Хелатные комплексы на основе малых молекул растительного происхождения как аналог антибиотическим препаратам

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда № 22-76-10008-П П.

Многие микроорганизмы, как известно, при длительном воздействии того или иного негативного фактора подвергаются определенного рода селекции, или эволюционному отбору, опосредующему формирование невосприимчивости к этому фактору in spe (1). Подобная адаптация, способная, к тому же, к быстрому распространению не только внутри одной группы прокариот, но и за ее пределами посредством различного рода горизонтальных переносов (2) (трансформация, трансдукция или конъюгация), хоть и была открыта достаточно давно (3), привлекла к себе внимание мирового сообщества только в последние годы, вызвав существенную обеспокоенность, особенно в фармацевтике, медицине и животноводстве.

На фоне участившихся случаев формирования множественной лекарственной устойчивости у патогенной или условно патогенной микробиоты возникла необходимость разработки новых антибиотических препаратов и строгого контроля за их применением (4). В частности, появились метициллин-резистентные Staphylococcus aureus (5), ванкомицин-резистент-ные энтерококки (6), карбапенем-резистентные Klebsiella pneumoniae и Acin-etobacter baumannii (7), невосприимчивые к цефалоспоринам, аминогликозидам и фторхинолонам Pseudomonas aeruginosa (8), устойчивые к изониазиду и рифампицину Mycobacterium tuberculosis (9) и многие другие.

Особую обеспокоенность проблема вызывает у работников животноводческого сектора, где применение кормовых антибиотиков в терапевтических целях до недавнего времени было обыденной практикой, способствующей не только фоновой защите животных от болезнетворных микроорганизмов, но и стимулирующей ростовые процессы (10). Так, в 2020 году общий объем применения антибиотиков в кормлении крупного рогатого скота, овец, кур и свиней, рассчитанный по методу PCU (population correction units), только для 42 стран, представляющих официальную отчетность, достигал 99502 т (11).

Результатом стала не только мультирезистентность микроорганизмов, но и ее миграция по трофическим цепочкам, ведущим к человеку, что представляет угрозу глобального масштаба (12). Правительства большинства прогрессивных стран мира (13, 14), включая Российскую Федерацию (Федеральный закон от 30.12.2021 № 463-ФЗ «О внесении изменений в Закон Российской Федерации «О ветеринарии» и Федеральный закон «Об обращении лекарственных средств»), ввели ограничения или полностью запретили применение антибиотических препаратов в терапевтических целях в животноводстве.

Однако в этом случае возникает закономерный вопрос, как обеспечить защиту сельскохозяйственного поголовья от вредоносных микроорганизмов и повысить темпы роста животных, чтобы это не привело к аналогичной проблеме (15).

Число публикаций по обозначенной теме возросло в несколько раз. Если за 2010 год по ключевым словам «антибиотики, запрет, животноводство» в Google Академия было зарегистрировано только 327 статей, то в 2025 году их уже 1180. Среди альтернатив, помимо направленной вакцинации (16, 17), предлагаются различного рода пробиотики, улучшающие здоровье кишечника и усиливающие иммунный ответ (18); пребиотики, такие как инулин и фруктолигосахариды, способствующие развитию полезной микробиоты (19); бактериофаги и антимикробные пептиды, нацеленные на лизис специфичных патогенов (20, 21); органические кислоты, стимулирующие ферментативные процессы (22); нано- и ультрадисперсные частицы металлической природы (23); расти-720

тельные соединения (фитобиотики) (24) с разнообразной антимикробной активностью. Все они, так или иначе, способствуют подавлению патогенной микрофлоры и росту продуктивности животных, однако, как правило, характеризуются либо высокой стоимостью (про- и пребиотики, бактериофаги, наночастицы), либо неустойчивым эффектом (органические кислоты, фитобиотики) (25). Поэтому при включении подобных добавок в корма, помимо замены антибиотиков, преследуются и сопутствующие задачи, например обогащение рационов макро- и микроэлементами (26).

Еще одной альтернативой могут стать хелатные комплексы минералов на основе малых молекул растительного происхождения, аккумулирующие в себе потенциал фитобиотиков и ультрадисперсных частиц. Оба компонента — и органический, и неорганический (ионы металла) — в этом случае обладают бактерицидными свойствами (27, 28). Их комбинирование посредством хелатирования способствует лучшей усвояемости в организме животных минеральной фракции (29), что ведет к снижению числа используемых добавок и нивелированию выбросов в окружающую среду (30). Более того, стабильные органические формы микроэлементов не подвержены адсорбции и осаждению при взаимодействии с антагонистическими факторами (например, с гуминовой кислотой) в просвете кишечника и не вызывают окислительный стресс (31).

При разработке подобных препаратов, как и в других описанных случаях, перед целевым применением необходимо проводить дополнительные исследования антибиотических свойств и биологических эффектов.

В настоящей работе впервые были синтезированы и охарактеризованы хелатные комплексы ванилина с эссенциальными микроэлементами (Zn, Co, Cu) для применения в качестве альтернативы кормовым антибиотикам. Установлены нетривиальные эффекты модуляции антимикробной активности, обусловленные процессами хелатирования: усиление или пролонгирование действия, а также способность сверхмалых доз этих комплексов (особенно Van 2 Zn и Van 2 Co) достоверно повышать переваримость сухого вещества корма.

Целью работы стал химический синтез металлорганических комплексов на основе ванилина и оценка их эффективности в качестве альтернативы антибиотикам, а также определение их влияния на переваримость сухого вещества корма в системе искусственного рубца.

Методика. Исследование проводили на базе Центра коллективного пользования ФГБНУ ФНЦ БСТ РАН в 2025 году.

В качестве исходных материалов для синтеза хелатированных комплексов на основе данных литературы и установленной биологической роли были отобраны: ванилин (CAS: 121-33-5, 99 %; «Bide Pharmatech Co., Ltd.», Китай); медь двухлористая, 2-водная (ЧДА, ГОСТ 4167-74, ЗАО «ВЕКТОН», г. Санкт-Петербург); цинк хлористый (ЧДА, ОАО «ОХК «Уралхим»», г. Москва); кобальт хлористый 6-водный (ЧДА, ГОСТ 452577, ОАО «ОХК «Уралхим»», г. Москва).

Для синтеза металлокомплексов при постоянном помешивании заранее готовили 4 раствора (на 50 мл дистиллированной воды каждый): 1 — 0,782±0,001 г C0CI 2 • 6H 2 O — розовый раствор октаэдрического (Со(Н 2 О) б )²⁺; 2 — 0,560±0,001 г CuCl 2 • 2H 2 O — зеленоватый раствор Cu(H 2 O) 2 )²⁺; 3 — 0,448±0,001 г ZnCl 2 — бесцветный раствор (Zn)²⁺; 4 — 1,000±0,001 г ванилина. Все указанные навески готовили с использованием лабораторных аналитических весов ВЛА-200г-М (ООО «НПП Гос-метр», Россия).

