Характеристика приживления и гистоструктуры васкуляризованных кожно-фасциальных лоскутов в условиях применения микроинъекций лиофилизата мозговой ткани

Частичный некроз кожных лоскутов относится к числу существенных проблем реконструктивной хирургии [1]. В случаях применения лоскутов с осевым кровоснабжением основная причина этого осложнения – дефицит кислорода и нутриентов в удалённых от сосудистой ножки участках [2]. Отсутствие эффективной терапии приводит к ухудшению функциональных и эстетических результатов и необходимости повторных опера- ций. Наиболее привлекательной стратегией решения этой проблемы является терапевтический ангиогенез, который может быть индуцирован применением молекулярных регуляторов – факторов роста, контролирующих деление, рост, дифференцировку и метаболизм клеток; наиболее эффективным среди них считается фактор роста сосудистого эндотелия VEGF [3]. В клинике для лечения критической ишемии конечностей применяется

генный препарат VEGF [4], имеющий высокую коммерческую стоимость. Более доступный пептидергический препарат церебролизин (лиофилизат головного мозга свиней) реагирует с антителами к нескольким нейротрофическим факторам, а также инсулиноподобному фактору (IGF) первого и второго типов [5]. Церебролизин снижает вызванный оксидативным стрессом апоптоз в различных тканях [6], IGF-1 усиливает ангиогенез и уменьшает реперфузионные повреждения [7]. Логично предположить, что применение такого препарата позво- лит оптимизировать приживление васкуляризованных кожно-фасциальных лоскутов, в том числе в тех случаях, когда их площадь превышает территорию кровоснабжающей артерии.

Цель исследования – выявление возможного влияния субдермальных инъекций церебролизина на показатели приживления и гистоморфометрические характеристики биологической модели продлённого кожно-фасциального лоскута с осевым кровоснабжением.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проведены на 29 крысах-самцах линии Вистар (вес от 380 до 560 г, возраст 8–12 месяцев) с соблюдением требований Приказа МЗ РФ № 267 от 19.06.2003. Под общим обезболиванием в условиях операционной по шаблону 3 × 6 см проведено формирование и репозиция кожно-фасциального лоскута с осевым типом кровоснабжения на основе a. epigastrica inferior superficialis (SIEA). Скальпелем проведены разрезы: медиальный – на 0,5 см латеральнее белой линии живота, краниальный – по нижнему краю рёберной дуги, каудальный – параллельно краниальному, отступая на 6 см, и латеральный – параллельно медиальному в 3-х см от него. Питающую ножку (SIEA, сопровождающие вены и нервы) выделяли с окружающими тканями. Краниальная часть лоскута относилась к ангиосому a. thoracica lateralis и после формирования лоскута не перфузировалась ею (рис. 1, а). Моделирование релевантной клиническим операциям по пересадке и транспозиции лоскутов полуторачасовой ишемии выполнено путём клипирования питающей артерии в течение 90 минут. Крысы были рандомически распределены на 5 групп: негативный контроль – без терапевтических воздействий на процесс приживления (n = 10), две опытные группы: Сer 1 – через час после операции выполнены 4 субдермальные микроинъекции по 0,1 мл цереброли-зина (рис. 1, б) в межангиосомной зоне лоскута (n = 5), Сer 2 – 6 микроинъекций, равномерно распределённых (рис. 1, в) по площади лоскута (n = 5), а также две груп- пы сравнения (Сomp 1 – n = 4 и Сomp 2 – n = 5) c аналогичными инъекциями физиологического раствора. Через 12 дней после операции крыс эвтаназировали. В масштабированных полноцветных цифровых изображениях кожной поверхности лоскутов методом компьютерной планиметрии определена степень их контракции (% от площади шаблона). Состояние лоскутов оценивали визуально и стереологически – по результатам расчета доли (%) дефектов эпидермиса в площади лоскута методом точко-счетной планиметрии.

Для гистологического исследования иссекали стандартные фрагменты лоскутов опытных и контрольной групп. Условная норма (позитивный контроль) – образцы контралатеральных участков кожи. Парафиновые срезы толщиной 5–7 мкм окрашивали по ван Гизону и гематок-силином-эозином, часть помещали на стёкла с адгезивным покрытием (поли-L-лизин), определяли экспрессию белков ki-67 (маркёра пролиферации) и vWF (маркёра эндотелиоцитов) по протоколу фирмы-производителя с использованием систем визуализации Novolink Polymer (Novocastra, Великобритания). Препараты изучали с помощью стереомикроскопа «AxioScope.A1» с цифровой камерой «AxioCam» (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Германия). Гистоморфометрия выполнена в компьютерной программе «ВидеоТесТ Мастер-Морфология, 4.0», статобработка – в программе Attestat 9.3.1 (разработчик – И.П. Гайдышев) с применением критериев Манна-Уитни и интервального критерия рандомизации.

