Характер экспрессии маркеров пролиферативной активности, апоптоза и клеточной дифференцировки при предраке и раке гортани

Среди злокачественных опухолей верхних дыхательных путей рак гортани (РГ) продолжает занимать лидирующие позиции, составляя 65–70 %, при этом в общей структуре онкологической заболеваемости на его долю приходится 1,4 % [2, 11]. Гортань по-прежнему остается достаточно трудной локализацией для своевременной диагностики опухолевого процесса на ранних стадиях, несмотря на доступность органа для визуального осмотра и инструментального исследования [3, 5, 10]. Неспецифические симптомы неопластических процессов, отсутствие онкологической настороженности у специалистов общей клинической сети, высокий уровень диагностических ошибок приводят к высокому уровню запущенности – до 60–70 % больных поступают в специализированные учреждения с распространенным опухолевым процессом [7, 8], а ранний рак гортани, при котором возможно выполнение органосохраняющего лечения, составляет всего 2,3–6 % случаев [6, 10].

Эпидемиологические исследования, проведенные в различных странах мира, показали, что практически в 60 % случаев РГ развивается на основе различных хронических заболеваний, составляющих группу облигатного предрака, к ним, в первую очередь, относятся хронический гиперпластический ларингит (ХГЛ) и папилломатоз гортани (ПГ). Известно, что папилломы гортани обладают высоким риском злокачественной трансформации [3, 8, 13, 15].

Однако один лишь факт наличия очагов дисплазии (предопухолевых изменений) в эпителии гортани совершенно недостаточен для определения пациента в группу онкологического риска, необходимы более определенные критерии прогноза развития предраковых изменений [3, 14, 17, 20]. Заслуживает внимания ряд исследований, в которых показана информативность экспрессии маркеров p53 и Ki67 в качестве критериев риска развития злокачественного процесса при различной хронической воспалительной патологии гортани [1, 4, 12, 18, 19, 21]. По сравнению с нормальной слизистой оболочкой гортани нарастание степени тяжести дисплазии эпителия влекло за собой увеличение экспрессии маркера р53, с максимальными значениями при РГ [16]. При наблюдении 114 больных с дисплазией эпителия гортани различной степени тяжести в 24 % случаев реализовалась злокачественная трансформация. Прогрессирование дисплазии в рак напрямую зависело от исходной

степени тяжести диспластических изменений, большинство (75 %) злокачественных новообразований гортани было обнаружено в течение 12 мес после выявления дисплазии в слизистой оболочке [3, 9]. Несмотря на актуальность проблемы, в доступной литературе имеются немногочисленные публикации об экспрессии различных маркеров на этапах злокачественной трансформации в слизистой оболочке у пациентов с хроническими заболеваниями гортани, ассоциированными с предопухолевыми изменениями.

Цель исследования: определение информативности экспрессии маркеров р53, CD138, Кi67 в многослойном плоском эпителии слизистой оболочки гортани при предопухолевых заболеваниях и раке гортани.

Материал и методы

В исследование было включено 80 человек с диагнозом хронический гиперпластический ларингит или папиллома гортани и 37 больных с диагнозом плоскоклеточный рак гортани различной степени дифференцировки, не имеющих в анамнезе специального лечения на момент обследования. В группе хронических воспалительных заболеваний гортани было 49 (61,3 %) мужчин и 31 (38,8 %) женщина, в возрасте от 38 до 69 лет, средний возраст – 57,9 ± 6,2 года. Из них у 34 (42,5 %) пациентов выявлены папилломы гортани, у 46 (57,5 %) – хронический гиперпластический ларингит. Из 37 пациентов с опухолью гортани было 33 (81,2 %) мужчины и 4 (10,8 %) женщины, в возрасте от 41 до 69 лет, средний возраст – 59,2 ± 5,2 года. Рак гортани I стадии был диагностирован у 19 (51,4 %), из них 17 (45,9 %) мужчин, 2 (5,4 %) женщины, РГ III стадии – у 18 (48,6 %) пациентов, из которых было 16 (43,2 %) мужчин и 2 (5,4 %) женщины.

Видеоларингоскопия (ВЛС) проводилась на эндоскопических комплексах фирмы OLYMPUS EXERA-I и EXERA-II. Забор биопсийного материала производился из патологически измененных участков слизистой гортани при хронических и неопластических процессах. Фрагменты ткани, взятые при ФЛС, фиксировались в нейтральном формалине, проводились по стандартной методике и заливались в парафин. Срезы для гистологического исследования окрашивались гематоксилином и эозином. Мазки-отпечатки с биопсийного материала для цитологического исследования окрашивали азур-эозином. Цитологические и гистологические препараты изучались с помощью светового микроскопа «Axiostar plus» фирмы «К. Zeiss» – Германия.

