Характеристика нарушений прооксидантно-оксидантного баланса у крыс с ишемией головного мозга

Введение. Острые нарушения мозгового кровообращения – одна из наиболее актуальных проблем современной медицины. Частота инсультов колеблется в различных регионах мира от 1 до 4 случаев на 1000 населения в год, значительно увеличиваясь с возрастом. Цереброваскулярные заболевания ишемического генеза имеют тенденцию к росту, омоложению, сопряжены с тяжелым клиническим течением, высокими показателями инвалидности и смертности. Проблема нарушения мозгового кровообращения требует концентрации усилий специалистов разных профилей [2].

При ишемии головного мозга (ИГМ) в его структурах развивается цепь патогенетических нарушений, среди которых одним из ведущих является энергодефицит, что приводит к развитию клеточной патологии из-за нарушений гомеостаза, активности ферментов, целостности мембран. В условиях ИГМ избирательно нарушаются механизмы синаптической передачи, что способствует нарушению ауторегуляции местного кровотока, развитию вазоспазма, усилению агрегации тромбоцитов и развитию внутрисосудистого стаза, углубляя гипоксию и усиливая энергодефицит.

Нарушается работа ферментов, в т.ч. натрийкалиевой АТФазы, что приводит к дисбалансу ионов и отеку головного мозга [1–3].

Образование активных форм кислорода (АФК) имеет большое значение в жизнедеятельности клеток всего организма, в т.ч. головного мозга. В небольших количествах кислородные радикалы играют роль мессенджера, отвечая за нейрональную активность, регулируют мозговой кровоток, апоптоз и другие процессы функционирования головного мозга [4].

Однако избыток активных форм кислорода может приводить к повреждению мембран, накоплению продуктов окисления липидов, белков и нуклеиновых кислот (альдегидов, кетонов), дефициту восстановленных пи-ридиннуклеотидов и фосфолипидов митохондриальных мембран, а затем – к электролитному дисбалансу, набуханию митохондрий, разобщению процессов окисления и фосфорилирования и гибели нейронов при ишемии. Повреждение АФК незащищенной гистонами митохондриальной ДНК приводит к ингибированию синтеза белков – переносчиков электронов [5, 6].

Цель исследования. Изучение изменения прооксидантно-антиоксидантного баланса у крыс с ишемическим повреждением головного мозга различной степени тяжести с субтотальной и тотальной ИГМ.

Материалы и методы. Эксперименты выполнены на 30 самцах беспородных белых крыс массой 260±20 г с соблюдением требований Директивы Европейского парламента и Совета Европейского союза № 2010/63/EU от 22.09.2010 о защите животных, использующихся для научных целей.

Моделирование ИГМ осуществляли в условиях внутривенного тиопенталового наркоза (40–50 мг/кг) [7].

Тотальную ишемию головного мозга (ТИГМ) моделировали путем декапитации животных, субтотальную ишемию головного мозга (СИГМ) – путем одномоментной перевязки обеих общих сонных артерий (ОСА). Забор головного мозга осуществляли спустя 1 и 24 ч после декапитации. В предыдущих морфологических исследованиях головного мозга крыс при церебральной ИГМ были установ- лены наиболее значимые различия именно в эти временные сроки [2].

Контрольную группу составили ложно оперированные крысы, аналогичные по полу и весу.

Для определения прооксидантно-антиок-сидантного состояния головного мозга в его гомогенатах (20 % разведение в PBS (рН 7,2)) определяли активность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) по содержанию продуктов, реагирующих с тиобарбиту-ровой кислотой (ТБКРС), концентрации восстановленного глутатиона (GSH), общих тиоловых групп (SH) и активности глутатионпероксидазы (ГП).

ТБКРС возникают в организме при деградации полиненасыщенных жиров активными формами кислорода, служат маркерами активности ПОЛ и окислительного стресса.

Для определения содержания ТБКРС к исследуемому образцу 10 % гомогената головного мозга (0,3 мл) последовательно добавляли 2,4 мл 0,07 N раствора серной кислоты и 0,3 мл 10 % раствора фосфорновольфрамовой кислоты. К дважды отмытому, растворенному в 3,0 мл бидистиллированной воды осадку добавляли 1 мл 0,85 % водного раствора тио-барбитуровой кислоты (ТБК), растворенной в 25 мл уксусной кислоты с добавлением 5 мл Н 2 O. Цветная реакция протекала в герметично закрытых пробирках при температуре 96 °С в течение 60 мин. После их охлаждения в воде в течение 5 мин определяли оптическую плотность отцентрифугированного супернатанта на спектрофотометре PV 1251C («Солар», Беларусь) при длинах волн 532 и 580 нм.