Последний раствор нагревали до 70-80 ° C на водяной бане LOIP

LB-160 (АО «Лабораторное оборудование и приборы», Россия), для улучшения растворимости добавляли 5 мл этанола, далее к нему при постоянном помешивании (перемешивающее устройство LOIP LS-120, АО «Лабораторное оборудование и приборы», Россия) добавляли 10 % водный раствор NaOH до pH ® 8-9. Затем полученный раствор медленно (по каплям, за 10-15 мин) приливали к растворам 1-3 при интенсивном перемешивании и 50-60 ° C, наблюдая изменение цвета и образование осадка. Полученные суспензии выдерживали при 60 ° C в течение 45-60 мин для завершения реакции, после чего охлаждали до комнатной температуры. Осадок отфильтровывали через воронку Бюхнера и последовательно промывали: 20 мл холодной дистиллированной воды, 10 мл холодного этанола (для удаления остатков непрореагировавшего ванилина). Полученные металло-комплексы сушили при 45-50 ° C в течение 4-6 ч в фарфоровой чаше до постоянной массы.

Эффективность синтеза оценивали с помощью Фурье-спектрометрии на Фурье-спектрометре ФСМ 2201/2202 (ООО «Инфраспек», Россия). Предварительно подготовленные и высушенные образцы в виде порошка растирали с бромидом калия (KBr) и прессовали в таблетки. При математической обработке данных из каждого спектра вычитали фоновый сигнал.

Для оценки антибактериальных свойств навески исходных солей, ванилина и металл органических комплексов в количестве 100 мг диспергировали ультразвуком частотой 35 кГц в 1 мл дистиллированной воды (УЗВ «Сапфир» 4.0, Россия) при 25 ° C для получения однородной суспензии. Далее в 96-луночном культуральном планшете готовили серии двукратных разведений от 50 до 9,31х10 ^{- 8} мг/мл.

Биологическую активность определяли с помощью рекомбинантного люминесцирующего штамма Escherichia coli K12 TG1, несущего гибридную плазмиду pUC19 с клонированными lux CDABE генами морского люминесцирующего организма Photobacterium leiognathi 54D10 (коммерческое название «Эколюм», АО «НВО ИММУНОТЕХ», Россия).

Для этого 100 мкл бактериальной суспензии вносили в лунку к исследуемому образцу и инкубировали в течение 3 ч, фиксируя интенсивность люминесценции с периодом в 5 мин на многофункциональном микропланшетном ридере TECAN Infinite F200 («Tecan Austria GmbH», Австрия). Для графического отображения полученных результатов вычисляли нормализованное относительное значение биолюминесценции по формуле:

A = ^-х 100 %, где Ik 0 — светимость контрольной пробы на 0-й мин эксперимента; 1кп — светимость контрольной пробы на n-й мин эксперимента; Io 0 — светимость опытной пробы на 0-й мин эксперимента; Ion — светимость опытной пробы на n-й мин эксперимента.

Также рассчитывали эффект абсолютного подавления свечения (индекс токсичности) по формуле:

A = ^-х 100 %, где Ion — светимость опытной пробы на n-й мин эксперимента; 1кп — светимость контрольной пробы на n-й мин эксперимента.

Метод позволяет определить, как интенсифицирующие, так и ингибирующие, субтоксичные дозы и, соответственно, вывести концентрации, рекомендуемые к дальнейшему тестированию на животных. Эффек- тивность метода доказана в ранее проведенных исследованиях по определению активности микроэлементов (32, 33).

Переваримость сухого вещества базового субстрата (микрорацион: грубые корма/концентрат в соотношении 70/30 — 500 мг) при внесении исследуемых металлокомплексов определяли с помощью установки инкубатора и буферного раствора по специализированной методике. Для этого у бычков ( Bos taurus taurus L.) породы казахская белоголовая ( n = 5, 12 мес, 295±6,5 кг), рацион которых включал сено злаковое (1 кг), сено бобовое (2 кг), силос кукурузный (9,5 кг), дробленую зерносмесь (2 кг), жмых подсолнечный (0,1 кг), патоку кормовую (0,6 кг), соль поваренную (37 г), монокальцийфосфат (47,7 г) и премикс (20 г), через хроническую фистулу отбирали пробы рубцового содержимого.

Транспортировку осуществляли в течение 30 мин, поддерживая температурный режим +38,5^+39,5 ° C. Перед использованием рубцовую жидкость тщательно встряхивали и процеживали через 4 слоя марли. Заранее пакетики для in vitro ( n = 10, Ankom F57, пористость 25 микрон, «ANKOM Technology Corp.», США) взвешивали и нумеровали, в них помещали по 500 мг кормового субстрата и запаивали. Рубцовую жидкость, разведенную буфером (на 8 л дистиллированной воды 68 г NaHCO s , 8 г (NH 4 ) 2 HPO 4 , 40 г K 2 HPO 4 , 4 г MgSO 4 , 0,8 г CaCl 2 , 0,08 г FeSO 4 , 8 г NaCl) в соотношении 1:4, насыщали углекислым газом и по 2 л размещали в емкостях искусственного рубца (ANKOM Daisy II, «ANKOM Technology Corp.», США), задавая программу: 24 ч при +39,5 ° C. По окончании инкубации образцы промывали и высушивали при температуре +60 ° C до константной массы. Коэффициент переваримости определяли по формуле:

, где mi — исходная масса образца корма вместе с мешочком, г; m 2 — масса образца корма вместе с мешочком после переваривания, г; m 3 — исходная масса образца корма без массы мешочка, г.

Экспериментальные исследования на животных были выполнены в соответствии с протоколами Женевской конвенции и принципами надлежащей лабораторной практики «The Guidefor Careand Useof Laboratory Animals» (Руководство по уходу и использованию лабораторных животных; National Academy Press Washington, D.C., 1996). При выполнении работ были предприняты все усилия, чтобы свести к минимуму страдания животных и число образцов. Все процедуры над животными были одобрены комиссией по биоэтике ФНЦ БСТ РАН, протокол № 3 от 03.09.2025.

Экспериментальные данные обрабатывали с помощью программного пакета Statistica 10 («StatSoft, Inc.», США) и Microsoft Excel («Microsoft Corporation», США). Рассчитывали средние значения (М), среднеквадратичные отклонения (±о), стандартные ошибки (±SEM). Данные представлены в виде M±SEM. Для сравнения вариантов использовали непараметрический метод анализа. Априорный анализ мощности для U-критерия Манна-Уитни был проведен на основе его параметрического аналога (t-тест для независимых выборок). При ожидаемых средних с минимально значимым эффектом (в тесте ингибирования бактериальной люминесценции щ = 100, р2=80; в опыте по определению переваримости сухого вещества корма щ = 25, р2 = 30), а = 0,05, at = 2,5, 02 = 1,5 и мощности 0,80 для t-теста требовалось 2 (бактериальная люминесценция) и 3 (коэффициент переваримости) повторности на группу. Учитывая асимптотическую относительную эффективность непараметрического критерия (0,955) и 10 % на выбросы, итоговое число повторностей было увеличено до 5. Разли- чия считали статистически значимыми при р < 0,05 и р < 0,01.

