Характеристики иммунного микроокружения нормальной слизистой оболочки перитуморальной области - дополнительный независимый прогностический фактор при раке желудка

При РЖ одной и той же стадии пациенты имеют различные клинические исходы, что стимулирует поиск новых прогностических факторов и эффективных методов лечения, одними из которых являются характеристики иммунного микроокружения опухолей, в том числе опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (TILs) [4]. С точки зрения иммунологии TILs – специфическая популяция Т-лимфоцитов, которая активируется при презентации дендритными клетками опухолевых антигенов [5]. Опухолевые антигены возникают в результате транскрипции участков ДНК, подвергшихся различным генетическим нарушениям.

В соответствии с рекомендациями Международной рабочей группы по изучению иммунных биомаркеров в онкологии (International Immunooncology Biomarkers Working Group, IIBWG) [12] лучшим для идентификации TILs признается иммуногистохимический метод. Согласно этому консенсусу, репрезентативным для оценки TILs счи- тается фрагмент ткани размером не менее 4–5 мм, более предпочтителен операционный, а не биопсийный материал. Метод тканевых микрочипов, по мнению данной рабочей группы, непригоден для оценки плотности инфильтрации TILs [12]. Однако рекомендованная методика подсчета не учитывает необходимость подсчета TILs во всех участках пе-ритуморальной области, поэтому необходима апробация новых шкал оценки TILs, а также внедрение автоматизированных систем, позволяющих выполнять более точный морфометрический анализ.

Для каждого образца было проведено обзорное окрашивание гематоксилином и эозином; иммуногистохимическое выявление маркера цитотоксических Т-лимфоцитов CD8 (клон C8/144В) с использованием иммуностейнера Autostainer 480S (Thermo Fisher Scientific, USA). Результаты реакций оценивали с использованием микроскопа DM4000B/DFC495 (Leica Microsystems, Germany) и автоматической системы морфометрического анализа LAS X (Leica Microsystems, Germany) с применением сегментации участков изображения выбранного цветового диапазона по шкале RGB. Результат морфометрического анализа фиксировался в виде площади, занятой объектами выделенного цветового диапазона (окрашенными диаминобензидином) в данном поле зрения в квадратных микрометрах (мкм2).

Для морфологической оценки использована оригинальная методика, частично основанная на рекомендациях IIBWG [12]: подсчет средней площади CD8+ клеток в трех полях зрения при ×20 в центральной части опухоли и участках морфологически нормальной слизистой оболочки перитуморальной области, непосредственно прилежащей к опухолевой ткани (находящейся на расстоянии не более одного поля зрения при ×20 от опухолевой ткани).

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программного пакета Statistica 10 (StatSoft, Inc., USA). Для статистической обработки результатов использовались: непараметрический U-критерий Манна–Уитни (Mann–Whitney U-test) для попарного сравнения групп, критерий Краскала–Уоллиса (Kruskal–Wallis test) для множественного сравнения, анализ выживаемости по Каплану–Майеру (survival analysis by Kaplan– Meier curve), логранговый критерий (log-rank test), критерий Кокса–Мантела (Cox–Mantel test) и критерий Вилкоксона, обобщенный Геханом (Gehan’s Wilcoxon test), а также многофакторный анализ выживаемости в регрессионной модели пропорциональных рисков Кокса (Cox proportional hazard model).

Результаты и обсуждение

Наибольшее значение медианы средней площади CD8+ клеток при оценке в центральной части опухолей было получено в группе T4a – 2260,8 мкм2, однако близкие значения также были получены в группе T1a/T1b – 2229,2 мкм2 и в группе T3 – 2260,8 мкм2 (табл. 3). Различия между группами по глубине инвазии при оценке инфильтрации в центральной части опухолей оказались статистически не значимыми. Наибольшее значение медианы при оценке инфильтрата в участках морфологически нормальной слизистой оболочки перитуморальной области было получе-

Таблица 3/table 3

Медианы средних площадей, занимаемых cd8+ клетками в 3 полях зрения в мкм2 при Ч20 в зависимости от клинико-морфологических характеристик опухоли

