Характеристика бактерий, выделенных из рудника Верхнекамского месторождения солей (Пермский край)

Верхнекамское месторождение солей (ВКМС) является одним из крупнейших в мире. На территории Пермского края с 1934 г. ведутся интенсивные работы по разработке и промышленной добыче калийных, калийно-магниевых и натриевых солей. В результате воздействия огромного количества отходов калийных предприятий происходит засоление почв, поверхностных и подземных вод, что способствует формированию на территории солеразработок специфических условий для выживания растений и микроорганизмов.

Ранее, из наземных экотопов (засоленных почв, грунтов, водоемов, отходов производства), а также из соляных пород (каменной соли, карналлита) ВКМС были выделены и охарактеризованы гало-фильные и галотолерантные бактерии и археи раз-

личных таксономических групп [Yastrebova et al., 2009; Корсакова и др., 2013, 2017; Карташова и др., 2017; Кашапова и др., 2018; Ястребова, Корсакова, Плотникова, 2018; Пьянкова, Кашапова, Плотникова, 2019]. Описаны новые таксоны бактерий, выделенных из техногенных вод шламохра-нилищ и продуктов обогащений калийных руд [Ананьина и др., 2007; Plotnikova et al., 2011; Реут-ских, Саралов, 2012]. Кроме того, обнаружено, что некоторые бактериальные штаммы способны к разложению ряда органических загрязнителей окружающей среды, таких как фталаты [Ястребова, Пьянкова, Плотникова, 2019], нафталин [Ананьина, и др., 2011], бифенил и хлорбифенилы [Егорова и др., 2018], что указывает на возможность их использования при разработке новых технологий восстановления загрязненных/засолен ных почв и водоемов. В настоящее время продолжаются работы по изучению разнообразия бактерий в микробных сообществах района солеразработок ВКМС.

Цель работы – выделение галофильных/гало-толерантных микроорганизмов из донных отложений рассолоотводящих выработок и рассолосбор-ников рудника ВКМС (Пермский край), их таксономическая и эколого-физиологическая характеристика.

Материалы и методы исследования

Образцы для исследований . Для выделения микроорганизмов были использованы образцы глинистых донных отложений, отобранные из рассолоотводящих выработок и рассолосборников в одном из рудников ВКМС (г. Соликамск, Пермский край). В образцах водных вытяжек глинистых осадков были определены значения pH и общее содержание водорастворимых солей [Практикум …, 2001].

Для выделения микроорганизмов использован метод накопительного культивирования в богатой среде Раймонда (БСР). Для приготовления БСР в минеральную среду Раймонда (МСР) [Raymond, 1961] добавляли триптон (5 г/л), дрожжевой экстракт (2.5 г/л) и хлорид натрия (100, 150 и 200 г/л). Для получения накопительных культур в колбы со 100 мл БСР, содержащей разные концентрации соли, добавляли 1 г глины. Культивирование проводили на шейкере при 100 об./мин. в течение 3 недель, после чего осуществляли высев суспензии на агаризованную БСР (15 г/л агара) с содержанием 150 г/л NaCl. Отдельные колонии микроорганизмов, отличавшихся по морфологии, были отобраны для дальнейших исследований.

ДНК-типирование чистых культур бактерий проводили методом BOX-ПЦР [Versalovic et al., 1994]. Для визуализации ПЦР-продуктов проводи- ли электрофорез в горизонтальном агарозном геле (2.0%) в буфере TBE x 1 (Трис – 10.8 г/л, борная кислота – 5.5 г/л, 0.5М ЭДТА – 4 мл, вода дистиллированная – 79.7 мл/л) при комнатной температуре, напряжении 5‒15 В/см в течение 1.5 ч. Агарозные гели окрашивали раствором бромистого этидия (0.5 мкг/мл) в течение 5‒10 мин. и фотографировали в УФ-свете с помощью системы гель-документирования BioDocAnalyze («Bio-Rad Laboratories», США). Для определения размеров фрагментов использовали маркер длин ДНК 100+ bp DNA Ladder («Евроген», Россия).