Резуёьтаты . С целью проведения синтеза хелатированных комплексов, основываясь на известных химических свойствах и биологических эффектах нами были отобраны ванилин; медь двухлористая, 2-водная; цинк хлористый; кобальт хлористый 6-водный.

Ванилин — 4-гидрокси-3-метоксибензальдегид с молекулярной формулой C 8 H 8 O 3 , в структуре которого присутствуют гидроксильная и эфирная функциональные группы, прикрепленные к ароматическому кольцу. Будучи основным компонентом экстракта стручков орхидеи Vanilla planifolia, ванилин обладает выраженными противоопухолевыми, нейро- и нефропротекторными, антибиотическими и антикворумными характеристиками (34). В исследованиях на цыплятах-бройлерах ванилин (0,25 мг/кг корма) продемонстрировал существенный рост-стимулирующий эффект (+22,16 % относительно контроля), опосредуя при этом повышение концентрации протеина и зольного остатка в мышечной ткани на фоне снижения доли жира (35). Выработка метана и аммиака в опытах на жвачных животных, напротив, линейно снижались с увеличением доз ванилина. Однако здесь же отмечалось уменьшение переваримости корма и концентрации летучих жирных кислот в рубце. Популяция простейших сократилась, но численность Ruminococcus flavefaciens , Prevotella bryantii , Butyrivibrio fibrisolvens , Prevotella ruminicola , Clostridium aminophilum и Ruminobacter am-ylophilus увеличилась с повышением доз ванилина (36). Следовательно, ванилин обладает существенным потенциалом в качестве регулятора пищеварительных процессов, однако, судя по всему, требуется уточнение используемых дозировок. Многие исследования направлены на удешевление его производства посредством извлечения не только из растительного сырья, но и из различного рода отходов, а также на его получение с помощью химического синтеза и микроорганизмов (37, 38).

Медь двухлористая, 2-водная — элементарная медь, электронная конфигурация атома которой позволяет существовать ей в биологических системах в двух степенях окисления и связываться с белками через ком-плексирование с цистеином, гистидином и метионином. Она выступает одним из ключевых редокс-катализаторов в различных метаболических реакциях. В частности, медь входит в состав или служит кофактором таких ферментов, как цитохром-с-оксидаза, дофамин- в -гидроксилаза, тирозиназа, пептидилглицин-альфа-амидающая монооксигеназа, аминоксидаза, супероксиддисмутаза Cu/Zn, лизилоксидаза и некоторых других (39). Она участвует в энергетической трансформации и процессах биосинтеза, выполняет роль динамической сигнальной молекулы, ингибирует липолиз, регулирует работу калиевых каналов и активность Е3-убиквитинлигазы (40). Медь контролирует процессы свертывания крови и артериальное давление, участвует в перекрестном сшивании коллагена соединительных тканей, синтезе гормонов, миелинизации нервных волокон головного и спинного мозга, процессах аутофагии и дифференцировки (41). Она также необходима для клеточного дыхания, защиты от свободных радикалов, функционирования нейромедиаторов и поддержания гомеостаза железа (мультимедные ферроксидазы — гефестин и церулоплазмин (41). Недостаток меди в рационе, который часто наблюдается у сельскохозяйственных животных, негативно сказывается на метаболизме холестерина и глюкозы, работе сердца и иммунитете и, как правило, сопровождается окислительным стрессом, нарушениями митохондриальных функций и изменениями в липидном обмене (42, 43).

Цинк необходим для формирования вторичной структуры почти 10

% белков, закодированных в геноме млекопитающих (некоторые факторы транскрипции, внутриклеточные рецепторы гормонов, металлотионеины и многие энзимы). Это второй по распространенности микроэлемент в организме после железа. От его присутствия зависит активность более 300 ферментов и 1000 транскрипционных факторов. В составе ферментов или как их кофактор цинк участвует в метаболизме белков, углеводов, липидов и нуклеиновых кислот (карбоангидраза, щелочная фосфатаза, ферменты цикла мочевины), транскрипции, клеточной сигнализации, пролиферации и дифференцировке, экспрессии генов (белок p53 и другие белки репарации ДНК), мембранном транспорте, модуляции окислительно-восстановительного потенциала (Cu/Zn-супероксиддисмутаза, каталаза и пероксидаза) и клеточном дыхании (44).

Цинк не только входит в состав костной ткани, но и участвует в синтезе коллагеновой матрицы, минерализации и обновлении костей. Доказано, что цинк может стимулировать транскрипционный фактор 2 (Runx2) и способствовать дифференцировке остеобластов. С другой стороны, цинк снижает резорбцию костей, стимулируя апоптоз остеокластов. Кроме того, цинк регулирует путь RANKL/RANK/OPG, тем самым способствуя ремоделированию костей (45). Цинк регулирует внутриклеточные сигнальные пути врожденных и адаптивных иммунных клеток, влияет на иммунные ответы, включая выработку антител, воспалительные сигналы и дифференцировку лимфоцитов. Недостаток цинка ведет к дегенерации Т-и В-лимфоцитов и ускорению процессов апоптоза (46). Значительную роль цинк играет и в эндокринной системе. В частности, он необходим для формирования структурной устойчивости инсулина и гормонов щитовидной железы. Баланс цинка жизненно важен для образования нейронов и пролиферации стволовых клеток в процессе развития. Цинк-зависимые ферменты участвуют в работе ЦНС, и «свободный» цинк, по-видимому, модулирует различные постсинаптические рецепторы. Например, цинк ингибирует рецепторы ГАМК-А, что снижает их тормозное действие (47). Цинк также включен в метаболизм витамина A, выступает ключевым компонентом ретинолдегидрогеназы, поддерживает целостность сетчатки и ее способность реагировать на световые стимулы играя тем самым решающую роль в зрительной функции животных. Цинк оказывает значительное влияние на сердечно-сосудистую систему животных, главным образом благодаря способности подавлять перекисное окисление липидов и высвобождение гистамина, поддерживать проницаемость сосудистых стенок и стабилизировать клеточные и лизосомные мембраны.

