Characteristics of the vaginal microbiome of patients with habitual miscarriage

Автор: Zebzeeva S.Yu., Stolnikova I.I., Chervinets V.M., Chervinets Yu.V.

Журнал: Вестник Национального медико-хирургического центра им. Н.И. Пирогова @vestnik-pirogov-center

Статья в выпуске: 2 т.18, 2023 года.

Бесплатный доступ

Backgraund: The frequency of problem of habitual miscarriage is about 2-5%, it’s very important in modern obstetrics. Infectious factor plays a very important role in genesis of habitual miscarriage. The question about etiology of infection is widely discussed in literature. Aims: This article is devoted to the study of vaginal microbiome of healthy women and women with habitual miscarriage as well as to the study of the spectrum of gas signal molecules released by them, which play important role in maintaining a healthy body Materials and methods: The sample of the material from the vagina was taken with a sterile swab on a polystyrene stick with an area of 1 cm2 and within 2 hours was delivered to the bacteriological laboratory. To isolate facultatively anaerobic and aerobic bacteria, nutrient media were used: Endo agar for enterobacteria, mannitol-salt agar (M118) for staphylococci, micrococci, for detection of lecithinase activity - Baird-Parker agar, etc. Cultivation was carried out at a temperature of 37 °C for 24-48 hours. The number of colonies was expressed in lg CFU / ml. the Production of gas signaling molecules (H2, O2, N2, CO, CH4, CO2, NO, H2S) was determined using the gas chromatography method on the Chromatek-crystal 5000.2 instrument. The amount of gases was measured in ppm. Results: The spectrum of the main vaginal microbiome of healthy women (19-23 years) is represented by bacteria of the normal microbiota of the genera Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus, Bacillus, Staphylococcus (epidermal strains). Opportunistic fungi of the genus Candida, Bacter-oides, Staphylococcus aureus, Streptococci, Micrococci, Weylonella, Gardnerella and Actinomycetes were isolated in rare cases. Different strains of lactobacilli were isolated in 91% of healthy women. Lactobacilli produced the most of all the next gas molecules: CO2, CO and NO. Dysbiotic disorders of the vaginal microbiome in non-pregnant women with a history of habitual miscarriage have been established. Also a decrease in the production of gas signaling molecules: CO and NO, and an increase in the production of H2S and CH4 was in this group of patients. Conclusions: These results indicate the inhibition of the immune response in this category of patients. The correction of dysbiotic disorders is needed before pregnancy.

Еще

D-димеры

Короткий адрес: https://sciup.org/140301224

IDR: 140301224 | DOI: 10.25881/20728255_2023_18_2_74

Текст научной статьи Characteristics of the vaginal microbiome of patients with habitual miscarriage

Обоснование

Вагинальный микробиом женщины, который содержит примерно 10% женской микробиоты, играет исключительную роль в поддержании в физиологической норме мочеполового тракта, предупреждая развитие в нем патологических изменений.

Вагинальный микробиом, содержащий не менее 50 видов микроорганизмов, находится в тесной симбиотической связи со структурными компонентами влагалища и другими биотопами микробной экологической системы, а также с функциональной активностью всей мочеполовой системы, особенно ее иммунной и эндокринной деятельностью.

Эстрогенные гормоны способствуют насыщению эпителия гликогеном, который используют в качестве основного питательного субстрата микроорганизмы, способные к его метаболизму [1–3]. Это одна из причин доминирующего положения в составе вагинального микробиома здоровой женщины репродуктивного возраста штаммов лактобацилл, для которых гликоген является оптимальным субстратом для обеспечения жизнедеятельности.

