Характеристика бактерий семейства Micrococcaceae, выделенных из разных биотопов района солеразработок (Пермский край)

Одними из наиболее распространенных химических веществ, поступающих в окружающую среду в результате промышленной деятельности человека, являются соединения класса фталатов - соли и эфиры орто -фталевой кислоты ( орто -ФК). В значительных количествах данные соединения обнаружены в районах работы предприятий горнодобывающей промышленности, в частности, на территории солеразработок Верхнекамского месторождения калийно-магниевых солей (г. Березники, г. Соликамск,

Пермский край). В связи с использованием фталат-содержащих реагентов в процессе обогащения и переработки калийных руд, высокие концентрации фталатов зафиксированы в отходах калийного производства (галитовых отходах, глинисто-солевых шламах, избыточных рассолах) [1, 2]. Широкое применение в различных отраслях химических промышленности имеют такие производные фталевой кислоты, как диметилфталат (ДМФ) и дибутилфталат (ДБФ), обладающие высокой растворяющей способностью и используемые с целью повышения эластичности и морозостойкости полимеров. Молекулы фталатов химически не связаны с полимерными цепями и поэтому легко выделяются в окружающую среду, попадая в организм человека через пищу, кожу или при вдыхании. Данные соединения признаны потенциально опасными для здоровья человека и животных [3, 17].

Среди микроорганизмов, осуществляющих аэробную деструкцию фталатов, обнаружены бактерии различных филумов, в том числе представители родов Micrococcus, Paenarthrobacter, Pseudoarthrobacter, Arthrobacter (семейство Micrococcaceae) [13-15, 18]. Организация генов, отвечающих за деградацию фталевой кислоты, была описана у штаммов Arthrobacter sp. 68b и Arthrobacter keyseri 12B. Для данных штаммов, а также штамма Arthrobacter sp. WY, описан метаболический путь деструкции орто-ФК через образование протокатеховой кислоты до основных продуктов жизнедеятельности клетки [12, 14, 19]. Однако к настоящему времени недостаточно изученной остается способность ар-тробактерий к деструкции ксенобиотиков, в том числе фталатов в условиях повышенного засоления среды.

Цель настоящей работы – характеристика бактерий семейства Micrococcaceae , выделенных из района промышленных разработок Верхнекамского месторождения солей (Пермский край), способных к деструкции фталатов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования. Из рабочей коллекции микроорганизмов Лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии «Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН» отобрано 14 штамм бактерий, идентифицированных ранее как представители рода Arthrobacter. Исследуемые штаммы были выделены из образцов техногенно-минеральных образований, грунта и донных отложений (таблица 1), загрязненных отходами химических и соледобывающего производств (г. Березники, г. Соликамск, Пермский край).

Среды и условия культивирования. Для роста бактерий использовали минеральную среду Раймонда (МСР) следующего состава (г/л): NH₄NO₃ – 2,0; MgSO₄x7H2O – 2,0; KH₂PO₄ – 2,0; Na₂HPO₄ – 3,0; CaCl₂x6H₂O – 0,01; Na₂CO₃ – 0,1; дополненную 1% раствором MnSO₄x2H₂O – 2 мл/л и 1% раствором FeSO₄x7H₂O – 1 мл/л [10], с добавлением хлорида натрия (0 – 11%). В качестве субстратов использовали орто -ФК, ДБФ, нафталин, гентизат, салицилат, фенантрен, бифенил и бензойную кислоту в концентрации 1 г/л. Для приготовления богатой среды Раймонда (БСР) в МСР добавляли 5 г/л триптона и 2,5 г/л дрожжевого экстракта в качестве ростовых субстратов. Культивирование микроорганизмов в жидких средах проводили при 28°С на термостатируемой качалке при 100 об/мин.

Для получения агаризованных сред агар («Helicon», Россия) добавляли до конечной концентрации 15 г/л. Культивирование микроорганизмов осуществляли в термостате при 28° С.