Дефицит этого элемента снижает активность карбоангидразы и гидроксипептидазы, при этом нарушается обмен углекислого газа, процессы производства энергии и удаления отходов, ухудшается расщепление белка в желудочно-кишечном тракте и ограничивается поступление незаменимых аминокислот, замедляется развитие мышц и иммунная функция. При недостатке цинка нарушается репликация и транскрипция ДНК и, как следствие, деление, рост и развитие клеток (48). У цыплят нехватка цинка проявляется также скелетными деформациями и задержкой роста (49). У телят возникают проблемы с суставами (50). У животных наблюдается атрофия иммунных органов, снижается численность лимфоцитов, выработка иммуноглобулинов, фагоцитарная способность макрофагов, цитотоксическая активность натуральных киллеров, увеличивается восприимчивость к вирусным инфекциям и развитию опухолей (41, 52). Помимо прочего, за счет снижения активности щелочной фосфатазы, лактатдегидрогеназы и гиалуронидазы падает выработка сперматозоидов у сам- цов, возникает задержка половой зрелости (53). Дефицит цинка может нарушать нормальную функцию оси гипоталамус—гипофиз—гонады, которая отвечает за регуляцию секреции половых гормонов. Это приводит к снижению секреции лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов из гипофиза. У самок с дефицитом цинка качество яйцеклеток может пострадать, снижается вероятность успешного оплодотворения. Даже если происходит оплодотворение, развитие эмбриона может быть нарушено (54). Дефицит цинка связан с уменьшением массы тела, снижением способности метаболизировать глюкозу и подавлением иммунной функции (55).

Физиологическая роль кобальта, в основном, обусловлена тем, что он входит в состав коррина — модифицированного тетрапирольного кольца витамина B 12 (C 63 H 88 CON 14 O 14 P). Последний в своей активной форме (метилкобаламин и 5 ‘ -дезоксиаденозилкобаламин) необходим для функционирования ряда ферментов, таких как диолдегидратаза, этаноламинам-монлиаза, глутамат- и метилмалонил-КоА-мутаза, метионинсинтаза и ри-бонуклеотидредуктаза (56). Как следствие, он участвует в метаболизме гомоцистеина, миелинизации нервных волокон, гемопоэзе, синтезе жирных, амино- и нуклеиновых кислот, производстве энергии и созревании клеток, поддержании целостности слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта (57). Кроме того, витамин B 12 обладает антиоксидантной активностью, снижая концентрацию глутатиона в эритроцитах и печени (58). Природные формы витамина B 12 — 1,5-дезоксиаденозилкобаламин, гидроксикобаламин, метилкобаламин и аденозилкобаламин, — синтезируются, в частности, бактериями и археями рубца жвачных и кишечника моногастричных животных из родов Bacillus , Escherichia , Fervidobacterium , Kos-motoga , Lactobacillus , Mesotoga, Nitrosopumilus , Petrotoga , Propionibacterium , Proteobacteria , Pseudomonas , Rhodobacter , Rhizobium , Salmonella , Sinorhizobium , Thermosipho и Thermotoga (59). Всего в этом процессе насчитывается около 30 этапов, опосредуемых ферментами, которые участвуют в преобразовании аминолевулиновой кислоты через уропорфириноген III и аденозилко-бириновую кислоту в кобаламин (60). Как следствие, дефицит кобальта особенно остро отражается на жвачных животных, у которых признаки последнего варьируют от гипорексии, снижения темпов роста и потери массы до стеатоза печени, анемии, подавления иммунной и репродуктивной функций и даже смерти (61). Недостаточное количество витамина B 12 и фолиевой кислоты может существенно сказаться на эффективности иммунного ответа, подавлять производство нуклеиновых кислот и синтез белка, активность иммунных клеток и нарушать метаболические процессы, такие как метилирование и циклы серина, глицина и пурина. Неэффективное метилирование может привести к гипергомоцистеинемии, вызывающей системное и сосудистое воспаление, которое способствует патогенезу многих других заболеваний. Превращение гомоцистеина в метионин предотвращает накопление гомоцистеина в сыворотке, ограничивая тем самым сосудистые заболевания, неврологические нарушения и атрофию мозга (62). Однако чаще всего при недостатке витамина B 12 у млекопитающих формируется мегалобластная анемия, характеризуемая незрелыми, крупными и аномальными эритроцитами (63).

В отношении непосредственно хелатных (металлорганических) комплексов следует отметить, что они находят все большее применение в кормлении различных сельскохозяйственных животных за счет улучшенной биодоступности (30, 64, 65). Органически связанные минералы имеют множество преимуществ перед неорганическими источниками. Они обла-726

дают улучшенной абсорбцией и эффективностью, что позволяет комфортно удовлетворять потребности сельскохозяйственных животных при низких дозах. Следовательно, неорганические формы можно заменить более низкими дозами органических минералов без каких-либо негативных последствий для продуктивности (66). При этом наблюдаемые эффекты во многом зависят от биологических и химических свойств исходных веществ.

Так, ранее было показано, что кормление перепелов японской породы хелатными микроэлементами (железо, медь, цинк, марганец и кобальт) с галлокатехином зеленого чая при снижении нормы ввода минералов в 10 раз обеспечивает повышение выживаемости цыплят на 4 %, прироста средней массы тела на 4,8 % и усвояемости сухого вещества корма на 1,7 %, причем яйценоскость кур-несушек увеличивается на 5,8 %, а масса яиц на 7,4 % (67). В исследовании H. Rajaei-Sharifabadi с соавт. (29) при введении в рацион овец минеральной добавки на основе хелатных форм элементов наблюдалось повышение расщепляемости в рубце in situ нейтрально-детергентной и кислотно-детергентной клетчатки через 6 ч инкубации, значительно снижалась pH рубца и улучшалась переваримость сухого вещества корма, органического вещества, а также усвояемость микроэлементов по сравнению с неорганическими источниками.

Что касается ванилина, то его наиболее часто используют совместно с первичными ароматическими или алифатическими аминами для каталитического синтеза оснований Шиффа посредством формирования азометиновой (C=N) связи, отвечающей за противораковые, антиоксидантные, антибактериальные, противотуберкулезные, противомалярийные, противовирусные, противовоспалительные и противодиабетические эффекты (68-70). Биологически активные металлокомплексы ванилина с основаниями Шиффа были разработаны с использованием различных металлов, включая медь, никель, кобальт, цинк, марганец и палладий (7173). Ванилин представляет собой важный класс кислородсодержащих лигандов для ионов переходных металлов.

Комплексообразование может происходить через карбонильный кислород, гидроксильный кислород и метоксикислород. Однако было описано лишь несколько комплексов переходных металлов с ванилином (74-76). Октаэдрический комплекс ванилина с Cu (II) был описан de Medeiros W.M. с соавт. (77). Этот комплекс продемонстрировал сильную способность расщеплять ДНК в присутствии перекиси водорода и глутатиона. Кроме того, были опубликованы кристаллические структуры комплексов цинка(П) с ванилином (78, 79). Синтезированы тетраядерный комплекс никеля(П) и комплекс Fe(III) с использованием о-ванилина в качестве многодентатного лиганда (80, 81).

Представленные ниже результаты также демонстрируют принципиальную возможность использования хелатных комплексов ванилина с эссенциальными микроэлементами (Zn, Co, Cu) в качестве многофункциональных кормовых добавок, сочетающих антимикробную активность и способность улучшать переваримость корма.