Иммуногистохимическое исследование проводилось по общепринятой методике. Демаскировку антигенов осуществляли с помощью аппарата «PT Link» (Daco) в буфере c высоким pH. Для визуализации реакции антиген – антитело использовали систему «Super Sensitive Polymer – HRP Detection

System» (Bio Genex, США). Использовались моноклональные антитела к белкам р53 (clon DO-7, RTU, «Daco»), выявляющие «дикий» и «мутантный» варианты протеина; Ki67 (clon MIB – 1, RTU, «Daco»), CD138 ( clon MI 15, RTU, «Daco»). Результаты иммуногистохимической реакции оценивали по процентному содержанию окрашенных клеток при любой степени положительной экспрессии маркера.

Обработка статистических данных проводилась при помощи пакета программы «STATISTICA-7», были применены непараметрические методы обработки данных. Анализ дисперсии данных проводился по группам показателей: тест Левина, LSD-тест для определения статистической значимости изменения показателя в зависимости от морфологических изменений ткани, Т-тест для связанных выборок показателей.

Результаты исследования и обсуждение

Предопухолевые изменения различной степени тяжести были обнаружены у 57 (71,3 %) из 80 больных с хронической патологией гортани. Из них дисплазия (Д) эпителия гортани I степени обнаружена у 17 (21,3 %), дисплазия II степени – у 26 (32,5 %), дисплазия III степени – у 14 (17,5 %) пациентов. В 23 (28,8 %) наблюдениях у больных с ХГЛ и ПГ диспластических изменений эпителия гортани не зарегистрировано, при морфологическом исследовании подтвержден первоначальный клинико-эндоскопический диагноз. Для оценки предсказательной значимости маркеров пролиферации, апоптоза и клеточной дифференцировки как факторов прогноза злокачественного прогрессирования в группах риска была изучена их экспрессия в зависимости от выраженности предопухолевых изменений в слизистой оболочке гортани – от Д I (легкой) степени до Д III (тяжелой) степени. Кроме того, для оценки влияния распространенности опухолевого процесса на экспрессию указанных маркеров их уровень был определен у больных раком гортани I и III стадий.

На первом этапе исследования был проведен анализ экспрессии онкобелка p53 у больных с хроническими воспалительными заболеваниями гортани без диспластических изменений эпителия гортани и у пациентов с дисплазией различной степени тяжести. Выявлено значимое, более чем в 2 раза, увеличение этого маркера при диспласти-ческих изменениях I–III степени по сравнению с группой Д0 (рис. 1). Следует отметить, что при дисплазии I и II степени уровень экспрессии р53 составил 2,5 ± 1,61 и 2,1 ± 1,08, при III степени – 4,5 ± 0,21 соответственно, тогда как при отсутствии предопухолевых изменений этот показатель был равен 0,17 ± 1,12. При статистическом анализе полученных данных оказалось, что значимых отличий между группами пациентов с ДI и ДII не было (p>0,05). При этом обращает на себя внимание значимое увеличение этого маркера в эпителии

Рис. 1. Динамика показателей маркера апоптоза р53 в зависимости от степени тяжести пред- и опухолевых изменений гортани. Примечание: * – различия значимы по сравнению с показателями у больных с дисплазией эпителия 0–II ст. (p<0,05); # – различия значимы по сравнению с показателями у больных с дисплазией эпителия III ст. (p<0,05)

слизистой оболочки гортани при диспластическом процессе III степени по сравнению с уровнем экспрессии при ДI и ДII (p<0,05). Вероятнее всего, низкий уровень экспрессии р53 при дисплатиче-ских изменениях I и II степеней обусловлен не полностью реализованными процессами малиг-низации в эпителии гортани при начальных этапах канцерогенеза. Полученные нами данные наглядно подтверждают, что в основе одного из механизмов злокачественного перерождения эпителия лежит подавление функции апоптоза. В сложных дифференциальных случаях резкое увеличение уровня p53 при дисплазии слизистой оболочки гортани III степени может рассматриваться как дополнительный оценочный критерий. В процессе мониторинга за пациентами группы риска снижение показателя данного маркера может свидетельствовать о переходе предопухолевых изменений при ХГЛ и папилломах гортани в злокачественную опухоль гортани. Как известно, диспластический процесс III степени обратным изменениям не подвергается, тогда как при дисплазии II степени возможны два варианта развития событий – либо переход в легкую дисплазию I степени, либо прогрессирование тяжести предопухолевых изменений эпителия до дисплазии III степени. Исходя из этого, на этапах динамического наблюдения более пристальное внимание должно уделяться пациентам с дисплазией эпителия II степени. При значимом нарастании уровня маркера p53 и стабильной клинической ситуации эта категория больных должна подвергаться тщательному мониторингу.