Наличие плазмидной ДНК выявляли методом пульс-электрофореза с использованием прибора CHEF DR II («Bio-Rad Laboratories», США). Бактерии выращивали в 10 мл БСР без внесения NaCl, или в 10 мл МСР, содержащей 10 мг/мл NaCl и один из углеводородов ( орто- ФК (1 г/л), до ОП₆₀₀=1,0. Клетки осаждали центрифугированием (9000 об/мин, 3 мин) и отмывали дважды в ТЕ-буфере (10мМ трис/HCl, pH 7,6;

1 мM ЭДТА, рН 8,0). Агарозные блоки готовили согласно рекомендациям производителя («Bio-Rad Laboratories», США). Блоки обрабатывали лизоцимом (1 мг/мл) при 37°С в течение 5-16 ч, протеиназой К (1 мг/мл) – при 50°С в течение 12-18 ч, нуклеазой S1 (5 ед. на агарозный блок) – при 37°С, 3,5 ч. Электрофорез образцов осуществляли в 1%-ном агарозном геле (Pulsed Field Certified Agarose, «Bio-Rad Laboratories», США) в 0,5 TBE-буфере при 14°С, 6 В/см, время пульсации от 60 с до 120 с в течение 24 ч. Гель окрашивали бромистым этидием (0,5 мг/л, 10 мин) и фотографировали в ультрафиолете с использованием системы гель-документации («Bio-Rad Laboratories», США). Размер внехромосомаль-ной ДНК оценивали в сравнении с электрофоретической подвижностью маркера молекулярных масс «DNA Size Markers – Yeast Chromosomal» («Bio-Rad Laboratories», США).

Филогенетический анализ полученных нуклеотидных последовательностей 16S рДНК проводили с использованием программ CLUSTAL W , Sequence Scanner v 2.0. Поиск гомологичных последовательностей осуществляли при использовании баз данных GenBank и EzTaxon . Построение филогенетического дерева проводили с помощью программы MEGA7 c использованием метода «neighbor joining» [16].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Штаммы бактерий, отобранные для исследований, ранее были идентифицированы как представители рода Arthrobacter (сем. Micrococcaceae ) [4, 6, 8]. В 2016 году виды рода Arthrobacter были реклассифицированы в отдельные 6 родов семейства Micrococcaceae [12]. В таблице 1 приведены новые названия исследуемых штаммов, представленные тремя родами Arthrobacter , Glutamicibacter и Pseudoarthrobacter семейства Micrococcaceae .

На дендрограмме (рис. 1), показывающей филогенетические отношения исследуемых бактерий, четко видно, что штаммы разделяются на четыре кластера, имеющих отдельны ветви. Штаммы SMB11, SMB145, DF14, SF27 и B905 группируются с типовым штаммом вида A. сrystallopoietes , штамм M56-102 – с типовым штаммом вида A. pityocampae. Остальные штаммы, объединенные в два отдельно расположенных кластера, составляют группы, филогенетически близкие к штаммам родов Glutamicibacter и Pseudoarthrobacter .

Исследуемые бактерии были выделены из загрязненных почв, шламов и донных отложений, характеризующихся высоким содержанием хлорида натрия и наличием органических пол-

Таблица 1. Результаты филогенетического анализа (ген 16S рРНК) бактерий

Источник выделения	Штамм	Типовой штамм ближайшего родственного вида и номер в базе данных GenBank	Сходство генов 16S рРНК, %	Ссылка
Почва, глубина 5-10 см, на расстоянии 500 м от солеотвала БКПРУ-1	SMB11 (ВКМ Ас-2552)	Arthrobacter crystallopoietes DSM 20117 T (X80738)	99,7	[6]
	SMB145 (ВКМ Ас-2551)	Arthrobacter crystallopoietes DSM 20117 T (X80738)	99,7
	SF27 (ВКМ Ас-2063)	Arthrobacter crystallopoietes DSM 20117 T (X80738)	99,85
Донные отложения, р. Зырянка, вблизи солеотвала БКПРУ-1	DF14 (ВКМ Ас-2064)	Arthrobacter crystallopoietes DSM 20117 T (X80738)	99,89
Почва/грунт на расстоянии 3 м от солеотвала БКПРУ-1	B905 (ВКМ Ас- 2550)	Arthrobacter crystallopoietes DSM 20117 T (X80738)	99,7
Донные отложения промышленных стоков, «Промканал»	PD13	Arthrobacter pascens DSM20545T (X80740)	99,65	[5]
Ризосферная почва мятлика лугового ( Poa pratensis ), у солеотвала СКПРУ-1	M56-102	Arthrobacter pityocampae Tp2 T (EU855749)	99	[4]
Почва, на расстоянии 5 м от солеотвала БКПРУ-1	SN17 (ВКМ Ас-2065)	Glutamicibacter arilaitensis Re117 T (NR_074608)	100	[6]
Ризосферная почва бескильницы расставленной ( Puccinellia d^stans ), 4 м от рассолосборника, солеотвал СКПРУ-2	BR3-22(1)	Glutamicibacter halophytocola KLBMP T (JX993762)	99	[9]
ТМО2, шламохранилище, глубина 0,2 м, БКПРУ-2	BO25	Glutamicibacter nicotianae DSM 20123T (NR_026190)	99,1	[8]
Ризосферная почва бескильницы расставленной ( Puccinellia d^stans ), 4м от рассолосборника, солеотвал СКПРУ-2	BR4- 2	Glutamicibacter nicotianae DSM 20123T (NR_026190)	99	[9]
ТМО, шламохранилище, глубина 0,5 м, БКПРУ-2	BO19	Pseudoarthrobacter oxydans DSM 20119 T (X83408)	100	[8]
ТМО2, шламохранилище, глубина 0,4 м, БКПРУ-2	BO34-1	Pseudoarthrobacter oxydans DSM 20119 T (X83408)	100	[8]