Идентификацию бактерий осуществляли на основе анализа гена 16S рРНК. Для выделения ДНК из чистых культур бактерий использовали метод «щелочного лизиса». Амплификацию фрагмента гена 16S рРНК проводили с универсальными бактериальными праймерами 27F и 1492R [Lane, 1991] на амплификаторе C1000 TouchTM Thermal Cycler («Bio-Rad Laboratories», США). Определение нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК было осуществлено с использованием праймера 27F и применением набора реактивов Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit на автоматическом секвенаторе Genetic Analyser 3500XL («Applied Biosystem», США) в Пермском государственном национальном исследовательском университете (кафедра ботаники и генетики растений). Филогенетический анализ полученных нуклеотидных последовательностей размером 871‒952 п.н. проводился с использованием программ Sequence Scanner v. 2.0. MEGA 7.0 []. Поиск гомологичных последовательностей осуществлялся с помощью базы данных EzBioCloud []. Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей и построение филогенетических деревьев проводили с использованием программы MEGA 7.0. При построении филогенетических деревьев применяли кластерный метод «neighbor-joining». Оценку статистической достоверности ветвления («bootstrap»-анализ) проводили на основе 1000 альтернативных деревьев.

Изучение физиологических свойств бактериальных штаммов . Устойчивость выделенных бактерий к различным концентрациям хлорида натрия оценивали по появлению и размеру колоний при росте на агаризованной БСР с содержанием соли от 10 до 300 г/л. Оценку роста колоний проводили через две недели культивирования.

Рост бактерий при разных значениях pH определяли при концентрации 70 г/л NaCl в буферных системах, приготовленных на основе БСР. Штаммы культивировали на агаризованной среде БСР при рН 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0. Рост учитывали на 7-й день культивирования [Методы …, 1983].

Для оценки роста при разных температурах штаммы культивировали на агаризованной БСР (70 г/л NaCl) при +4, 28, 35, 40 и 45°С. Рост учитывали на 7-й день культивирования.

Способность бактерий разлагать ароматические углеводороды оценивали путём культивирования в жидкой минеральной среде Раймонда (МСР) (70 г/л NaCl) с добавлением бензойной и салициловой кислот (1 и 0.5 г/л, соответственно) в качестве единственного источника углерода и энергии. Рост оценивали при определении оптической плотности культуры (ОП 600 ) на спектрофотометре UV-Visible BioSpec-mini («Shimadzu», Япония) на 7-й

Результаты и их обсуждение

Выделение чистых культур бактерий

Химический анализ водной вытяжки глинистых осадков показал, что образцы имеют высокое содержание водорастворимых солей – от 41 до 244 г/кг сухого грунта. Водородный показатель вытяжки в основном имеет значения, близкие к нейтральным рН~6.0‒7.6, за исключением более щелочной пробы из рассолосборника 2 с рН 8.8 (табл. 1).

день культивирования.

Таблица 1

Содержание водорастворимых солей и рН в образцах глинистых донных отложений

Место отбора	Дата отбора	Сумма водорастворимых солей, г/кг	рН
Рассолоотводящая выработка 1	25.06.2019 (глина рыжая)	72	6.9
	25.06.2019 (глина бурая)	41	6.8
	01.10.2019	63	7.6
Рассолоотводящая выработка 2	25.06.2019	46	6.9
	01.10.2019	244	7.4
Рассолосборник 1	25.06.2019	52	6.6
	01.10.2019	238	6.7
Рассолосборник 2	01.10.2019	226	8.8

Из высокоминерализованных образцов глинистых отложений было выделено 29 штаммов бактерий. Отбор изолятов основывался на различиях в морфологии колоний, выросших на агаризованной среде БСР, и сравнительном анализе ДНК чистых культур бактерий методом BOX-ПЦР. По результатам анализа BOX-профилей (данные не приводятся) представители разных геномогрупп были отобраны для секвенирования последовательностей гена 16S рРНК.

Штаммы семейства Halomonadaceae (класс Gammaproteobacteria )

В результате секвенирования и сравнения последовательностей гена 16S рРНК с типовыми штаммами из базы данных EzBioCloud [] было установлено, что 13 выделенных культур являются представителями семейства Halomonadaceae (класс Gammaproteobacteria) и относятся к родам Chromohalobacter (5 штаммов) и Halomonas (7 штаммов).