Дополнительными факторами селективных преимуществ вагинальных лактобацилл по сравнению с другими микроорганизмами является высокая скорость размножения во влагалищной слизи, адгезия к поверхности эпителиоцитов с формированием биопленки, синтез перекиси водорода, лизоцима, бактериоцинов, стимуляция местного иммунитета [4]. Благодаря этим свойствам лактобациллы в процессе эволюции оказались наиболее приспособлены к колонизации влагалища и конкурентному вытеснению из него других микроорганизмов. Об этом свидетельствует высокая концентрация лактобацилл в вагинальном секрете (до 109 КОЕ/см3).

Помимо лактобацилл, в составе вагинального микробиома всегда присутствуют факультативные микроорганизмы. Их популяционный уровень в норме не превышает 3–4%, однако видовой состав достаточно разнообразен [1; 5]. Все эти микроорганизмы являются условно-патогенными, и при снижении активности и популяционного уровня нормальной микробиоты могут вызывать различные заболевания.

При нормальном состоянии микробиома они непродолжительно персистируют в вагинальном биотопе, не увеличивая уровень своих популяций выше 104 КОЕ/см3 и не вызывая патологических изменений.

Коммуникации между микроорганизмами реализуются посредством регуляторной системы, получившей название quorum sensing, в которой механизм авторегуляции развития микробных популяций осуществляется при достижении развивающейся культурой определенной плотности популяции [5]. Микроорганизмы в биопленке непрерывно обмениваются между собой сигнальными молекулами, активирующими или приостанавливающими развитие сообщества.

Цель

Целью данной работы являлся анализ состава и функциональной активности микробиома влагалища здоровых женщин и женщин с привычным невынашиванием беременности, а также выявление продукции простых сигнальных молекул у лактобацилл.

Методы

Дизайн исследования

Одномоментное обсервационное проспективное исследование.

Критерии соответствия

Критерии включения:

– небеременные женщины с привычным невынашиванием беременности на этапе прегравидарной подготовки

– небеременные женщины в возрасте от 18 до 40 лет без репродуктивных потерь.

Критерии исключения: наличие тяжелой соматической патологии, психических расстройств, инфекций, передаваемых половым путем, антифосфолипидного синдрома.

Условия проведения

Клиническая база кафедры акушерства и гинекологии ФГБОУ ВО Тверского ГМУ Минздрава РФ ГБУЗ «Областной родильный дом» отделение патологии беременности, гинекологическое отделение, а также база кафедры микробиологии и вирусологии с курсом иммунологии ФГБОУ ВО Тверского ГМУ Минздрава РФ.

Продолжительность исследования

Исследование проводилось с 2019 по 2020 гг.

Описание медицинского вмешательства

Забор материала из влагалища производили в первую фазу менструального цикла утром до мочеиспускания стерильным тампоном на полистироловой палочке с площади 1 см2 и в течение 2-х часов доставляли в бактериологическую лабораторию.

Основной исход исследования: Количество колоний выражали в lg КОЕ/мл. Идентификация осуществлялась по биохимической активности с применением API систем (bioMereux). В работе был использован программно-аппаратный комплекс Диаморф Цито (ДиаМорф, Россия).

Дополнительные исходы исследования : Количество выделенных газов измеряли в ppm (от англ. parts per million , — «частей на миллион»), млн ^- ¹ или мд. 1 mg/mL = 1000 ppm, 1 ppm = 0.001 mg/mL.

Анализ в подгруппах:

Обследуемый контингент мы разделили на группы: 1. Основная группа — небеременные женщины, страдающие привычным невынашиванием (ПНБ) в анамнезе на этапе прегравидарной подготовки

2. Группа контроля — здоровые небеременные женщины в возрасте 19–23 лет.

Методы регистрации исходов

Для выделения факультативно анаэробных и аэробных бактерий использовали следующие среды — Эндо агар для энтеробактерий, маннит-солевой агар (М118) для стафилококков, микрококков, для выявления лецитиназной активности — агар Бэрда-Паркера, М 304 — стрептококковый агар, МРС — лактоагар, Сабуро декстроза агар — для дрожжевых грибов, Колумбия кровяной агар — для энтерококков, бацилл, а также хромогенные среды фирмы «HiMedia». Для культивирования анаэробов использовали среды бифидоагар и кровяной Шедлер агар. Анаэробные условия создавались в анаэростатах при помощи газогенераторных пакетов BBL. Культивирование проводили при температуре 37 °С в течение 24–48 часов.