Примечание: БКПРУ-1 - Березниковское калийное промышленное рудоуправление №1; СКПРУ-2 - Соликамское калийное промышленное рудоуправление №2; ТМО - техногенно-минеральное образование лютантов, в частности фталатов [1]. Установлено, что штаммы обладали широкой субстратной специфичностью и были способны к росту на моно- и поли ароматических углеводородах (нафталин, гентизат, салицилат, фенантрен, бифенил и бензойная кислота) при культивировании в присутствии 3% NaCl.

Все штаммы использовали орто -ФК, а восемь штаммов - ДБФ в качестве единственного источника углерода и энергии (табл. 2). Кроме того, штаммы способны к росту на протокатеховой кислоте (ПКК) - основном метаболите разложения орто -ФК. На основании полученных результатов можно предположить, что утилизация ДБФ

Pseudoarthrobacterpolychromogenes DSM 20136^T (NR 026192)

Pseudoarthrobacter siccitolerans 4J27^T (NR 108849)

Pseudarthrobacterphenanthrenivorans Sphe3^T (NR 074770)

Arthrobacter oxydans DSM 20119^T (NR 026236)

PD13-12

BO34-1

BO19

Pseudoarthrobacter scleromae YH 2001^T (NR 041824)

Arthrobacter oryzae KV-651^T (NR 041545)

Arthrobacter humicola KV-653^T (NR 041546)

Arthrobacter ginsengisoli DCY81^T (KF212463)

Arthrobacter sulfonivorans ALL^T (NR 025084)

__I Arthrobacterpascens DSM 20545^T (NR 026191)

66 ' Arthrobacter globiformis JCM 1332^T (NR 112192) -------Glutamicibacter soli SYB2^T (NR 044338)

---Glutamicibacter bergerei Ca106^T (NR 025612)

BO25

BR3-22(1)

BR4-2

Glutamicibacter halophytocola KLBMP 5180^T (JX993762)

SN17

Glutamicibacter mysorens LMG 16219^T (NR 114924)

Glutamicibacter arilaitensis Re117^T (NR 074608)

Glutamicibacter nicotianae DSM 20123^T (NR 026190)

70 1— Arthrobacter agilis DSM 20550 ^T (NR 026198) I '— Arthrobacterpityocampae Tp2^T (NR 133969)

I--------M56-102

B905 SMB11

SF27

100 DF14

SMB145

Arthrobacter crystallopoietes DSM20117^T (NR 026189)

0.002

Рис. 1 . Дендрограмма сходства нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, показывающее филогенетические отношения между исследуемыми штаммами и типовыми штаммами родов Arthrobacter, Glutamicibacter и Pseudoarthrobacter (семейство Micrococcaceae ).

В скобках указаны номера в GenBank исследуемыми штаммами осуществляется через стадии образования орто-ФК и ПКК до основных продуктов жизнедеятельности микробной клетки, как показано на примере ранее описанных бактерий-деструкторов фталатов [17, 19].

Исследуемые бактерии способны к росту как в среде без добавления NaCl, так и при повышенном засолении среды (табл. 3). Все штаммы росли на полноценной среде при содержании 9% NaCl, а большинство штаммов – при 11% NaCl. На минеральной среде с орто -ФК и/или нафталином в качестве субстратов все штаммы росли при концентрации 6% NaCl в среде культивирования. Три штамма (табл. 3) были способны к росту на ароматических субстратах при

9% NaCl. Согласно полученным данным исследуемые штаммы относятся к умеренно галото-лерантным микроорганизмам по классификации Д. Кашнера [7].

