Характеристика изменений пула аминокислот больших полушарий головного мозга крыс с субтотальной церебральной ишемией

Введение. Аминокислoты играют важную роль в метаболизме и функционировании головного мозга. Это объясняется не только их исключительной ролью источников синтеза большого числа биологически важных соединений (белки, медиаторы, липиды, биологически активные амины). Аминокислоты и их дериваты участвуют в синаптической передаче в качестве нейротрансмиттеров и нейромодуляторов (глутамат, аспартат, глицин,

ГАМК, таурин), а некоторые аминокислоты участвуют в образовании медиаторов нервной системы: метиoнин – ацетилхолина, ДОФА, дофамина; тирозин – катехоламинов; серин и цистеин – таурина; триптофан – серотонина; L-аргинин – NO; глутаминовая кислота – глутамата [1–3].

Таким образом, представляет интерес изучение состояния пула аминокислот при субтотальной ишемии головного мозга (СИГМ).

Цель исследования. Оценить изменения пула аминокислот у крыс с субтотальной ишемией головного мозга.

Материалы и методы. Эксперименты выполнены на 16 самцах беспородных белых крыс массой 260±20 г с соблюдением требований Директивы Европейского парламента и Совета Европы № 2010/63/EU от 22.09.2010 о защите животных, использующихся для научных целей.

Субтотальную ишемию головного мозга моделировали в условиях внутривенного тио-пенталового наркоза (40–50 мг/кг) путем одномоментной перевязки обеих общих сонных артерий (ОСА). Забор материала осуществляли спустя 1 ч после декапитации.

Контрольную группу составили ложноопе-рированные крысы аналогичных пола и веса.

После извлечения головного мозга осуществляли забор фрагмента теменной коры и гиппокампа с его последующим замораживанием в жидком азоте.

Подготовка пробы для исследования включала гомогенизацию в 10-кратном объеме 0,2M хлорной кислоты, центрифугирование в течение 15 мин при 13 000 g при 4 °С с последующим отбором супернатанта. Анализ аминокислот проводили методом обращенно-фазной хроматографии с предколоночной де-риватизацией о-фталевым альдегидом и 3-меркаптопропионовой кислотой в Na-боратном буфере на хроматографе Agilent 1100.

Для предотвращения систематической ошибки измерений образцы головного мозга от сравниваемых контрольной и опытных групп животных изучали в одинаковых условиях.

В результате исследований получены количественные непрерывные данные. Так как в эксперименте использованы малые выборки, которые имели ненормальное распределение, анализ проводили методами непараметрической статистики с помощью лицензионной компьютерной программы Statistica 10.0 для Windows (StatSoft, Inc., США). Данные представлены в виде Me (LQ; UQ), где Me - медиана, LQ и UQ - значения соответственно нижнего и верхнего квартилей. Различия между группами считали достоверными при р<0,05

(непараметрический тест Геймса - Хоувелла) Н^-6] -

Результаты и обсуждение. Ранее проведенными морфологическими исследованиями у крыс в динамике субтотальной церебральной ишемии выявлено уменьшение размеров перикарионов нейронов, усугубление их вытянутости, уменьшение количества нормохромных и гиперхромных нейронов и увеличение доли гиперхромных сморщенных нейронов и клеток с перицеллюлярным отеком [7]. На ультраструктурном уровне при СИГМ происходило набухание митохондрий с уменьшением количества и длины их крист, отмечались вакуолизация гранулярной эндоплазматической сети и преобладание свободных рибосом над связанными. Данные морфологические изменения являлись следствием выраженных нарушений энергетического обмена, особенно при использовании в качестве субстрата сукцината в исследованиях in vitro, указывая на наиболее тяжелое повреждение сук-цинатдегидрогеназного комплекса цепи переноса электронов и сопровождаясь уменьшением содержания АТФ-синтазы - фермента, осуществляющего реакцию образования АТФ из АДФ [8-10]. Нарушения прооксидантно-антиоксидантного баланса у крыс с СИГМ: уменьшение общих SH-групп белков и глутатиона, концентрации восстановленного глутатиона и увеличение содержания продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, -отражали высокую активность окислительного стресса [11]. При моделировании частичной ишемии головного мозга путем односторонней перевязки ОСА спустя 1 ч выраженные морфологические изменения на микроскопическом и ультраструктурном уровне отсутствовали. Также не наблюдалось выраженных изменений показателей дыхания митохондриальной фракции (отмечалось лишь незначительное снижение содержания АТФ-син-тазы), что отражает относительную сохранность ферментативных комплексов цепи переноса электронов при данной модели ишемии, и изменений показателей прооксидантно-ан-тиоксидантного баланса гомогенатов головного мозга [12].

