, онколитическими вирусами и иммунной системой человека, а также для выявления эффективных cхем адоптивной клеточной терапии [36]. На Hu-CD34+ моделях показана эффективность комбинированной терапии с использованием CTLA4-блокирующего антитела и онколитического вируса коровьей оспы (VACV) в отношении рака легкого [44], а также возможность ингибирования роста меланомы с помощью блокады иммунных контрольных точек [45]. При этом существование иммунотропных механизмов действия химиопрепаратов [17] и вызываемых ими системных реакций указывает на целесообразность использования гуманизированных моделей при тестировании широкого спектра противоопухолевых средств [1, 6].

BLT модель (bone, liver, thymus) является перспективным вариантом Hu-CD34+ модели, поскольку направлена на воспроизведение основных звеньев иммунной системы человека в организме животного. Она формируется путем трансплантации ткани фетальной печени и тимуса человека в субренальную капсулу при одновременном внутривенном введении аутологичных CD34+ клеток из той же фетальной печени взрослым иммунодефицитным мышам [7, 46]. При этом HSCs, полученные от пациентов с заболеваниями иммунной системы или генетически модифицированные мутациями, связанными с опухолью, повторяют основные признаки, обусловленные этими заболеваниями. Таким образом, различные варианты этой модели позволяют хотя бы отчасти прояснить картину изменений в иммунной системе пациентов с опухолями разных локализаций и при различных способах лечения. BLT модели также могут быть использованы для наиболее полного на современном этапе воспроизведения человеческих гемобластозов. Кроме того, наличие таких животных обеспечивает возможность разработки эффективных методов клеточной терапии онкологических заболеваний. Проблема состоит в малой доступности рассматриваемой модели в связи с ограниченным количеством необходимых тканей фетальных тимуса и печени человека. Один из способов преодоления указанного препятствия может состоять во вторичной трансплантации клеток костного мозга и имплантатов фетальных органов человека от мышей BLT мышам-реципиентам NSG [7].

В таблице из статьи P. De La Rochere et al. [2] обобщены сведения о двух основных моделях гуманизации мышей иммунодефицитных линий. На современном этапе Hu-CD34+ модель и её модификации обеспечивают более широкие возможности для воспроизведения компонентов иммунной системы человека в организме иммунодефицитных животных с ксенографтами злокачественных опухолей человека по сравнению с Hu-PBL моделью и отодвигают сроки развития GvHD. К основным ограничениям Hu-CD34+ моделей относятся недостаток регуляторного влияния цитокинов, гуморальных факторов системного действия и отсутствие возможности достаточно полного восстановления не только миелоидного ростка кроветворения, но и репертуара T-лимфоцитов конкретного больного [15, 36]. Кроме того, в большинстве случаев пока не удается использовать для трансплантации ксенографта и гуманизации иммунодефицитного животного образцов, полученных от одного и того же пациента [1, 6].

Заключение

Животные, способные поддерживать рост злокачественных опухолей человека и воспроизводить полноценное функционирование основных компонентов иммунной системы человека, рассматриваются в качестве наиболее совершенной модели для разработки схем персонализированного противоопухолевого лечения и решения ряда проблем фундаментальной онкологии. Несмотря на значительные достижения, cвязанные с применением методов гуманизации, эти технологии находятся в стадии разработки. Воссоздание на мышиной модели иммунной системы человека пока еще не способно в достаточной степени воспроизвести миелоидный компонент кроветворения, обеспечить полноценное развитие и функционирование клеток мононуклеарного ряда, адекватную продукцию цитокинов и ростовых факторов, а также полностью устранить возможность развития GvHD [2]. Усилия по улучшению имеющихся моделей направлены на решение ряда технических проблем, а также на разработку новых подходов к гуманизации животных-опухоленосителей и улучшению их свойств в качестве моделей злокачественного процесса типа «avatar». Основные направления совершенствования моделей гуманизированных мышей включают модификацию организма-хозяина для снижения врожденного иммунитета, препятствующего приживлению клеток человека; генетическую модификацию для обеспечения организма животного специфическими для человека факторами роста и цитокинами, необходимыми для полноценного гемо- и иммунопоэза, а также эффективные протоколы приживления клеток и тканей человека в организме животных [47] и расширения терапевтических возможностей гемопоэтических и мезенхимальных стволовых клеток путем целенаправленной модификации [15].

С этой же целью рассматриваются подходы, связанные с блокадой контрольных иммунных