Продукцию газовых сигнальных молекул (H2, O2, N2, CO, CH4, CO2, NO, H2S) определяли с помощью метода газовой хроматографии на приборе Хроматэк-кристалл 5000.2, оснащенного детектором по теплопроводности (ДТП), пламенно-ионизационным детектором (ПИД) и электронозахватным детектором (ЭЗД), подключенны-

ми последовательно, что обеспечивает одновременный анализ горючих и негорючих компонентов. ПИД используется для детекции углеродсодержащих газов (CO, CO2, CH4), ЭЗД для определения NO, H2S, H2O, а ДТП — для H2, O2, N2. Разделение газовой смеси проводится на трехметровой надосадочной и капиллярной хроматографической колонках, заполненной полимером MN270, фракции 100–125 мкм. В качестве эталона для калибровочных кривых используются чистые газы (CO, CH4, CO2, N2, H2S, Ar, H2, N2, NO) с объемной долей компонентов (производитель ООО «Мониторинг» Санкт-Петербург). Анализ проводится в режиме программирования температуры в течение от 6 до 15 минут.

Этическая экспертиза

Заключение этического комитета ФГБОУ ВО Тверского ГМУ МЗ России от 28.03.2019 (протокол №3): члены ЭК одобрили предоставленные документы без замечаний. Проведение исследования одобрено единогласно.

Статистический анализ

Статистическая обработка данных и все расчеты производились с использованием пакетов программы IBM SPSS Statistics version 22 (Официальная лицензия от 21.02.2018 г.) и WINPEPI version 11.65 (J.H. Abramson, 2016).

Результаты

Объекты (участники) исследования

Обследовано 60 женщин фертильного возраста, которые были разделены на 4 группы:

1 группа — небеременные женщины с привычным невынашиванием беременности на этапе прегравидарной подготовки — 30 человек.
2 группа — небеременные женщины без репродуктивных потерь (группа контроля) — 30 человек.

Основные результаты исследования

В материале из влагалища 33 здоровых женщин (Рис. 1) чаще выделялись лактобациллы (63,6% выявлений), энтерококки (57,6%), бифидобактерии (48,5%). Реже выделялись эпидермальные стафилококки, пеп-тококки (36,4%), пептострептококки (33,3%), бациллы (27,3%), грибы рода Candida (21,2%), бактероиды (18,2%) и менее 10% проходилось на золотистый стафилококк, стрептококки, микрококки, вейлонеллы, гарднереллы, актиномицеты.

Количество микроорганизмов варьировало (Рис. 2) от 2,2 lg КОЕ/см2 у золотистого стафилококка до 6,77 lg КОЕ/см2 у гарднерелл. Количество лактобацилл в среднем составляло 3,8 lg КОЕ/см2, количество энтерококков, бифидобактерий, пептококков, пептострептококков, бактероидов, микрококков, вейлонелл — более 4 lg КОЕ/см2.

Микроорганизмы выделялись в ассоциации от 2-х до 6-ти, чаще лактобациллы, энтерококки, пептококки, пептострептококки, бифидобактерии, бактероиды.

Рис. 1. Спектр и частота встречаемости микроорганизмов влагалища у здоровых девушек.

Рис. 2. Количество микроорганизмов влагалища у здоровых девушек.

Из исследуемого материала выделено 30 штаммов лактобацилл. С помощью API систем идентифицированы различные их виды: L.rhamnosus, L.salivarius, L. acidophilus, L.fermentum, L.plantarum, L. buchneri, L.paracasei spp.paracasei.