Изменения пула аминокислот у крыс с СИГМ носили следующий характер.

По сравнению с показателями группы контроля у крыс с СИГМ при 1-часовой продолжительности ишемического периода в теменной доле происходило уменьшение содержания серосодержащих аминокислот: метионина на 12 % (р<0,05) и цистеата на 28 % (р<0,05), что, по-видимому, являлось результатом активации окислительного стресса. В свою очередь снижение уровня цистеата препятствует синтезу таурина – аминокислоты с медиаторными и антиоксидантными свойствами, однако уровень последнего не уменьшался, возможно, из-за его продолжительного периода полужизни в мозге.

Падение уровня цистеата в теменной доле при СИГМ не приводило к значимым сдвигам уровней гипотаурина и таурина, что наряду со снижением уровня метионина может являться отражением снижения потока серосодержащих аминокислот по цистеин-диоксигеназному пути.

Выявленные изменения концентрации серосодержащих аминокислот (уменьшение уровней цистеата и метионина) при СИГМ являются отражением высокой активности окси-дативных процессов (табл. 1) [13, 14].

Таблица 1

Table 1

Показатели пула аминокислот больших полушарий головного мозга крыс с одночасовой СИГМ, Ме (LQ; UQ)

Amino acid pool of cerebral hemispheres in rats with 1-hour subtotal cerebral ischemia (SCI), Me (LQ/UQ)

Теменная доля Parietal lobe			Гиппокамп Hippocampus
Аминокислоты Amino acids	Группы животных Groups		Группы животных Groups
	Контроль Control	СИГМ 1-hour SCI	Контроль Control	СИГМ 1-hour SCI
Эндогенный антагонист NMDA-рецепторов Endogenous NMDA receptor antagonist
α-аминоадипинат α-aminoadipate	21,5 (20,2; 24)	14,6 (11,2; 19,8)*	13 (11,5; 14,1)	5,08 (4,63; 6,51)*
Серосодержащие Sulfur-containing amino acids
Цистеат Cysteate	1,66 (0,767; 2,16)	1,2 (0,657; 1,59)*	1,03 (0,278; 1,69)	2,19 (1,73; 2,72)
Метионин Methionine	16,7 (15,6; 20,3)	14,8 (13,7; 15,4)*	19,3 (17,9; 23,4)	15,9 (15; 16,5)
Гликогенные Glucogenic amino acid
Метионин Methionine	16,7 (15,6; 20,3)	14,8 (13,7; 15,4)*	19,3 (17,9; 23,4)	15,9 (15; 16,5)
Аргинин Arginine	32,1 (30,5; 33,5)	44,7 (36; 51,4)*	27,8 (21,2; 32,4)	43,4 (32,1; 48,6)
Незаменимые Key amino acids
Метионин Methionine	16,7 (15,6; 20,3)	14,8 (13,7; 15,4)*	19,3 (17,9; 23,4)	15,9 (15; 16,5)

Примечание. * – р<0,05 по сравнению с группой контроля.

Note. * – the differences are significant compared with the control group (p<0.05).

Наряду с этим у крыс с СИГМ отмечалось увеличение уровня субстрата NO-синтазы L-аргинина в теменной доле на 28 % (р<0,05), а в гиппокампе – на 35 % (р>0,05). Рост уровня L-аргинина при СИГМ может быть связан с низкой активностью реакций его утилизации из-за дефицита кислорода, среди которых существенную роль играет образование монооксида азота (NO).