В спектре ванилина (рис. 1, А) среди ключевых полос отмечалось интенсивное поглощение при - 1666 см ^{- 1} ( v C=O альдегидной группы), дублет в области - 1266 и - 1300 см ^{- 1} ( v C-O фенольного фрагмента и 5 C-H), а также широкая полоса в районе - 3172 см ^{- 1} ( v O-H фенола), что полностью релевантно ранее проведенным исследованиям. D. Dinev с соавт. в ИК-спектре ванилина также наблюдали интенсивные полосы при - 3152 см ^{- 1} (группа v O-H) и при - 1666 см ^{- 1} ( v C=O) (82).

2000           2500

Б

2000           2500

В

2000           2500

Г

2000           2500

Волновое число, см 1

Рис. 1. ИК-спектры исследуемых металлокомплексов: А — Van (ванилин), Б — Van 2 Cu (ме-таллорганический, хелатный, комплекс на основе ванилина и меди), В — Van 2 Co (металлор-ганический, хелатный, комплекс на основе ванилина и кобальта); Г — Van 2 Zn (металлорга-нический, хелатный, комплекс на основе ванилина и цинка) (ФГБНУ ФНЦ БСТ РАН, 2025 год).

В спектрах комплексов Van 2 Cu (см. рис. 1, Б), Van 2 Co (см. рис. 1,

В) и Van 2 Zn (см. рис. 1, Г) сохранялся тот же «профиль» полос, что подтверждает участие ванилина как лиганда.

При комплексообразовании с Cu(II) (см. рис. 1, Б) полоса v C=O сохранялась на - 1667 см ^{- 1}, но происходило заметное уменьшение интенсивности и уширение полосы v O-H фенола (область 3100-3500 см ^{- 1}), что указывало на делокализацию электронной плотности и участие феноксикислорода в координации. Появление слабых полос в области 35603700 см ^{- 1} могло быть связано с валентными колебаниями групп О-H координационно связанных или в кристаллизационных молекулах воды.

При комплексообразовании с Co(II) (см. рис. 1, В) картина была аналогична комплексу меди. Полоса v C=O фиксировалась при - 1666 см ^{- 1}. Наиболее значимое изменение — резкое снижение интенсивности широкой полосы v O-H (теперь при - 3170 см ^{- 1}), что прямо свидетельствовало о замещении водорода фенольной группы ионом металла.

В варианте с Zn(II) (см. рис. 1, Г) также наблюдалось ослабление сигнала фенольного O-H. Однако в спектре появлялась новая, достаточно интенсивная широкая полоса с максимумом - 3340 см ^{- 1}, характерная для валентных колебаний v O-H молекул воды, что, вероятно, указывает на ее включение в координационную сферу иона цинка с образованием аквакомплекса (83).

В низкочастотной области 633-552 см ^{- 1} ( - 632-589-552 см ^{- 1}) в комплексах фиксировались более выраженные полосы, которые можно отнести к колебаниям Me-O или деформациям координационного узла. В целом изменения соответствовали комплексообразованию без разрушения ароматического скелета ванилина.

Таким образом, успешность хелатирования была подтверждена данными ИК-спектроскопии. Ключевым маркером образования связи металл-лиганд во всех трех случаях стало резкое ослабление или изменение широкой полосы валентных колебаний O - H фенольной группы ванилина (область - 3100-3500 см ^{- 1}), что свидетельствовало о депротонировании гидроксильной группы и координации иона металла через фенокси-кислород. В частности, ослабление полосы v O-H фенола и появление полос в низкочастотной области 600-500 см ^{- 1} ранее также наблюдалось для комплексов ванилина с d-элементами (84, 85). Сохранение полосы карбонильной группы (C=O) в области - 1666 см ^{- 1} указывало на то, что альдегидная группа, вероятно, не участвовала в связывании или участвовала косвенно.

Наблюдаемые различия в спектрах комплексов Cu, Co и Zn, вероятно, были связаны с разной геометрией координационного полиэдра: для тетраэдрического комплекса цинка, в отличие от плоскоквадратного комплекса меди, характерно включение молекул воды в координационную сферу (86). Как показано в работе J.D. Siqueira с соавт. (87), стабильность и структура конечного продукта критически зависят от условий синтеза, что подтверждает корректность выбранных нами параметров (pH и температуры), обеспечивающих образование целевых моноядерных хелатов.

При анализе антибиотических свойств в случае с исходными солями металлов было показано, что максимальной ингибирующей активностью в отношении E. coli K12 TG1 обладал ZnCl 2 (рис. 2, А).

Наблюдаемые эффективные концентрации, подавляющие свыше 80, 50 и 20 % свечения, здесь составили соответственно 1,22х10-2; 3,05*10-3 и 3,81х10-4 мг/мл. Отношение RLU (relative luminescence units, относительные приборные единицы свечения) в конце экспозиции к аналогичному значению на 0-й мин в этом диапазоне выросло от 0,29±0,12 до 67,9±2,5 %, что свидетельствовало о выраженном дозозависимом эффекте. При этом вплоть до 8129-кратного разведения исходного раствора ZnCl2 к 180-й мин эксперимента наблюдалось фактически полное гашение свечения (гибель микробиальной культуры). Далее максимальная амплитуда снижения нормализованного относительного значения биолюминесценции регистрировалась только в течение первых 30-60 мин, после чего оно держалось примерно на одном уровне: при 6,10х10-3 мг/мл — 25,4±0,9-27,7±1,7 %; при 3,05х10-3 мг/мл — 42,7±2,5-49,3±4,3 %; при 1,53х10-3 мг/мл — 54,9±3,662,0±2,5 %; при 7,63х10-4 мг/мл — 50,9±2,3-58,6±3,2 %; при 3,81х10-4 мг/мл — 58,1±3,9-65,6±4,2 %; при 1,91х10-4 мг/мл — 61,4±3,0-68,5±2,0 %. Последнее свидетельствует в пользу бактериостатических эффектов малых доз ZnCl2.

Рис. 2. Биологическая активность солей металлов в тесте ингибирования бактериальной люминесценции в отношении Escherichia coli K12 TG1: 0 — 0 мг/мл (фон), 1 — 9,77х10 ^{- 2} мг/мл; 2 — 4,88x10 - 2 мг/мл; 3 — 2,44х10 ^{- 2} мг/мл; 4 — 1,22х10 ^{- 2} мг/мл; 5 — 6,10х10 ^{- 3} мг/мл; 6 — 3,05х10 ^{- 3} мг/мл; 7 — 1,53х10 ^{- 3} мг/мл; 8 — 7,63х10 ^{- 4} мг/мл; 9 — 3,81х10 - 4 мг/мл; 10 — 1,91х10 - ⁴ мг/мл; А — ZnCl 2 , Б — C0CI 2 , В — CuCl 2 (ФГБНУ ФНЦ БСТ РАН, 2025 год).