Medians of the average areas occupied by cd8+ cells in three fields of view in square micrometers (Ч20) in the context of the clinical and morphological characteristics of the tumor

Клинико-морфологические свойства опухоли/	В центральной части опухоли/	В участках морфологически нормальной слизистой оболочки перитуморальной области/
Clinical and morphological properties of the tumor	In the central part of the tumor	In areas of morphologically normal mucous membrane of the peritumoral area

Глубина инвазии/Depth of invasion

(рис. 1а). Известно, что высокая плотность инфильтрации опухолевой ткани цитотоксическими CD8+ Т-лимфоцитами ассоциирована с лучшим прогнозом. Основным путем активации этой популяции клеток является презентация антигена дендритными клетками путем связывания Т-клеточного рецептора (TCR) и CD8 с соответствующими

При изучении связи средней площади CD8+ клеток с количеством метастазов в регионарные лимфатические узлы, а также наличием отдаленных метастазов значимых различий не выявлено.

Наибольшее значение медианы средней площади CD8+ клеток при оценке в центральной части опухолей было получено в группе опухолей с наличием эмболов в лимфатических сосудах – 2429,8 мкм2, однако это преобладание не является статистически значимым (табл. 3).

Рис. 2. Распределение средней площади CD8+ клеток в зависимости от показателей общей 5-летней выживаемости по Каплану–Майеру: а – в зависимости от плотности распределения средних площадей CD8+ клеток в центральной части опухолевой ткани;

б – в зависимости от средней площади CD8+ клеток в центральной части опухолевой ткани; в – в зависимости от плотности распределения средних площадей CD8+ клеток в участках морфологически нормальной слизистой оболочки перитуморальной области выживаемости пациентов; г – в зависимости от средней площади CD8+ клеток в участках морфологически нормальной слизистой оболочки перитуморальной области

Fig. 2. Distribution of average area of CD8+ cells by overall five-year survival of patients: a – analysis of the density distribution of average areas of CD8+ cells in the central part of the tumor tissue by survival; b – Kaplan-Meier survival analysis by average area of CD8+ cells in the central part of the tumor tissue; c – analysis of the density distribution of average areas of CD8+ cells in morphologically normal mucous membrane of the peritumoral area by survival; d – Kaplan-Meier survival analysis survival by average area of CD8+ cells in morphologically normal mucous membrane of the peritumoral area

носным и лимфатическим сосудам и способствует метастазированию. Возможная патогенетическая роль CD8+ TILs в прилежащей к инвазивному краю опухоли морфологически не измененной ткани также изучена недостаточно. Известно, что CD4+ лимфоциты способны стимулировать активность CD8+ лимфоцитов путем секреции эффекторных цитокинов [6]. Следовательно, если предположить, что в перитуморальной области CD4+ Т-хелперы 17 типа находятся в активированном состоянии, то весьма вероятно, что они стимулируют миграцию и активность CD8+ лимфоцитов. При изучении связи средней площади CD8+ клеток с наличием эмболов в кровеносных сосудах, степенью дифференцировки и локализацией опухоли значимых различий не получено.

В целях проведения анализа выживаемости выборка была сгруппирована на основании не- скольких пороговых значений средней площади CD8+ клеток в 3 полях зрения при ×20, которые были определены в ходе построения функций выживаемости. Исследованная выборка случаев является цензурированной как слева (отсчет времени проводился от даты операции), так и справа (срок наблюдения ограничивался 60 мес). Исследованные случаи были разделены на три группы по средней площади CD8+ клеток в центральной части опухоли: до 1100 мкм2; от 1100 до 3500 мкм2; от 3500 мкм2 и более. Разделение на группы проводилось эмпирически путем выделения пороговых значений средней площади CD8+ клеток, разделяющих области наибольшего скопления значений на графиках плотности распределения полученных данных (рис. 2а).

Для трех выбранных групп были построены кривые выживаемости Каплана–Майера (рис. 2б).