В 1-й группе небеременных с ПНБ (Рис. 3) энтерококки встречались у 60% женщин, в 40% — стрептобациллы и Bacillus subtilis, в 26,7% — эпидермальный стафилококк и Klebsiella pneumoniae, в 20% — пептострептококки, в 13,3% — кишечная палочка и вейлонеллы и в 6,7% — золотистый стафилококк, стоматококки, протей, клостридии, бактероиды, гарднереллы и лактобациллы.

В количестве более 4 lg КОЕ/см2 (от 4,02 до 6,95) выделялись Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, E.coli, пептококки, пептострептококки, клостридии, вейлонеллы, стрептобациллы и гарднереллы. В количестве ниже 4 lg КОЕ/см2 (от 2,63 до 3,83) высевались

Рис. 4. Продукция газовых сигнальных молекул лактобациллами в основной и контрольной группах.

Рис. 3. Частота встречаемости микроорганизмов влагалища у небеременных женщин с ПНБ.

эпидермальный стафилококк, микрококки, энтерококки, стоматококки, бактероиды, кандиды, бациллы и лактобациллы.

Дополнительные результаты исследования

В процессе своей жизнедеятельности лактобациллы вырабатывают разнообразные газовые сигнальные молекулы, но наиболее значимыми в группе здоровых женщин были результаты по трем газам: СО2, СО и NO. Все выделенные штаммы лактобациллы выделяют большую концентрацию СО2 (Ме -35543 ppm), и активно потребляют О2 (-7 ppm) и N2 (-18 ppm).

Продукция СО была зарегистрирована у 23 штаммов лактобацилл (76,7%), Ме — 218,5 ppm. У 7 штаммов (23,3%) обнаружены отрицательные результаты, т.е. они потребляют этот газ. Окись азота вырабатывают 27 штаммов лактобацилл в разных концентрациях, в основном относящимся к видам Lactobacillus fermentum и L.planta-rum . У 9 штаммов (30%) концентрация NO колебалась от 100 до 23752 ppm, Ме составила 3568 ppm. У 18 штаммов бактерий (60%) концентрация окиси азота варьировала от 10 до 100 ppm (в среднем 45,3 ppm), и 3 штамма этот газ не выделяли.

Продукция других газов (H2, CH4, H2S) была очень низкой, составляя не более 3 ppm.

Что касается пациенток с привычным невынашиванием беременности, то наиболее значимые результаты были получены также по трем газовым сигнальным молекулам — СО, NO и СО2. Однако данные цифры оказались значительно ниже, чем в группе контроля: продукция NO составила в Ме — 322 ppm, в то время как у здоровых женщин — Ме 3568 ppm. Данные различия являются статистически достоверными (р = 0,005 Критерий Манна-Уитни 262). Также гораздо ниже оказалась продукция СО: Ме — 51,3 ppm, что является статистически достоверным

(р = 0,026, критерий Манна-Уитни — 289). Продукция же двух других газов H2S и CH4 в основной группе была выше, что также является достоверным (для Н2S Ме = 7,4, критерий Манна-Уитни 13,5, р = 0,01, для СН4 Ме = 2,81, р<0,0001, критерий Манна-Уитни — 100).