Рис. 1. Схема эксперимента: а – клипирование артерии, питающей продлённый лоскут с осевым кровоснабжением, А – ангиосом-ная, М – межангиосомная части лоскута. Топография субдермальных микроинъекций: б – в группах Сer 1 и Comp 1, в – группах Сer 2 и Сomp 2

РЕЗУЛЬТАТЫ

Примеры исходов реплантации продлённого SIEA-лоскута крыс после полуторачасовой ишемии-реперфузии представлены на рисунке 2.

К 12 суткам после операции полное приживление лоскута и раневое заживление отмечено только у одного животного из 10 в контрольной группе и у трёх из 10 в опытных группах (табл. 1). Частотное распределение дефектов заживления и приживления в контрольной группе и группах сравнения с введением физиологического раствора было сопоставимым. В опытных группах некроз межангиосомной зоны не наблюдался ни у одного животного, что статистически значимо отличает их от групп без фармакологических воздействий (p < 0,001 по критерию Барнарда).

Рис. 2. Варианты исходов реплантации продлённого SIEA-лоскута крыс после полуторачасовой ишемии-реперфузии через 12 суток после операции: а – некроз межангиосомной зоны и краевой некроз; б – краевой некроз лоскута и неполное раневое заживление, в – неполное раневое заживление, г – полное приживление и раневое заживление с восстановлением шерстного покрова лоскута

Таблица 1

Исходы реплантации продлённого лоскута с осевым кровоснабжением через 12 суток после операции

Критерий/группа	Полное приживление и раневое заживление	Дефекты заживления и приживления
		Неполное раневое заживление	+ Краевой некроз	+ Некроз межангиосомной зоны
Control (n = 10)	1	3	5	1
Comp 1 + Comp 2 (n = 9)	0	3	5	2
Cer 1 + Cer 2 (n = 10)	3	2	5	0

Относительная площадь дефектов эпидермиса в контрольной группе составила 13,72 ± 9,17 %, в группах с физиологическим раствором – 11,33 ± 3,68 %, в Cer 1 – 2,15 ± 0,85 %, в Сer 2 – 0,23 ± 0,17 %; разница опытных групп между собой, а также от контроля и плацебо статистически значима (p < 0,05).

При исследовании гистологических препаратов установлено, что по сравнению с контролем в опытных группах существенно снижена полиморфноклеточная инфильтрация дермы и гиподермы. У животных группы Сer 1 аналогично контролю атрофированы panniculus carnosum и подкожная жировая клетчатка, в некоторых участках выражено также замещение жировой ткани созревающей грануляционной (рис. 3, а). Среди сохранившихся адипоцитов встречаются участки умеренной полиморфноклеточной инфильтрации, в которых повышено содержание тучных клеток (рис. 3, б). Проводниковая часть нервных стволиков в состоянии валлеровской дегенерации (рис. 3, в). Эпидермис на большем протяжении лоскута истончён за счёт уменьшения количества слоёв и вертикального диаметра шиповатых клеток (рис. 3, г). Группа Сer 2 отличается лучшей сохранностью panniculus carnosum, подкожной жировой клетчатки, волосяных фолликулов и сальных желёз (рис. 4, а). В подкожной жировой клетчатке ангиосомной зоны встречаются очаги ангиогенеза (рис. 4, б). Некоторые нервные стволики наряду с дегенерирующими волокнами содержат сохранные и регенерирующие осевые цилиндры (рис. 4, в). Слои эпидермиса хорошо выражены (рис. 4, г).

При гистоморфометрическом исследовании (табл. 2) установлено, что в контрольной группе и в Cer 1 толщина эпидермиса уменьшена на 27,3 и 36,4 % (p < 0,05) соответственно по сравнению с контралатеральными участками кожи, а в группе Сer 2 параметр сопоставим с ними. Толщина дермы значимо увеличена только в группе Сer 2: в межангиосомной зоне на 13,4 %, а в ангиосомной – на 19 %. Все лоскуты отличаются от контралатеральных участков кожи истончением гиподермы: в контроле – на 42,7 %, в группе Сer 1 на 47,2 % в межангиосомной и на 35,6 % в анги-осомной зонах, но в группе Сer 2 только на 10,5 % и на 17,9 % соответственно. Количество сосочков дермы в лоскутах уменьшено по сравнению с контралатеральной кожей на 54,8 % в контроле, в Сer 1 показатель не отличался от контралатеральной кожи в межангиосом-ной зоне, но был уменьшен на 25,1 % в ангиосомной зоне, в Сer 2 он был сопоставим с контралатеральной кожей. Клеточность дермы лоскутов по сравнению с контралатеральными участками кожи была увеличена на 64,2 % в контрольной группе и сопоставима с ними в опытных группах. Численная плотность придатков кожи в контрольной группе уменьшена на 124,7 %, в группе Cer 1 – на 126,2 % в межангиосомной зоне и на 103,3 % в ангиосомной, в группе Cer 2 – на 33,4 % и 57,8 % соответственно.