Следующим этапом исследования явилось изучение динамики экспрессии маркера пролиферации Ki67. При его анализе в группе пациентов с ХГЛ и папилломами гортани без предопухолевой патологии, а также у больных с хроническими заболеваниями, ассоциированными с диспласти-ческими процессами I–III степени, выявлена закономерность, аналогичная изменениям экспрессии p53 (рис. 2). Низкий уровень экспрессии Ki67 отмечался при наличии хронических заболеваний гортани без дисплазии – 13,97 ± 1,71. По мере нарастания тяжести диспластических изменений наблюдалось его равномерное увеличение. Так, у пациентов с ХГЛ и папилломами гортани на фоне дисплазии слизистой оболочки I и II степени уровень экспрессии Ki67 был более чем в 2 раза выше, чем при Д0, составляя 30,2 ± 9,9 и 37,5 ± 3,3 соответственно. При диспластических изменениях ларингиального эпителия III степени наблюдались уже значимые различия уровня Ki67 (52,6 ± 9,9)

Рис. 2. Динамика показателей маркера пролиферации Ki67 в зависимости от степени тяжести пред- и опухолевых изменений гортани. Примечание: * – различия значимы по сравнению с показателями у больных с дисплазией эпителия 0–II ст. (p<0,05); # – различия значимы по сравнению с показателями с больных у дисплазией эпителия III ст. (p<0,05)

Рис. 3. Динамика показателей маркера клеточной дифференцировки CD138 в зависимости от степени тяжести пред- и опухолевых изменений гортани. Примечание: * – различия значимы по сравнению с показателями у больных с дисплазией эпителия 0–II ст. (p<0,05); # – различия значимы по сравнению с показателями у больных с дисплазией эпителия III ст. (p<0,05)

по сравнению с пациентами группы Д0 и больными с ХГЛ и папилломами, ассоциированными с предопухолевыми процессами I и II степени (p<0,05). При дальнейшем анализе установлено нарастание уровня экспрессии данного маркера. У больных со злокачественными изменениями в гортани показатель пролиферативной активности достоверно превышал значения Ki67 у пациентов с дисплазиями любой степени. Так, при раке гортани I стадии уровень маркера составил 62,7 ± 12,1, при РГ III стадии – 69,5 ± 7,5 (p<0,05).

Таким образом, уровень пролиферативной активности, отражением которой, безусловно, является выраженность экспрессии маркера Ki67, прямо пропорционален нарастанию степени тяжести диспластических и неопластических изменений в слизистой оболочке гортани. Этот факт свидетельствует об усилении процессов пролиферации при предопухолевых процессах и при их дальнейшей злокачественной трансформации. На основании полученных данных стойкое повышение маркера Ki67 выше уровня 52,6 следует рассматривать в качестве дополнительного критерия для включения больных с предраком гортани в группу риска.

Еще одним процессом, характеризующим онкогенез, является нарушение клеточной дифференцировки. В качестве маркера, отражающего степень выраженности этих изменений, был выбран и в динамике исследован CD138. При анализе его экспрессии выявлена обратная закономерность по сравнению с изменениями уровней маркеров Ki67 и p53. Во всех группах больных с хронической воспалительной патологией гортани как при наличии диспластических изменений I и II степени слизистой оболочки, так и без таковых зарегистрированы высокие показатели экспрессии маркера CD138 (рис. 3). Значимых различий в подгруппах больных без дисплазии и с Д I и Д II не выявлено (p>0,05). При отсутствии дисплазии эпителия уровень данного маркера составил 86,8 ± 9,2, при дисплазии I степени – 88,1 ± 42,3, при дис-пластических изменениях II степени – 87,2 ± 2,06.

Значимое снижение уровня CD138 отмечается при диспластических изменениях эпителия III степени по сравнению с группой больных без дисплазии, а также с ДI и ДII (p<0,05). Дальнейший анализ данных убедительно показал, что наиболее низкие значения экспрессии CD138 наблюдаются у больных с выраженной деградацией дифференцировки клеток эпителия гортани, т.е. при реализовавшемся раке гортани. Так, у больных РГ I стадии этот показатель равнялся 70,0 ± 8,5, при РГ III стадии – 42,8 ± 13,8. Указанные параметры были значимо ниже по отношению к уровню CD138 как в группах больных без предопухолевых изменений, так и у пациентов с диспластическими изменениями всех степеней.

На основании полученных результатов маркер клеточной дифференцировки CD138 рекомендуется рассматривать в качестве дополнительного критерия для отбора пациентов с диспластически-ми изменениями II степени в группу риска по раку гортани. Показатели уровня маркера у пациентов с дисплазией III степени могут являться основанием для тщательного мониторинга как кандидатов для развития плоскоклеточного рака гортани.

Таким образом, оценка динамики маркеров Ki67, p53 и CD138 у пациентов с хроническими воспалительными заболеваниями, ассоциированными с предопухолевыми изменениями I–III степени слизистой оболочки, а также раком гортани I и III стадий, показала разнонаправленные значимые различия этих параметров на этапах злокачественного прогрессирования. Полученные результаты дают возможность использовать эти маркеры в качестве дополнительных критериев для отбора больных в группы риска, а также для прогноза течения предраковых изменений слизистой оболочки гортани на этапах мониторинга у данного контингента пациентов. Стойкое повышение уровня маркера Ki67 выше 52,6 служит дополнительным критерием для включения больных с предраком в группу риска. Изменение уровня экспрессии маркера р53 в дисплазированном эпителии гортани при ДIII является признаком возможного прогрессирования предопухолевых изменений в рак.