Таблица 4/table 4

Стадия/Stage (n=53)		Степень дифференцировки/Differentiation degree (n=53)
I	11	AC, NOS, G1	4
II	8	AC, NOS, G2	12
III	24	AC, NOS, G3	20
IV	10	SRC	17

Таблица 5/table 5

Сравнение результатов проведения многофакторного анализа общей пятилетней выживаемости пациентов с использование регрессионной модели пропорциональных рисков Кокса comparison of the results of a multivariate analysis of the overall five-year survival of patients using the cox proportional risk regression model

Средняя площадь CD8+ клеток в 3 полях зрения (мкм2) при ×20, измеренная методом автоматической сегментации, в центральной части опухоли (до 110 мкм2; 1100–3500 мкм2; более 3500 мкм2)/ The average area of CD8+ cells in 3 fields of view (sq. μm) at magnification about ×20, measured by automatic segmentation, in the central part of the tumor (up to 110 sq. μm; 1100–3500 sq. μm; more than 3500 sq. μm)	0,803	0,574–1,122	> 0,05
Средняя площадь CD8+ клеток в 3 полях зрения (мкм2) при ×20, измеренная методом автоматической сегментации, в морфологически нормальной слизистой оболочке периту-моральной области, непосредственно прилежащей к опухолевой ткани (до 3300 мкм2; более 3300 мкм2)/	1,537	0,761–3,105	< 0,01
The average area of CD8+ cells in 3 fields of view (sq. μm) at magnification about

×20, measured by automatic segmentation, in the morphologically normal mucous membrane of the peritumoral region, immediately adjacent to the tumor tissue (up to 3300 sq. μm; more than 3300 sq. μm)

Лучшая пятилетняя выживаемость наблюдалась в группе больных с опухолями со средней площадью CD8+ клеток в 3 полях зрения от 3500 мкм2 и более, однако значимые различия между группами отсутствовали (критерий χ2: n=114, p=0,1260). В зависимости от средней площади CD8+ клеток в участках морфологически нормальной слизистой оболочки перитуморальной области исследованные случаи были разделены на две группы: до 3300 мкм2; от 3300 мкм2 и более. Разделение на группы проводилось на основании анализа плотности и функции распределения полученных данных (рис. 2в). Лучшая пятилетняя выживаемость наблюдалась у группы пациентов, в образцах от которых средняя площадь CD8+ клеток в 3 полях зрения в участках морфологически нормальной слизистой оболочки перитуморальной области не превышала 3300 мкм2 (рис. 2г), причем различие с другой группой характеризовалось высоким уровнем статистической значимости (для n=79: лог-ранговый критерий – p=0,0333; критерий Кокса–Мантела – p=0,0381; критерий Вилкоксона, обобщенный Ге- ханом – p=0,01). Следует обратить внимание, что в группе с высокой (от 3300 мкм2 и более) площадью CD8+ клеток присутствовали опухоли различных pTNM-стадий и дифференцировки (табл. 4).

При сравнении выживаемости пациентов в рамках одной клинической стадии выявлено значимое снижение выживаемости пациентов с РЖ IV стадии при высокой средней площади CD8+ клеток (более 3300 мкм2) (рис. 3). Для других стадий значимых различий не получено, что может быть связано с малым числом наблюдений, однако у больных РЖ III стадии прослеживается тенденция к ухудшению выживаемости при высокой средней площади CD8+ клеток в участках морфологически нормальной слизистой оболочки перитуморальной области.

Таким образом, впервые показано, что высокая плотность инфильтрации CD8+ клетками, выраженная в виде средней площади в 3 полях зрения при ×20 и подсчитанная автоматическим методом, достоверно ассоциирована с худшей общей пятилетней выживаемостью пациентов, а так-

Рис. 3. Общая пятилетняя выживаемость по Каплану–Майеру больных РЖ в зависимости от стадий и средней площади CD8+ клеток в участках морфологически нормальной слизистой оболочки перитуморальной области: а – РЖ I стадии; б – РЖ II стадии; в – РЖ III стадии; г – РЖ IV стадии

Fig. 3. Тhe overall five-year Kaplan-Meier survival of patients with gastric cancer depending on stages and average area of CD8+ cells in morphologically normal mucous membrane of the peritumoral area:

a – gastric cancer I stage; b – gastric cancer II stage; c –gastric cancer III stage; d – gastric cancer IV stage