Концентрацию ТБКРС рассчитывали по формуле ТБКРС=(Е 532 -Е 58о )/О,156 х К, где Е -экстинкция при соответствующих длинах волн, К – коэффициент разведения образца головного мозга (147,7).

Расчет концентрации ТБКРС осуществляли с использованием коэффициента поглощения для образующегося продукта ɛ 532 =1,56×10⁵ М^-1·см^-1 и выражали в наномоль на грамм белка (грамм ткани).

При измерении концентрации GSH к 1 мл 15 % гомогената головного мозга добавляли 0,2 мл 25 % трихлоруксусной кислоты, встряхивали и центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин. К полученному супернатанту (0,2 мл) добавляли 1,2 мл 0,5 М фосфатного буфера (рН 7,8) и 50 мкл реактива Эл-лмана. Концентрацию GSH рассчитывали с учетом коэффициента молярной экстинкции (ε412=13600 М-1·см-1) путем определения оптической плотности исследуемых образцов при λ=412 нм на спектрофотометре PV 1251C.

Определение концентрации TSH осуществляли следующим образом. Добавляли 30 мкл 3 % раствора натриевой соли додецилсульфата к 60 мкл гомогената головного мозга, отбирали 25 мкл полученной смеси и соединяли с 1,2 мл 0,5 М фосфатного буфера (рН 7,8) и 50 мкл реактива Эллмана, через 10 мин инкубации при комнатной температуре определяли оптическую плотность на спектрофотометре PV 1251C при λ=412 нм с учетом коэффициента молярной экстинкции. Коэффициент молярной экстинкции при определении содержания TSH составляет 13600 М-1 см-1.

Для измерения активности глутатионпероксидазы к 0,8 мл буфера Трис-HCl (рН 7,25), содержащего 0,012 М азида натрия, 0,001 М этилендиаминтетрауксусной кислоты и 4,8 мМ GSH, добавляли 0,1 мл гомогената головного мозга и 20 мМ трет-бутилгидропероксида, инкубировали 10 мин при температуре 37 °С.

Реакцию останавливали путем добавления 0,02 мл раствора 25 % трихлоруксусной кислоты; для получения нулевой точки аналогичную процедуру проводили сразу после введения трет-бутилгидропероксида. Пробы центрифугировали (5000 об/мин, 5 мин), к 1 мл фосфатного буфера (рН 7,8) добавляли 30 мкл полученного супернатанта и 30 мкл реактива Эллмана, измеряли оптическую плотность при λ=412 нм и λ=700 нм.

В результате исследований получены количественные непрерывные данные. Так как в эксперименте использованы малые выборки, которые имели ненормальное распределение, анализ проводили методами непараметрической статистики с помощью лицензионной компьютерной программы Statistica 10.0 для Windows (StatSoft, Inc., США). Данные представлены в виде Me (LQ; UQ), где Me – медиана, LQ – значение нижнего квартиля; UQ – значение верхнего квартиля. Различия между группами считали достоверными при р<0,05 (тест Крускелла – Уоллиса с поправкой Бон-ферони) [8–10].

Базовый прооксидантно-антиоксидант-ный статус коры головного мозга характеризовался параметрами, установленными в контрольной группе (табл. 1).

Таблица 1

Table 1

Показатели прооксидантно-антиоксидантного баланса головного мозга крыс с тотальной церебральной ишемией, Ме (LQ; UQ)

Indicators of pro-oxidant-antioxidant balance in the brain of rats with total cerebral ischemia, Me (LQ; UQ)

Группа Group	SH, ммоль/л SH, mmol/L	GSH, ммоль/л GSH, mmol/L	ГП, ммоль/мин×л GP, mmol/min×L	ТБКРС, ммоль/л PRTBA, mmol/L
Контроль Control	5,5 (5,4; 5,6)	4,6 (4,4; 4,8)	70 (70; 72)	19,9 (13,8; 22,7)
ТИГМ 1 ч 1-hour TCI	1,0 (1,0; 1,1)*	1,1 (1,0; 1,2)*	0 (0; 0)*	12,3 (11,7; 14,1)
ТИГМ 1 сут 24-hour TCI	0,7 (0,6; 0,7)* +	0,5 (0,2; 0,7)* +	0 (0; 0)*	5,9 (2,1; 10,9)*

Примечание. * – различия достоверны (р<0,05) по сравнению с группой контроля, + – различия достоверны (р<0,05) по сравнению с 1-часовой ТИГМ.