При одночасовой субтотальной церебральной ишемии наблюдалась тенденция к увеличению содержания тормозного нейромедиатора глицина в обоих изучаемых отделах, в то время как уровень аминокислот со свойствами возбуждающих нейромедиаторов (аспартата и глутамата), напротив, имел тенденцию к снижению.

При СИГМ в теменной доле отмечалась тенденция к снижению уровня одной из ароматических аминокислот – триптофана (источник серотонина), тогда как изменения содержания остальных ароматических аминокислот (тирозин, фенилаланин) как в теменной доле, так и в гиппокампе не наблюдалось (р>0,05). Это может являться результатом повышенного синтеза серотонина либо снижения транспорта триптофана в головной мозг. В связи с этим можно предполагать нарушения образования катехоламинов при СИГМ.

В группе аминокислот с разветвленной углеводородной цепью (АРУЦ) имелась тенденция к снижению валина на 21 % в теменной доле (р>0,05) и на 30 % в гиппокампе (р>0,05). Отсутствие выраженного снижения концентрации аминокислот группы АРУЦ при СИГМ согласуется со значительным снижением энергетических процессов [15–17].

Как результат отсутствия изменений уровней АРУЦ и ароматических аминокислот коэффициент отношения суммы уровней АРУЦ к сумме уровней ароматических аминокислот при СИГМ в теменной доле не изменялся (р>0,05), в отличие от гиппокампа, где отмечалась тенденция к его снижению от 1,6 до 1,2 (р>0,05).

В группе незаменимых аминокислот имелась тенденция к снижению валина – на 21 % в теменной доле (р>0,05) и на 30 % в гиппокампе (р>0,05), лейцина – на 17 % в гиппокампе (р>0,05), метионина – на 11 % в теменной доле (р>0,05) и на 18 % в гиппокампе (р>0,05), лизина – на 30 % в теменной доле (р>0,05) и на 41 % в гиппокампе (р>0,05), триптофана – на 22 % в теменной доле (р>0,05) и на 24 % в гиппокампе (р>0,05).

При этом показатель соотношения заменимых и незаменимых аминокислот при СИГМ возрос от 10,0 до 13,1 (р>0,05) в теменной доле и от 8,4 до 11,9 (р>0,05) в гиппокампе, что может являться следствием нарушения утилизации заменимых аминокислот в реакциях синтеза белка наряду с повышенной утилизацией незаменимых аминокислот.

Заключение. Исследование показало, что для одночасовой CИГМ характерны следующие изменения пула аминокислот: уменьшение концентрации серосодержащих аминокислот (метионина и цистеата) как отражение высокой активности окислительного стресса при СИГМ; повышение содержания L-аргинина, тенденция к увеличению уровня тормозного нейромедиатора глицина, снижение концентрации аспартата и глутамата – аминокислот со свойствами возбуждающих нейромедиаторов, а также триптофана, валина и лейцина. При этом не наблюдалось роста уровня глутамата и снижения уровней АРУЦ.

Изменения в теменной доле и гиппокампе при СИГМ носили аналогичный характер, за исключением отсутствия падения уровней ци-стеата и триптофана в гиппокампе, что является отражением нарушения метаболического пути образования серотонина из триптофана в гиппокампе и более высокой чувствительности теменной доли к дефициту кислорода по сравнению с гиппокампом.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов

Концепция и дизайн исследования: Максимович Н.Е., Бонь Е.И.

Литературный поиск, участие в исследовании, обработка материала: Бонь Е.И., Дорошенко Е.М., Смирнов В.Ю., Разводовский Ю.Е.

Статистическая обработка данных: Смирнов В.Ю.

Анализ и интерпретация данных: Максимович Н.Е., Бонь Е.И., Дорошенко Е.М.

Написание и редактирование текста: Бонь Е.И., Максимович Н.Е., Носович М.А., Храповицкая К.А.