На втором месте по антибиотическому действию находился C0CI 2 (см. рис. 2, Б) с эффективными концентрациями, равными 9,77 *10 ^{- 2} мг/мл (EC 80 ) и 4,88*10 ^{- 2} мг/мл (EC 20 ). При 2,44*10 — 2 мг/мл ингибирующий эффект в диапазоне 20 % наблюдался только в течение первых 90 мин, после чего интенсивность свечения E. coli K12 TG1 восстанавливалась до контрольных значений.

Наконец, CuCl 2 (см. рис. 2, В) подавлял люминесценцию бактерий в диапазоне концентраций от 50 до 9,77* 10 ^{- 2} мг/мл (EC 80 ), фактически полностью теряя антибиотический эффект при последующем разведении. Так, если при 9,77*10 ^{- 2} мг/мл отношение RLU в конце экспозиции к аналогичному значению на 0-й мин составляло 1,4±0,6 %, то при 4,88*10 ^{- 2} мг/мл оно равнялось уже 83,5±2,8 %, а далее 101,7±4,2 %. Однако если судить по абсолютной разнице RLU к 180-й мин эксперимента в опытных и контрольных ячейках, то минимальные ингибирующие концентрации для описанных солей составляли 4,77*10 ^{- 5} мг/мл (ZnCl 2 ), 2,44*10 — 2 мг/мл (CuCl 2 ) и 7,63х10 ^{- 4} мг/мл (C0CI 2 ).

Бактерицидные эффекты ванилина были ожидаемо ниже, чем у солевых растворов (рис. 3).

—•- 0 —«-1 —* 2 -*—3 ---4 —*- 5 ——6 —S—7 ---8 —-9 — 10

Рис. 3 . Биологическая активность ванилина в тесте ингибирования бактериальной люминесценции в отношении Escherichia coli K12 TG1: 0 — 0 мг/мл (фон), 1 — 2,38 мг/мл; 2 — 1,19 мг/мл; 3 — 5,94*10 ^{- 1} мг/мл; 4 — 2,97*10 ^{- 1} мг/мл; 5 — 1,49*10 ^{- 1} мг/мл; 6 — 7,43*10 ^{- 2} мг/мл; 7 — 3,71*10 - ² мг/мл; 8 — 1,86*10 - ² мг/мл; 9 — 9,29*10 - ³ мг/мл; 10 — 4,64*10 - ³ мг/мл (ФГБ-НУ ФНЦ БСТ РАН, 2025 год).

Так, при концентрации 2,38 мг/мл на 180-й мин экспозиции нормализованное относительное значение биолюминесценции составляло 14,1±0,8 %; при 1,19 мг/мл — 34,4±1,1 %; при 5,94*10 ^{- 1} мг/мл — 59,2±1,7 %; при 2,97*10 ^{- 1} мг/мл — 78,9±5,3 % и, наконец, при 1,49*10 ^{- 1} мг/мл — 104,2±5,5 %. Отношение RLU в конце экспозиции к аналогичному значению на 0-й мин в этом диапазоне возросло от 26,4±1,5 до 148,2±5,9 %. Примечательно, что для ванилина, как и для хлорида цинка, был присущ бактериостатический эффект. В диапазоне указанных выше концентраций, за исключением 1,49^х 10 ^{- 1} мг/мл, нормализованное относительное значение биолюминесценции, начиная с 60-й мин, держалось в пределах от 14,1±0,8 до 20,4±1,0 %; от 29,4±1,0 до 34,4±1,1 %; от 59,2±1,7 до 66,8±1,9 % и от 78,9±5,3 до 93,5±4,1 %, соответственно. Важно также, что дозировка 7,43*10 ^{- 2} мг/мл в некоторой степени (5,8±0,4-18,5±0,8 %) стимулировала люминесценцию E. coli K12 TG1, что может быть обусловлено как эффектом гормезиса, так и пребиотическим действием малых доз ванилина. Минимальная ингибирующая концентрация по абсолютному значению RLU здесь составила 3,71*10 ^{- 2} мг/мл.

Наконец, хелатные комплексы Van2Zn, Van2Co и Van2Cu в отно- шении бактериального биосенсора продемонстрировали смешанные эффекты. Ванилин-связанное хелатирование цинка сопровождалось явным снижением токсичности исходной минеральной составляющей (рис. 4, А).

Рис. 4. Биологическая активность металлорганических комплексов в тесте ингибирования бактериальной люминесценции в отношении Escherichia coli K12 TG1: 0 — 0 мг/мл (фон), 1 — 9,77*10 - 2 мг/мл; 2 — 4,88*10 - 2 мг/мл; 3 — 2,44*10 ^{- 2} мг/мл; 4 — 1,22*10 - 2 мг/мл; 5 — 6,10*10 ^{- 3} мг/мл; 6 — 3,05*10 ^{- 3} мг/мл; 7 — 1,53*10 ^{- 3} мг/мл; 8 — 7,63*10 ^{- 4} мг/мл; 9 — 3,81*10 ^{- 4} мг/мл; 10 — 1,91*10 - 4 мг/мл; А — Van 2 Zn (металл органический, хелатный, комплекс на основе ванилина и цинка); Б — Van 2 Co (металлорганический, хелатный, комплекс на основе ванилина и кобальта); В — Van 2 Cu (металлорганический, хелатный, комплекс на основе ванилина и меди) (ФГБНУ ФНЦ БСТ РАН, 2025 год).

Так, если в случае ZnCl2 при концентрации 3,81*10-4 мг/мл 20 % ингибирование наблюдалось в течение всей экспозиции, то при внесении в питательную среду Van2Zn этот показатель достигался только к 180 мин. Нормализованное относительное значение биолюминесценции здесь постепенно снижалось от 87,5±3,4 до 79,4±4,3 %. Идентичная ситуация сохранялась и при 7,63 *10-4 мг/мл. Дальнейшее увеличение дозы Van2Zn способствовало значительному подавлению люциферазной реакции у E. coli K12 TG1. Однако если в опыте с ZnCl2 интенсивность свечения уменьшалась по мере пролонгирования эксперимента (от 79,7±3,6 на 30-й мин до 54,9±3,6 % к 120-й мин с последующим восстановлением до 58,7±2,5 %), то в случае с Van2Zn, она, напротив, прямолинейно восста- навливалась от 69,6±3,8 до 73,2±3,4 %. Наконец, введение Van2Zn в количестве 6,10х10-4 мг/мл приводило к ингибированию свечения в диапазоне 80-85 % (EC80), в то время как хлорид при аналогичной дозировке подавлял 70-75 % люминесценции. При более высоких дозах оба вещества способствовали практически полному подавлению люциферазной функции у E. coli K12 TG1. Таким образом, суммарный средний эффект за 180 мин экспозиции в случае с Van2Zn был схож с эффектом ZnCl2 с некоторыми частными различиями по динамике свечения биосенсора, значительно превосходя исходный показатель антибиотической активности чистого ванилина.