Все изоляты рода Chromohalobacter были близкородственны штамму C . canadensis ATCC43984^T (табл. 2). Уровень идентичности по гену 16S рРНК у большинства штаммов с типовым штаммом составлял 99.89%, у штамма DK1K – 99.56%, в то же время, типирование методом BOX-ПЦР показало различие в структуре геномов этих штаммов (данные не приводятся).

Установлено, что все выделенные штаммы яв- ляются галофильными организмами, требующими для роста наличия соли в среде культивирования (выше 30 г/л) и способными расти при 300 г/л NaCl. Штаммы эффективно росли при высоких значениях pH среды – до 9.0, т.е. являются алка-лофилами. Интересно, что один из штаммов этой группы (штамм D10) был выделен из экотопа с рН 8.8, другие штаммы – из образцов с нейтральной рН (табл. 1, 2).

Три штамма рода Halomonas (DK1M, DG2M, D3A) имели 100%-ный уровень сходства по генам 16S рРНК с типовыми штаммами видов H . alka-liantarctica , H . titanicae , H . alimentaria , штаммы DR1, D2 – около 99.4% сходства с H . taeanensis и штамм DG2K – 99.02% сходства с H . utahensis (табл. 2). Интерес для дальнейших исследований представляет штамм D12, имеющий сходство по гену 16S рРНК с типовыми штаммами видов H . meridiana , H . piezotolerans , H . songnenensis ниже 99%. Штамм D12 был выделен из образца осадка рассолосборника, характеризующегося высоким уровнем минерализации (226 г/кг) и щелочными условиями среды (рН 8.8).

Большинство штаммов рода Halomonas (DK1M, DG2K, DG2M, DG3K) являются галотоле-рантными и могут расти как без соли в среде культивирования, так и в присутствии хлорида натрия – до 250 г/л. Исключением является штамм Halo-monas sp. DR1, не способный к росту без содержания соли в среде. Кроме того, представителей этого рода, выделенных из глинистых отложений, можно отнести к группе алкалофильных микроор- 10.0, кроме штамма Halomonas sp. DR1 (растет ганизмов, т.к. большинство из них характеризуется при рН 6.0‒8.0).

ростом при значении водородного показателя до

Таблица 2

Анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изолированных бактерий

Штамм

Типовой штамм

Номер в GenBank

Сходство, %

Источник выделения (дата отбора пробы)

Класс Gammaproteobacteria , порядок Oceanospirillales , семейство Halomonadaceae , род Chromohalobacter

DK1K	Chromohalobacter canadensis ATCC 43984T	AJ295143	99.56	Рассолоотводящая выработка 1, глина бурая (25.06.19)
DG3G	Chromohalobacter canadensis ATCC 43984T	AJ295143	99.89	Рассолоотводящая выработка 2 (25.06.19)
D1	Chromohalobacter canadensis ATCC 43984T	AJ295143	99.89	Рассолоотводящая выработка 2 (01.10.19)
D5	Chromohalobacter canadensis ATCC 43984T	AJ295143	99.89	Рассолоотводящая выработка 2 (01.10.19)
D10	Chromohalobacter canadensis ATCC 43984T	AJ295143	99.89	Рассолосборник 2 (01.10.19)

Класс Gammaproteobacteria , порядок Oceanospirillales , семейство Halomonadaceae , род Halomonas

DK1M	Halomonas alkaliantarctica CRSST	AJ564880	100.00	Рассолоотводящая выработка 1, глина бурая (25.06.19)
DR1	Halomonas taeanensis BH539T	AY671975	99.45	Рассолоотводящая выработка 1, глина рыжая (25.06.19)
DG2K	Halomonas utahensis DSM 3051T	AJ306893	99.02	Рассолосборник 1 (25.06.19)
DG2M	Halomonas titanicae BH1T	AOPO010000 38	100.00	Рассолосборник 1 (25.06.19)
D2	Halomonas taeanensis BH539T	AY671975	99.43	Рассолоотводящая выработка 2 (01.10.19)
D3A	Halomonas alimentaria YKJ-16T	AF211860	100.00	Рассолоотводящая выработка 2 (01.10.19)
D12	Halomonas meridiana DSM 5425T Halomonas piezotolerans NBT06E8T Halomonas songnenensis NEAU-ST10-39T	AJ306891 MN435603 JQ762289	98.96	Рассолосборник 2 (01.10.19)