В результате исследования на наличие экс-трахромосомной ДНК в клетках пяти штаммов, выращенных на МСР с орто -ФК в качестве субстрата, обнаружены плазмиды большого размера. У штаммов SF27 и SMB11 выявлены плазмиды размером ~340 т.п.н., у штаммов DF14, BO34-1 и BR4-2 – плазмиды молекулярной массой ~460, ~300 и ~325 т.п.н., соответственно. В литературе описана плазмидная локализация генов деструкции орто -ФК для штамма Arthrobacter keyseri 12B [14].

Таблица 2. Рост бактерий на различных ароматических субстратах

Штамм	Субстрат
	орто -ФК	ДБФ*	ПКК**	Генти-зат	Фенан -трен	Бифенил	Салицилат	Бензоат	Нафталин
SF27	++	++	++	±	++	—	+	—	+
DF14	+	+	++	+	++	—	±	+	+
B905	±	±	++	—	±	—	—	—	+
SMB11	±	+	++	+	±	—	+	+	+
SMB145	±	+	++	+	—	—	+	+	+
PD13	++	++	++	—	—	+	±	±	±
SN17	++	+	++	±	—	±	±	±	+
BO25	+	±	++	—	—	+	+	+	±
BR3-22(1)	±	±	++	—	—	—	—	±	—
BR4-2	+	+	++	—	—	—	—	—	—
BO34-1	++	++	++	+	—	+	+	+	±
BO19	++	+	++	+	—	+	+	++	+
M56-102	+	+	+	—	—	+	±	+	±

Примечание: «++» – хороший рост (значение OD600 = 0,5 о.е. и выше); «+» – наличие роста (OD600 = 0,35 – 0,5 о.е.); «±» – слабый рост (OD600 = 0,2 - 0,35 о.е.); «–» – отсутствие роста,

* – дибутилфталат; ** – протокатеховая кислота

Таблица 3. Рост бактерий в присутствии разных концентраций хлорида натрия

Штамм	Концентрация NaCl (%)
	Богатая среда (БСР)				Минеральная среда (МСР) с орто -ФК/ нафталином
	0	6	9	11	0	6	9
SF27	++	++	+	+	++	+	—
DF14	++	++	++	+	+	+	—
B905	++	+	±	—	+	±	±
SMB11	++	++	±	±	++	+	—
SMB145	++	++	+	±	++	++	±
PD13	++	++	+	+	++	+	—
SN17	++	++	+	±	++	+	—
BO25	++	++	++	+	+	+	±
BR3-22(1)	++	++	±	—	±	±	—
BR4-2	++	++	++	—	+	+	—
BO34-1	++	+	—	—	++	+	—
BO19	++	+	±	—	++	+	—
M56-102	++	+	±	—	+	+	—

Примечание: «++» – хороший рост, колонии размером более 3 мм; «+» – наличие роста, колонии размером 1–2 мм; «±» – слабый рост, колонии размером менее 1 мм; «–» – отсутствие роста

ВЫВОДЫ

Таким образом, показано, что штаммы семейства Micrococcaceae , выделенные из района солеразработок (Пермский край), характеризуются большим видовым разнообразием. Бактерии идентифицированы как представители трех родов Arthrobacter, Glutamicibacter и Pseudoarthrobacter, близкородственны видам A. сrystallopoietes, A. pityocampae и A. pascens (род Arthrobacter ) , G. nicotianae, G. halophytocola, G. arilaitensis (род Glutamicibacter )

и Pseudoarthrobacter oxydans. Штаммы являются галотолерантными организмами и способны утилизировать различные ароматические углеводороды, в частности, фталаты и нафталин при повышенном засолении среды (6 – 9 % NaCl). Из исследованных штаммов семейства Micrococcaceae наиболее широкой субстратной специфичностью характеризуются штаммы рода Arthrobacter (филогенетически наиболее близкие к виду A. сrystallopoietes), способные к росту на орто-ФК, ДБФ, нафталине и фенантрене. В результате проведенного исследования штаммов-деструкторов моно(поли)аромати-ческих соединений, фталатов, выявлены бактерии, перспективные для разработки новых биотехнологий, направленных на детоксикацию территорий, загрязненных данными токсичными поллютантами, в том числе в условиях засоления.