Можно предположить, что Van 2 Zn выступает в роли «депо» ионов. Если свободный Zn²⁺ атакует клетку немедленно (резкое падение свечения уже в первые минуты), то хелатная форма, вероятно, требует предварительного расщепления или захвата клеткой, что приводит к более пролонгированному, но менее острому эффекту (88). Согласно обзору O.V. Salishcheva и A.Yu. Prosekov (89), комплексообразование может сопровождаться изменением термодинамической стабильности, кинетической лабильности и липофильности, что облегчает транспорт органических лигандов к бактериальной клетке, но замедляет высвобождение иона металла. Снижение токсичности при малых дозах Van 2 Zn по сравнению с солью также может быть преимуществом, поскольку снижает риск повреждения собственных клеток эпителия кишечника.

В опыте с Van 2 Co (см. рис. 4, Б) подавление свечения E. coli K12 TG1 в диапазоне 80 %, как и в эксперименте с C0CI 2, наблюдалось вплоть до 9,77х10 ^{- 2} мг/мл, однако если во втором случае субингибиторные эффекты регистрировали и при дальнейшем разведении до 4,88х]0 ^{- 2} мг/мл и 2,44х10 ^{- 2} мг/мл, то в первом нормализованное относительное значение биолюминесценции в указанном диапазоне возрастало прямо пропорционально времени экспозиции от 98,4±3,4 до 154,4±8,8 % и от 111,8±5,4 до 130,3±4,3 %, соответственно. Стимулирующий эффект сохранялся и при концентрации Van 2 Co, равной 1,22х10 ^{- 2} мг/мл, составив от 106,8 ±3,9 до 112,7±1,8 %. При дальнейших разбавлениях выраженных отличий от контрольных значений обнаружено не было. Как сказано выше, кобальт, будучи структурным компонентом витамина B 12 , в малых дозах необходим для метаболизма микробиоты, в связи с чем можно предположить, что в составе хелата он становится более биодоступным для синтеза корринои-дов у бактерий, что и приводит к интенсификации их метаболизма и, как следствие, свечения. Это открывает перспективы использования Van 2 Co как пребиотического фактора для стимуляции полезной микрофлоры рубца, особенно целлюлозолитических бактерий (90, 91).

Наконец, наиболее существенные изменения по сравнению с влиянием исходной соли были показаны для Van 2 Cu (см. рис. 4, В). В этом случае хелатирование сопровождалось значимым ростом антибиотических свойств минерала. Так, если CuCl 2 подавлял свечение E. coli K12 TG1 только до 9,77х10 ^{- 2} мг/мл, то Van 2 Cu сохранял ингибирующее действие еще в пяти последующих двукратных разбавлениях. Эффективные концентрации здесь составили 2,44х10 ^{- 2} мг/мл (EC 80 ); 6,10х10 ^{- 3} мг/мл (EC 50 ) и 3,05х10^-3 мг/мл (EC 20 ), причем при всех дозировках интенсивность люминесценции уменьшалась прямо пропорционально пролонгированию эксперимента: от 27,2±0,7 до 2,2±0,1 % при 9,77х10 ^{- 2} мг/мл; от 32,3±2,1 до 3,9±0,2 % при 4,88х10 ^{- 2} мг/мл; от 38,9±2,5 до 7,0±0,4 % при 2,44х10 ^{- 2} мг/мл; от 53,4±1,6 до 22,1±1,1 % при 1,22х10 ^{- 2} мг/мл; от 63,0±3,7 до 42,6±1,9 % при 6,10х10 ^{- 3} мг/мл и от 74,3±2,3 до 66,9±2,8 % при

3,05x10 - 3 мг/мл. Отношение RLU в конце опыта к исходному значению на 0-й мин в представленных дозировках составило 3,3±0,5 %; 5,8±0,5 %; 10,6±0,8; 33,3±1,9; 64,2±1,7 и 100,8±3,2 %, причем в последнем случае пиковое значение RLU в контроле составило 187335,8±3425,2 ед. на 90-й мин при аналогичном показателе 78413,0±2186,3 ед. в опытной ячейке.

Наблюдаемое усиление бактерицидного эффекта в опыте с Van 2 Cu согласуется с данными D.N. Bima с соавт. (92), которые показали, что образование комплексов меди с основаниями Шиффа на основе ванилина значительно повышает биоактивность против E. coli . Авторы связывают этот эффект с наличием свободных гидроксильных групп и изменением координационной геометрии. Такое усиление (потенцирование) может объясняться также синергизмом компонентов: медь, высвобождаясь из комплекса в микросреде бактериальной клетки, оказывает токсическое действие (93), в то время как ванилин, даже в остаточных количествах, способен нарушать процессы «чувства кворума» (quorum sensing) и повышать проницаемость клеточных стенок, облегчая доступ ионов металла внутрь клетки (94).

Иными словами, тест-система на основе рекомбинантного E. coli позволила тонко дифференцировать изменения токсичности при переходе от неорганических солей к хелатным формам. Было подтверждено, что исходные соли обладают ожидаемым антимикробным действием, механизм которого, вероятно, связан с нарушением ферментативных процессов (Zn²⁺) (95), окислительным стрессом (Cu²⁺) (96, 97) или конкурентным ингибированием (Co²⁺) (98). Минимальные ингибирующие концентрации по абсолютному значению RLU для исследуемых комплексов составили 9,54x10 ^{- 5} мг/мл (Van 2 Cu), 3,81x10 ^{- 4} мг/мл (Van 2 Co) и 4,77x10 ^{- 5} мг/мл (Van 2 Zn).

Следует отметить, что антибиотические свойства металлокомплек-сов на основе ванилина были зарегистрированы и в других исследованиях против таких патогенов, как Staphylococcus aureus , Pseudomonas aeruginosa , Escherichia coli , Salmonella paratyphi , Salmonella typhi , Vibrio parahaemolyticus , Shigella dysenteriae и Shigella boydii (99-102), причем суммарный эффект комплексов был, как правило, выше чем у исходных компонентов. Целлюлозная ткань, обработанная металлокомплексами ванилина с медью и цинком, также продемонстрировала превосходные антимикробные свойства (103).

Различные паттерны действия изученных комплексов хорошо вписываются в концепцию множественных механизмов металл-депривации, предложенную J.R. Paterson с соавт. (104), где разные хелаторы вызывают специфические изменения в клеточном пуле металлов — от преимущественного связывания цинка до комплексного воздействия на марганец и железо. При этом авторы подчеркивают, что антибактериальный эффект напрямую не коррелирует с абсолютными значениями аффинности хелаторов к металлам в растворе, а определяется относительным сродством. Таким образом, хелатирование позволяет модулировать антимикробные свойства исходных компонентов в широких пределах — от потенцирования (медь) до пролонгирования (цинк) и появления стимулирующих эффектов (кобальт).