За последние годы проведены многочисленные исследования, показывающие чрезвычайно важную роль данных газообразных веществ в организме человека. Так, окись азота способствует поддержанию гомеостаза сосудов, вызывая расслабление гладких мышц стенок сосудов и угнетая их рост и утолщение интимы сосудов (гипертензивное ремоделирование сосудов), а также угнетая адгезию и агрегацию тромбоцитов, адгезию лейкоцитов к эндотелию сосудов. Кроме того, данный газ секретируется фагоцитами в процессе иммунного ответа в качестве одного из свободных радикалов и является высокотоксичным для бактерий и внутриклеточных паразитов. Эндогенный угарный газ (СО) — также одна из важных эндогенных сигнальных молекул, модулирует функции ЦНС и сердечно-сосудистой системы, ингибирует агрегацию тромбоцитов и их адгезию к стенкам сосудов. Углекислый газ является одним из важнейших медиаторов ауторегуляции кровотока. Он является мощным вазодилататором, оказывает положительное хронотропное и инотропное действие на миокард, а также влияет на деятельность иммунной системы, повышает сопротивляемость организма к бактериальным и вирусным инфекциям, участвует в обмене биологически активных веществ, влияет на проницаемость клеточных мембран и активность ферментов. CO2 регулирует возбудимость нервных клеток, стабилизирует интенсивность продукции гормонов и степень их эффективности, участвует в процессе связывания белками ионов кальция и железа [4; 7–9]. Нежелательные явления отмечены не были.

Обсуждение

Резюме основного результата исследования

Во влагалище женщин с привычным невынашиванием беременостии доминируют не лактобациллы, а энтерококки, которые встречаются в 60% случаев и более. Лактобациллы выявлялись у 27–33% пациенток. На фоне снижения содержания лактобацилл, патогенные и условно-патогенные микроорганизмы поддерживают воспалительные процессы в генитальном тракте у женщин, оказывая неблагоприятное влияние на наступление и течение беременности, приводя к развитию различных осложнений (угроза прерывания, самопроизвольный выкидыш, преждевременный разрыв плодных оболочек и преждевременные роды, плацентарные нарушения, врожденная пневмония у новорожденных и т.д.). Выявленные дисбиотические нарушения микробиома влагалища у пациенток с привычным невынашиванием беременности, (уменьшение содержания лакто- и бифидобацилл, преобладание условно-патогенных микроорганизмов), сопровождаются изменениями выделения и поглощения газовых сигнальных молекул, поддерживающих воспалительный процесс (NO, H2S и СО).

Обсуждение основного результата исследования

Учитывая неоспоримую роль инфекционного фактора в генезе привычного невынашивания, что было доказано многочисленными работами как отечественных, так и зарубежных исследователей, а также различные осложнения гестации у данного контингента больных, выявленные нарушения требуют обязательной коррекции еще на этапе прегравидарной подготовки с использованием антибактериальной, провоспалительной терапии, с последующим применением пробиотиков и метабио-тиков для восстановления и поддержания нормальной микрофлоры генитального тракта.

Ограничения исследования

Факторы, способствующие существенным образом повлиять на все этапы исследования, отсутствовали.

Заключение

Таким образом, установлено, что спектр основного микробиома влагалища здоровых женщин в возрасте 19–23 лет представлен бактериями нормальной микробиоты родов Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus, Bacillus, Staphylococcus (эпидермальные штаммы). Условно-патогенные грибы рода Candida, бактероиды, золотистый стафилококк, стрептококки, микрококки, вейлонеллы, гарднереллы и актино-мицеты выделялись в редких случаях. Различные штаммы лактобацилл выделялась у 91% здоровых женщин. Среди газовых молекул, продуцируемых лактобациллами, преобладают: СО₂, СО и NO.

Установлены дисбиотические нарушения микробиома влагалища у небеременных женщин с привычным невынашиванием беременности в анамнезе. Также у данной группы пациенток отмечено снижение продукции газовых сигнальных молекул: СО и NO, и повышение продукции H2S и CH4. На фоне уменьшения встречаемости лактобацилл, которые должны обеспечивать регуляторную функцию различных сторон жизнедеятельности организма женщин, условно-патогенные бактерии своими метаболитами могут играть отрицательную роль, не только поддерживая воспалительные процессы во влагалище, но и оказывать негативное воздействие на плод. Полученные результаты свидетельствуют о угнетении иммунного ответа у данной категории больных и необходимости коррекции дисбиотических нарушений еще на этапе прегравидарной подготовки.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов (The authors declare no conflict of interest).

Статья научная