Характер изменения активности серотонинергической системы головного мозга молоди персидского осетра Acipenser persicus в зависимости от уровня их зрелости

клеточного деления, о котором они судили по уровню включения 3Н-тимидина. На непосредственное участие серотонина в регуляции дифференцировки нервных клеток также указывают результаты исследований других авторов [9, 13].

В настоящее время одним из спорных вопросов при искусственном воспроизводстве осетровых является определение стадии их выпуска из рыбоводных заводов в естественные водоёмы. При этом за основной показатель принимается их вес (масса) и в нормативных документах предусмотрен выпуск молоди по достижении массы тела 2-3 г, считая при этом промысловый возврат равным 2-3% от количества выпускаемой молоди. Исходя из этих данных, предлагают выпускать молодь с большей массой (5-10 г) с тем, чтобы повысить уровень промыслового возврата до 5-10%. Впоследствии, однако, было обнаружено, что масса тела не может служить достаточным критерием для выпуска молоди осетровых из рыбоводных заводов. Исследования Р.Ю. Касимова [1] и В.В. Лукьяненко с соавторами [2] показали, что адекватным критерием для выпуска молоди, может быть возраст, поскольку он отражает сформирован-ность её поведенческих и физиологобиохимических показателей, способствующих лучшему приспособлению и выживанию животных в природных условиях. С другой стороны, при выращивании осетровых на рыбоводных заводах в потомстве, полученной от одной самки, встречаются особи, отличающиеся темпами своего развития, т.е. в одновозрастной популяции встречаются как более крупные особи, так и особи меньшего размера, с меньшей массой. Исходя из сказанного, представляется важным определение уровня активности серотонинергической системы головного мозга осетровых в раннем онтогенезе с целью установления соответствия степени зрелости и сформирован-ности их центральной нервной системы требованиям естественных условий обитания.

Определение активности серотонинергической системы осуществляли путём иммуно-химического измерения содержания серотонин-модулируемого антиконсолидационного белка (СМАБ) в белковых экстрактах головного мозга мальков осетров с использованием поликлональных иммуноглобулинов, полученных к этому белку. СМАБ был выделен ранее в Институте физиологии им. А.И. Караева (Баку) из головного мозга белых крыс, обладает молекулярной массой 126 кДа [3] и лишён видовой специфичности.

Материал и методика. Исследования выполнены в 2005-2006 гг. на разновозрастных группах молоди персидского осетра Acipenser persicus , выращенных бассейновым методом в условиях Хыллинского осетрового рыбного завода Азербайджанской Республики. Мальки массой 0,5 г (n=9) и 1 г (n=7) были 50-дневного возраста, тогда как двухграммовые и трёхграммовые мальки были 50- (n=7) и 70-дневного (n=7) возраста. При проведении исследований у мальков извлекали головной мозг и экстрагировали суммарные водорастворимые белки путём гомогенизации в стеклянных гомогенизаторах в 0,05 М фосфатном экстрагирующем буфере (рН 7,2), содержавшем 0,3 М NaCl, 5 мМ ЭДТА и 0,1%-ный тритон Х-100. Пробы центрифугировали при 6000 об./мин в течение 15 минут и собирали супернатант. Концентрацию экстрагированных белков измеряли методом Бредфорда с помощью 0,01%-ного раствора Кумасси яркоголубого G-250 в спектрофотометре на длине волны 595 нм. Концентрацию экстрагированных белков доводили с помощью 0,1 M буфера трис-HCl (pH 8,6) до 20 мкг/мл и использовали в качестве антигенов при постановке непрямого твёрдофазного иммуноферментного анализа на полистироловых планшетах умеренного уровня связывания (Corning Incorporated, USA). Через 20 ч лунки четырежды отмывали 0,15 М раствором NaCl, содержавшим 0,05%-ный твин-20 и наносили поликлональные иммуноглобулины к СМАБ, разведенные в соотношении 1: 40 в 0,01 М фосфатном буфере для антител (рН 7,2), содержавшим 0,15 М NaCl и 0,05%-ный твин-20. Через 24 ч лунки вновь отмывали и наносили противокроличьи козьи конъюгаты иммуноглобулинов с пероксидазой хрена (Кардиоцентр, Москва) в разведении 1: 6000 в буфере для антител. Через 3 ч лунки вновь отмывали и заливали субстратом – ортофенилендиамином – в концентрации 0,5 мг/мл в 0,05 М цитратфосфатном буфере (рН 4,5), содержавшим 0,4 мг/мл перекиси водорода. Реакцию останавливали через 20 мин путём добавления в лунки 3 М раствора NaOH. Результаты реакции считывали с помощью фотометра для иммунофер-ментного анализа на длине волны 492 нм.

Полученные результаты погруппно усредняли и сравнивали по t–критерию Стьюдента [3].

Результаты и обсуждение. В результате проведенных исследований была выявлена следующая закономерность изменений в уровне СМАБ в головном мозге мальков осетров в зависимости от степени их зрелости. При сравнении 50-ти дневных мальков осетров весом 0,5 г, 1 г и 2 г было обнаружено резкое снижение содержания СМАБ у однограммовых мальков относительно полуграммовых (p<0,01), тогда как между однограммовыми и двухграммовыми мальками никакой разницы по уровню СМАБ обнаружено не было (рис. 1).