Note. * – the differences are significant compared with the control group (p<0.05), + – the differences are significant compared with 1-hour TCI (р<0,05); GSH – reduced glutathione, GP – glutathione peroxidase, PRTBA – products that react with thiobarbituric acid, TCI – total cerebral ischemia.

По сравнению с уровнем группы контроля в группе 1-часовой ТИГМ отмечали статистически значимое уменьшение показателей неферментативных механизмов защиты: содержания общих SH-групп белков и глутатиона – на 82 (79; 87) % (р<0,05), концентрации GSH – на 75 (71; 81) % (р<0,05), а также нулевую активность глутатионпероксидазы, что указывает на несостоятельность антиоксидантных механизмов. Содержание ТБКРС не изменялось (р>0,05), так как для его наработки необходим определенный уровень оксигенации.

При 1-суточной ТИГМ, по сравнению с группой контроля, произошло уменьшение содержания общих SH-групп белков и глутатиона на 88 (81; 91) % (р<0,05), концентрации GSH на 87 (79; 92) % (р<0,05). Активность глутатионпероксидазы была нулевой, как и в группе 1-часовой ТИГМ, что, возможно, связано с повреждением и инактивацией фермента активными формами кислорода. Содержание ТБРКС уменьшилось на 70 (65; 75) % (р>0,05).

В условиях 1-суточной ТИГМ отмечено более значительное, чем при 1-часовой ТИГМ, уменьшение содержания общих SH-групп белков и глутатиона – на 34 (29; 38) % (р<0,05), концентрации GSH – на 55 (48; 61) % (р<0,05) и ТБКРС – на 53 (47; 59) % (р<0,05).

Таким образом, по мере удлинения ишемического периода у крыс с ТИГМ происходит усугубление нарушений показателей проок-сидантно-антиоксидантного баланса – уменьшение содержания общих SH-групп белков и глутатиона, концентрации GSH и активности ГП. Снижение содержания ТБКРС связано с отсутствием притока кислорода при тотальной ишемии головного мозга [11, 12].

Низкий уровень неферментативных и ферментативных механизмов защиты указывает на общее снижение функциональной активности нейронов и невозможность запуска компенсаторных механизмов при ТИГМ [13–15].

При изучении показателей прооксидант-но-антиоксидантного баланса головного мозга в группе 1-часовой СИГМ по сравнению с группой контроля отмечали уменьшение показателей неферментативных механизмов защиты: содержания общих SH-групп белков и глутатиона – на 56 (49; 61) % (р<0,05), концентрации GSH – на 57 (51; 63) % (р<0,05), повышение активности ГП – на 12 (9; 18) % (р<0,05), увеличение содержания ТБКРС – на 32 (27; 38) % (р<0,05)), что отражало высокую напряженность ферментативных механизмов и являлось маркером окислительного стресса (табл. 2). Выбранные параметры позволяют оценить степень напряженности антиоксидантных систем головного мозга, а также активность окислительного стресса.

Таблица 2

Table 2

Показатели прооксидантно-антиоксидантного баланса головного мозга крыс с субтотальной церебральной ишемией, Ме (LQ; UQ)

Indicators of pro-oxidant-antioxidant balance in the brain of rats with subtotal cerebral ischemia, Me (LQ; UQ)

Группа Group	SH, ммоль/л SH, mmol/L	GSH, ммоль/л GSH, mmol/L	ГП, ммоль/мин×л GP, mmol/min×L	ТБКРС, ммоль/л PRTBA, mmol/L
Контроль Control	5,5 (5,4; 5,6)	4,6 (4,4; 4,8)	70 (70; 72)	19,9 (13,8; 22,7)
СИГМ 1 ч 1-hour SCI	2,4 (2,3; 2,4)*	1,94 (1,7; 2,0)*	80 (80; 82)*	29,4 (28,7; 30,5)*
СИГМ 1 сут 24-hour SCI	1,0 (0,9; 1,1)* +	1,4 (1,3; 1,5)* +	18 (12; 18)* +	35,1 (34,3; 35,8)* +

Примечание. * – различия достоверны (р<0,05) по сравнению с группой контроля, + – различия достоверны (р<0,05) по сравнению с 1-часовой СИГМ.