Класс Gammaproteobacteria , порядок Nevskiales , семейство Salinisphaeraceae , род Salinisphaera

SWV1	Salinisphaera hydrothermalis EPR70T	EU740416	95.94	Рассолоотводящая выработка 2 (25.06.19)
SHV1	Salinisphaera hydrothermalis EPR70T	EU740416	99.89	Рассолоотводящая выработка 1, глина рыжая (25.06.19)
SHV2	Salinisphaera hydrothermalis EPR70T	EU740416	96.62	Рассолоотводящая выработка 1, глина рыжая (25.06.19)
SHV6	Salinisphaera hydrothermalis EPR70T	EU740416	99.89	Рассолоотводящая выработка 1 (01.10.19)
RV14	Salinisphaera hydrothermalis EPR70T	EU740416	96.63	Рассолосборник 1 (01.10.19)

Класс Bacilli, порядок Bacillales, семейство Bacillaceae

DG3K	Virgibacillus halodenitrificans DSM 10037T	AY543169	100.00	Рассолоотводящая выработка 2 (25.06.19)
D13A	Oceanobacillus oncorhynchi subsp. incaldanensis 20AGT	AJ640134	100.00	Рассолосборник 2 (01.10.19)

Получены предварительные данные о способности штаммов рода Halomonas использовать в качестве ростовых субстратов моноароматические соединения. Так, Halomonas sp. DK1M эффективно рос на минеральной среде Раймонда с салициловой кислотой (0.5 г/л) в качестве единственного источника энергии, а штамм Halomonas sp. DR1 проявлял способности к деструкции бензойной кислоты (1 г/л).

Представители родов Chromohalobacter и Halomonas являются галофильными/галотоле-рантными бактериями, которые широко распространены в засоленных местообитаниях – морях, соленых озерах, солончаках, солеварнях, соленых пищевых продуктах, также были выделены из месторождений солей, соляных шахт [Ai, Huang, Wang, 2018; Megaw, Gilmore, 2018]. Известно использование штаммов родов Chromohalobacter и Halomonas в биотехнологических процессах, в том числе – в качестве продуцентов осмотротекторных соединений, аминокислот [Edbeib, Wahab, Huyop, 2016; Пьянкова, Ананьна, 2018] деструкторов загрязнителей окружающей среды [Кандаурова, Ястребова, Плотникова, 2017; Nanca et al., 2018].

Штаммы рода Salinisphaera

(класс Gammaproteobacteria )

Анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК показал, что штаммы SHV1 и SHV6 имели наибольший уровень сходства (99.89%) с Salinisphaera hydrothermalis EPR70^T (класс Gammaproteobacteria , порядок Nevskiales , семейство Salinisphaeraceae ). Данные штаммы, а также три других изолята (SHV2, RV14 и SWV1) имели незначительные различия по BOX-ПЦР профилям (данные не приводятся). Штаммы SHV2 и RV14 при анализе фрагмента гена 16S рРНК размером 895‒923 п.н. (секвенирование с использованием праймера 27F) имели сходство с типовым штаммом вида Salinisphaera hydrothermalis на уровне 96.62%, а сходство почти полного гена 16S рРНК (размер анализируемого фрагмента 1.411 п.н.) штамма SWV1 – на уровне 95.94% (табл. 2). На дендрограмме показано, что эти три штамма образуют отдельный кластер (рисунок). Полученные данные позволяют предположить, что штаммы SHV2, RV14 и SWV1 могут представлять новые таксономические единицы, поэтому дальнейшее их исследование вызывает несомненный интерес.

----------------Sahnisphoera doWonemis CL-E$53^T [EF988634]

----------------- SaJtoiiiphaera shabawiist E1L3A^T [AJ421425]

• ■ Salinisphaera aquimarina CCMM005^T [KYO6OO12]

__I Salinisphaera haloplnla YIM 9Ч6П [JN020587] ioo* Salinisphaera orenit MK-B5^T [HM137558]

------------- Salinispluwra iaponica YTM-1^T [AB735546]

---------------SWV1, SHV2, RV14

rSHVl. SHV6

10» I— Sdlinisphaera Indrothermahi EPR70^T [EU7404I6]

Филогенетическое древо, построенное с использованием метода neighbor-joining, показывающее положение исследуемых изолятов в роде Salinisphaera , основанное на сравнении нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК длиной 895‒1411 п.н.