Рис. 1. Содержание серотонин-модулируемого белка в головном мозге 50-днейных мальков осетров разного веса: наклонная штроховка – 0,5 г, горизонтальная штриховка – 1 г, вертикальная штриховка – 2 г. ** - р<0,01

Наряду с этим, также проводили сочетанное сравнение уровня СМАБ в головном мозге мальков осетров разного веса и возраста. При анализе содержания СМАБ у двухграммовых мальков, отобранных из популяции мальков 50-и 70-суточного возраста, а также у трёхграммовых мальков 58- и 70-суточного возраста была выявлена преобладающая роль степени зрелости (веса) над возрастом животных в детерминировании его значений. В частности, двухграммовые мальки осетров 50- и 70-суточного возраста имели близкие значения СМАБ так же, как и трёхграммовые мальки 58- и 70-суточного возраста (рис. 2). Вместе с тем, были обнаружены значительные различия между двухграммовыми 50-суточными и трёхграммовыми 58-суточными мальками (p<0,01), а также между двухграммовыми 70-суточными и трёхграммовыми 70-суточными мальками осетров (p<0,01; рис. 2).

Рис. 2. Изменение содержание серотонин-модулируемого белка в мозге мальков осетров в зависимости от веса и возраста. * - р<0,05. Широкая наклонная штриховка – 2 г. 50 сут.; узкая наклонная штриховка – 2 г. 70 сут.; горизонтальная широкая штриховка – 3 г. 58 сут.; горизонтальная мелкая штриховка – 3 г. 70 сут.

Проведение интегрального анализа содержания СМАБ у 50-дневных полуграммовых, однограммовых, двухграммовых и 58-дневных трёхграммовых мальков позволило выявить следующую динамику (рис. 3). При созревании мальков в интервале от полуграммовых к однограммовым животным наблюдается заметное (p<0,01) снижение содержания СМАБ. Далее, при анализе уровня СМАБ у однограммовых и двухграммовых мальков происходит стабилизация значений этого показателя – они выходят на плато, тогда как при последующем развитии от двухграммовых к трёхграммовым малькам вновь отмечается заметное (p<0,05) падение уровня СМАБ. Таким образом, на ранних этапах созревания головного мозга осетров в постэмбриональном онтогенезе от полуграммовых мальков к трёхграммовым наблюдается постепенное снижение активности серотонинергической системы. Выявленное снижение активности серотонинергической системы отмечается в период значительного сокращения пролиферативной активности клеточных элементов головного мозга мальков осетров и интенсификации процессов их дифференциации и формирования структур головного мозга. В частности, возраст использованных в представленном исследовании животных приходится на 6-ой период III этапа развития конечного мозга осетровых рыб, охватывающий интервал от 35-тых до 70-ых суток постэмбрионального развития [5]. К этому этапу происходит образование всех основных зон и ядер конечного мозга осетровых, и дальнейшее развитие следует по пути дифференцировки образовавшихся структур.

Рис. 3. Зависимость уровня серотонин-модулируемого белка от массы мальков осетров 50-дневного возраста. * - р,0,05: ** - p<0,01.

Снижение активности серотонинергической системы головного мозга мальков осетров в период интенсификации процессов дифференцировки его клеточных элементов и завершения их пролиферации, вероятно, обусловлено тем, что рецепторы серотонина 5-HT1A, задействованные в регуляции процессов дифференцировки клеток, обладают высоким уровнем аффинности (10-9 М) к серотонину, на три порядка превышающим аффинность рецепторов серотонина 5-HT2A (10-6М), ответственных за регуляцию пролиферации нервных клеток [7].

Исходя из известной из литературы регуляторной роли серотонина в отношении процессов дифференциации клеток [9, 13] выявленная динамика изменения уровня СМАБ позволяет проследить во временном масштабе характер этой регуляции. Рассмотрение этой динамики в процессе созревания головного мозга мальков осетров позволяет придти к заключению о том, что снижение активности серотонинергической системы происходит не градуально, а имеет ступенчатый (на отрезке развития от однограммовых к двухграммовым малькам) характер. Вследствие регуляции серотонином процесса дифференцировки, можно полагать, что аналогичному временному характеру изменений также подчиняется динамика дифференциации клеточных элементов и созревания структур головного мозга мальков. Следовательно, по уровню активности серотонинергической системы головного мозга мальков осетров можно делать заключение о степени зрелости структур их головного мозга. Обнаруженная в данной работе закономерность может быть востребована в практике рыбоводства для определения степени зрелости мальков осетров перед их выпуском в естественную среду обитания.

Выводы:

• 1.    Обнаружено резкое снижение содержания СМАБ у однограммовых мальков относительно полуграммовых, тогда как между однограммовыми и двухграммовыми мальками никакой разницы по уровню СМАБ обнаружено не было.

• 2.    При анализе содержания СМАБ у двухграммовых мальков 50- и 70-суточного возраста, а также у трёхграммовых мальков 58- и 70-суточного возраста была выявлена преобладающая роль степени зрелости (веса) над возрастом животных в детерминировании его значений.

• 3.    Анализ содержания СМАБ у полуграммо-вых, однограммовых, двухграммовых и трёхграммовых мальков 50-дневного возраста указывает на ступенчатый характер снижения его уровня.