Note. * – the differences are significant compared with the control group (p<0.05), + – the differences are significant compared with 1-hour SCI (р<0,05); GSH – reduced glutathione, GP – glutathione peroxidase, PRTBA – products that react with thiobarbituric acid, SCI – subtotal cerebral ischemia.

При 1-суточной СИГМ по сравнению с группой контроля произошло уменьшение содержания общих SH-групп белков и глутатиона на 82 (77; 90) % (р<0,05), концентрации GSH на 70 (68; 79) % (р<0,05). Активность глутатионпероксидазы была ниже на 74 (67; 81) % (р<0,05), а содержание ТБКРС - выше на 43 (37; 51) % (р<0,05). Данные изменения свидетельствуют о выраженных оксидативных процессах, причем механизмы антиоксидантной защиты (снижение содержания SH, GSH, активности ГП) выражены слабо.

В условиях 1-суточной СИГМ отмечено более значительное, чем при 1-часовой СИГМ, уменьшение содержания общих SH-групп белков и глутатиона - на 58 (51;64) % (р<0,05), концентрации GSH - на 29 (19; 35) % (р<0,05). Повысилось содержание ТБКРС на 17 (11; 23) % (р<0,05), что указывает на большую активность окислительного стресса при 1-суточной СИГМ.

Изменения активности ГП были разнонаправленными: при 1 -часовой СИГМ она повышалась на 12 (9; 18) % (р<0,05) по отношению к уровню контроля, а при 1-суточной - снижалась на 74 (67; 81) % (р<0,05).

По сравнению с показателями 1-часовой ТИГМ при 1-часовой СИГМ содержание общих SH-групп белков и глутатиона было больше на 60 (54; 65) % (р<0,05), концентрация GSH выше на 42 (39; 56) % (р<0,05). Повысилось содержание ТБКРС на 59 (51; 63) % (р<0,05). По сравнению с показателями 1-суточной ТИГМ при 1-суточной СИГМ содержание общих SH-групп белков и глутатиона было больше на 36 (29;45) % (р<0,05), концентрация GSH выше на 63 (59; 75) % (р<0,05). Возросло содержание ТБКРС на 83 (78; 91) % (р<0,05). Активность ГП при ТИГМ была равна нулю.

Данные изменения свидетельствуют о меньшей выраженности окислительного стресса при СИГМ, чем при ТИГМ.

Таким образом, у крыс с СИГМ при продолжительности ишемического периода 1 сут отмечались более выраженные нарушения про-оксидантно-антиоксидантного баланса (уменьшение содержания общих SH-групп белков и глутатиона, концентрации GSH и увеличение содержания ТБКРС), чем при 1-часовой СИГМ. Изменения активности глутатионпероксидазы были разнонаправленными: при 1-часовой СИГМ ее активность повышалась, а при 1-суточной - снижалась, что отражает усугубление дефицита антиоксидантных механизмов при данном способе моделирования церебральной ишемии.

Заключение. Полученные результаты соответствуют данным литературы, согласно которым окислительный стресс развивается вследствие дисбаланса между прооксидантами и антиоксидантами и избыточной продукции активных форм кислорода, которые вовлечены в патогенез ишемического повреждения головного мозга [16-18]. Из-за накопления недоокисленных продуктов углеводного, липидного и белкового обменов происходит избыточное образование ионов Н+, возникает метаболический ацидоз. Ацидоз и дефицит макроэргов угнетают метаболические процессы и нарушают ионный транспорт, что приводит к пассивному оттоку ионов К+ из клеток и притоку в нейроны ионов Na+, Са++ и водорода. Вследствие накопления свободных ионов Са++ запускается глутамат-кальциевый каскад, развивается отек клетки (глутаматная эксайтоксичность) с изменением физико-химических свойств мембран нейронов и сосудистого эндотелия [8, 9, 11, 19-22].

Таким образом, было установлено, что наиболее выраженные нарушения проокси-дантно-антиоксидантного баланса наблюдаются при тотальной ишемии головного мозга продолжительностью 1 сут. Схожие, однако менее выраженные нарушения отмечаются при суточной субтотальной ишемии.