Эволюционные расстояния рассчитаны с использованием метода Джукса-Кантора. Масштаб соответствует 5 нуклеотидным заменам на каждые 1000 нуклеотидов. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью «bootstrap» анализа 1 000 альтернативных деревьев (приведены значения выше 50%). Изоляты с идентичными генами 16S рРНК, перечислены через запятую

Ранее штаммы рода Salinisphaera были изолированы из воды, донных отложений, отходов производства калийных солей (г. Соликамск) [Корсакова, 2014].

Изолированные штаммы рода Salinisphaera являются галофильными бактериями, при этом у штаммов SHV1, SHV6 наблюдается рост при содержании 10‒270 г/л NaCl в среде, а у изолятов SHV2, SWV1, RV14 – при 10‒300 г/л. Выделенные штаммы рода Salinisphaera растут при pH среды

• 6.0‒7.0 и температуре от +28 до +40°C, но не растут при +4°C.

Штаммы семейства Bacillaceae(класс Bacilli)

Из образцов глинистых осадков рассолосбор-ника и рассолоотводящей выработки рудника выделено два штамма семейства Bacillaceae (класс Bacilli ). Штаммы DG3K и D13A имели 100%-ное сходство с Virgibacillus halodenitrificans DSM

10037^T и Oceanobacillus oncorhynchi subsp. incaldanensis 20AG^T, соответственно (табл. 2).

Штамм Virgibacillus sp. DG3K является галото-лерантным, алкалофильным организмом: может расти без соли в среде культивирования и в присутствии 250 г/л NaCl, а также при значениях pH среды 7.0‒10.0. Примечательно, что штамм Virgibacillus sp. DG3K не только является алкало-филом, но также способен к эффективному росту при температурах до +45°C.

Штамм Oceanobacillus sp. D13A был изолирован из образца осадочной глины, характеризующейся рН 8.8 и высоким содержанием солей (табл. 1). Типовой штамм Oceanobacillus on-corhynchi subsp. incaldanensis 20AG^T, близкородственный штамму D13A, является галофильным, алкалотолерантным микроорганизмом: растет при 50‒200 г/л NaCl (с оптимальным ростом при 100 г/л соли) и при pH 6.5‒9.5 (оптимум pH 9.0) [Romano et al., 2006]. Из района солеразработок Верхнекамского месторождения (г. Соликамск, г. Березники) ранее были выделены солеустойчивые бактерии родов Virgibacillus и Oceanobacillus [Корсакова, 2014].

Заключение

В результате исследования образцов глинистых отложений водоотводящей выработки и рассоло-сборника рудника ВКМС были получены новые данные о разнообразии бактерий района солеразработок ВКМС. Выделено 29 штаммов, относящихся к классам Gammaproteobacteria (семейство Halomonadaceae , семейство Salinisphaeraceae ) и Bacilli (семейство Bacillaceae ). Филогенетический анализ показал, что штаммы SHV2, RV14, SWV1 представляют новые таксономические единицы в семействе Salinisphaeraceae ; исследование этих штаммов будет продолжено. Среди изолятов выявлены галофильные бактерии, способные к росту при концентрации хлорида натрия в среде до 300 г/л. Ряд штаммов родов Oceanobacillus , Virgibacillus , Chromohalobacter , Halomonas способны к росту в щелочной среде (рН 9.0‒10.0), являются алкалофилами. При изучении биодеграда-ционных свойств изолятов, у двух галофильных штаммов рода Halomonas обнаружена способность к деструкции моноароматических углеводородов – салициловой и бензойной кислот, что предполагает дальнейшее изучение этих штаммов с перспективой использования их в биотехнологиях восстановления загрязненных территорий с высоким уровнем минерализации.

Работа выполнена в рамках государственного задания, номер госрегистрации темы: АААА-А19-119112290008-4.