Рис. 3. Фрагменты парафиновых срезов прижившихся лоскутов в группе Сer 1. Увеличение 180× (а) и 500× (б, в, г). Окраска гематоксилином и эозином

- у £ф# •

Рис. 4. Фрагменты парафиновых срезов прижившихся лоскутов в группе Сer 2. Увеличение 180× (а) и 500× (б, в, г). Окраска гематоксилином и эозином

Капилляризация дермы и гиподермы в лоскутах контрольной группы сопоставима с кожей контралатеральных участков, в группе Сеr 1 капилляризация дермы увеличена на 26,1 %, а капилляризация гиподермы уменьшена на 26,1 % в межангиосомной зоне и на 41,4 % в ангиосомной, в группе Cer 2 капилля-ризация дермы увеличена на 112 %, капилляризация гиподермы межангиосомной зоны сопоставима с контралатеральными участками, а в ангиосомной зоне повышена на 11,7 %.

Таблица 2

Гистоморфометрические характеристики кожи лоскутов

Группа / параметр	Контроль	Cer 1		Cer 2		Условная норма
		Зона М	Зона А	Зона М	Зона А
Толщина (мкм)
эпидермиса	16,12 ± 0,61	13,99 ± 0,86	13,86 ± 0,78	18,79 ± 1,55	20,21 ± 1,16	22,14 ± 1,90
дермы	543,43 ± 7,38	508,20 ± 73,23	604,72 ± 57,11	593,58 ± 59,25	627,96 ± 47,25	527,08 ± 19,22
гиподермы	200,69 ± 3,40	185,17 ± 31,03	226,17 ± 44,51	314,33 ± 22,85	287,74 ± 23,66	351,03 ± 42,82
Количество сосочков дермы
(в 1 мм длины среза)	5,89 ± 0,37	12,13 ± 0,81	9,60 ± 1,34	11,28 ± 0,77	12,27 ± 0,48	12,82 ± 0,40
Численная плотность (мм2)
клеток дермы	2112,25 ± 354,05	1317,14 ± 7,88	1134,95 ± 46,35	1084,13 ± 76,61	1228,61 ± 69,04	1285,57 ± 110,93
придатков кожи	16,69 ± 1,95	16,58 ± 1,01	18,45 ± 1,55	28,12 ± 6,08	23,77 ± 3,64	37,5 ± 5,70
капилляров дермы	34,87 ± 5,13	41,03 ± 7,07	41,03 ± 3,63	69,74 ± 9,54	68,72 ± 14,29	32,53 ± 2,69
капилляров гиподермы	111,33 ± 9,18	84,10 ± 6,61	66,67 ± 5,38	107,69 ± 17,39	127,18 ± 13,70	113,85 ± 9,24

ДИСКУССИЯ

Результаты выполненного исследования свидетельствуют, что обе изученные схемы применения цере-бролизина по сравнению с негативным контролем и плацебо обусловили достоверное уменьшение относительной площади дефектов эпидермиса, связанных с частичным некрозом лоскута либо замедленным раневым заживлением. Антинекротический и регенеративный эффекты были связаны, главным образом, с протективным эффектом в отношении капилляров папиллярного сплетения, о чём свидетельствуют значительно большие (в 1,6–2,1 раза) численные плотности сосочков дермы, чем в группе без фармакологических воздействий.

Известно, что ангиогенные факторы могут обладать как прямым действием на эндотелиальные клетки, так и непрямым – стимулируя воспаление, которое, в свою очередь, усиливает ангиогенез [8]. Выраженное уменьшение полиморфноклеточной инфильтрации дермы и гиподермы в опытных группах приводит к выводу о том, что стимулированный субдермальными микроинъекциями церебролизина ангиогенез в дерме протекал на фоне торможения воспалительных реакций. Четыре микроинъекции церебролизина в не-кровоснабжаемой (межангиосомной) зоне лоскута обусловили гиповаскуляризацию гиподермы и, как следствие, истончение эпидермиса и дермы. Вторая схема, предусматривающая увеличение дозировки препарата с равномерным распределением шести микроинъекций по площади лоскута, обеспечила протективные и ускоряющие раневое заживление эффекты не только в отношении эпидермиса, но и подкожной жировой клетчатки, а также придатков кожи, что, по-видимому, опосредовано более выраженным ангиогенным и ней-рорегенеративным эффектом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для оптимизации приживления кожно-фасциаль- инъекций церебролизина, равномерно распределённых ных лоскутов с осевым кровоснабжением в случаях, по всей площади лоскута, включая его ангиосомную и когда их площадь превышает территорию кровоснаб- межангиосомную зоны.

жающей артерии, целесообразно применение микро-