Внесение синтезированных металлокомплексов в реакционную среду искусственного рубца в субингибиторных дозах (EC20) по абсолютному значению люминесценции E. coli K12 TG1 сопровождалось повышением переваримости сухого вещества корма базового рациона, что свидетельствует о реорганизации руминальной микробиоты (рис. 5). Так, Van2Zn в количестве 4,77x10-5 мг/мл способствовал росту коэффициента переваримости на 7,96 % относительно контроля (р = 0,012), а Van2Co в количестве 3,81x10-4 мг/мл — на 4,50 % (р = 0,012).

Тенденция к интенсификации переваримости наблюдалась и в опыте с Van 2 Cu (9,54x10 ^{- 5} мг/мл), однако регистрируемые здесь различия в +1,59 % не были достоверными. При этом ранее было показано, что чистый ванилин в концентрации 3,71x10 ^{- 2} мг/мл способствовал росту коэффициента переваримости лишь на 1,25 % (105).

Рис. 5. Динамика переваримости сухого вещества базового рациона в искусственном рубце (24 ч) при внесении в реакционную среду синтезированных металлокомплексов: Van 2 Zn — металлор-ганический (хелатный) комплекс на основе ванилина и цинка; Van 2 Co — металлорганиче-ский (хелатный) комплекс на основе ванилина и кобальта; Van 2 Cu — металлорганический (хелатный) комплекс на основе ванилина и меди ( n = 5, M ±SEM; ФГБНУ ФНЦ БСТ РАН, 2025 год).

Иными словами, ключевым результатом нашей работы стало подтверждение гипотезы о том, что субингибиторные дозы металлокомплексов способны модифицировать микробиоту рубца, увеличивая переваримость сухого вещества.

Этот эффект можно объяснить несколькими факторами. Во-первых, непосредственной ролью микроэлементов в пищеварительных процессах. Так, цинк прямо (в качестве кофактора) или опосредованно (через различные метаболические циклы) повышает активность многих микробных ферментов, включая некоторые протеазы, пептидазы, амилазы и целлюлазы. Исследования in vitro с добавлением метионина цинка в реакционную среду искусственного рубца показали повышение активности карбоксиме-тилцеллюлазы, амилазы и протеазы (увеличивалась переваримость соответственно сырой клетчатки, сырого протеина, органического и сухого вещества корма) (106). В свою очередь, кобальт способен воздействовать на пищеварительные процессы лишь косвенно, через витамин B 12 , посредством общей стимуляции жизнедеятельности микробиоты (59, 107). Тем не менее добавки нанокобальта in vitro способствовали достоверному повышению численности в рубцовой жидкости таких целлюлозолитических бактерий, как Cellulomonas cellulasea , Acetobacter xylinum , Thermonospora fusca , Ruminococcus albus , Bacillus sp., Clostridium cellulovorans и Selenomonas ruminantium , соответственно, увеличивалась переваримость сухого вещества, гемицеллюлоз и целлюлозы (90). Наконец, в противоположность цинку и кобальту, добавки меди либо не влияли на переваримость сухого вещества корма, либо даже несколько снижали ее (108, 109).

Во-вторых, будучи доставленными в хелатной форме, цинк, кобальт и медь, вероятно, медленнее высвобождаются, создавая оптимальную микроэлементарную «подкормку» для микробиоты (особенно это касается цинка и целлюлозолитических бактерий) без токсического шока.

Преимущество хелатных форм микроэлементов перед неорганическими солями в контексте рубцового пищеварения подтверждено недавним исследованием на овцах (29). Авторы показали, что хелатные комплексы характеризуются низкой растворимостью при pH рубца (6,75-11,81 %) и высокой — при pH сычуга (до 80,47 %), что обеспечивает защиту микроэлементов от антагонистических факторов в рубце и повышает переваримость нейтрально-детергентной клетчатки на ранних сроках инкубации.

В-третьих, нельзя исключать и регуляторную роль ванилина. Например, установлено, что ванилин может увеличивать численность ключевых протеин- и целлюлозоразлагающих бактерий. Так, в работе A.K. Patra с соавт. (34) образование метана, коэффициент переваримости кормового субстрата и концентрация аммиака линейно снижались с увеличением дозы ванилина. Концентрация общих летучих жирных кислот также снижалась, тогда как доля бутирата имела тенденцию к линейному увеличению с повышением дозы ванилина. Численность простейших снизилась, но численность Ruminococcus flavefaciens , Prevotella bryantii , Butyrivibrio fibrisolvens , Prevotella ruminicola , Clostridium aminophilum и Ruminobacter amylophilus , напротив, увеличилась прямопропорционально дозе ванилина (34). Л.В. Власенко с соавт. (105) также продемонстрировали, что добавление ванилина (2,45 х 10 ^{- 4} моль/л) увеличивает число представителей филума Bacillota и родов Butyri-vibrio и Pseudobutyrivibrio (ключевые целлюлозолитические бактерии) при снижении доли Bacteroidota и Pseudomonadota . Известно также, что ванилин подавляет образование аммиака в рубце.

Таким образом, хелатные комплексы могут селективно воздействовать на различных представителей рубцовой микробиоты жвачных, тем самым направленно модифицируя пищеварительные процессы. При этом недостоверное повышение переваримости при внесении Van 2 Cu, несмотря на его высокую антибактериальную активность in vitro, вероятно, связано с тем, что в сложной полимикробной среде рубца медь проявила себя как менее селективный агент, что требует дальнейшего разъяснения и подбора оптимальной дозы в дополнительных исследованиях.

Итак, в настоящем исследовании впервые были синтезированы и охарактеризованы хелатные комплексы ванилина с Zn, Co и Cu, при этом установлено, что координация металлов через фенокси-кислород ванилина сопровождается модуляцией антимикробной активности в широком диапазоне: Van 2 Cu потенцирует бактерицидный эффект (снижение МИК на три порядка), Van 2 Zn обеспечивает пролонгированное бактериостатическое действие, а Van 2 Co в субтоксических дозах стимулирует метаболическую активность Escherichia coli (рост биолюминесценции до 154,4 %). Эти данные демонстрируют, что хелатирование позволяет не просто суммировать, но качественно изменять биологические свойства исходных компонентов, что подтверждает концепцию множественных механизмов металл-депривации и открывает возможности для направленного конструирования добавок с заданным типом активности. Ключевым прикладным результатом стало доказательство того, что сверхмалые дозы Van 2 Zn (4,77х10 ^{- 5} мг/мл) и Van 2 Co (3,81х10 ^{- 4} мг/мл) достоверно повышали переваримость сухого вещества корма в системе искусственного рубца на 7,96 % и 4,50 % соответственно, тогда как Van 2 Cu значимого эффекта не показал. Это свидетельствует о селективной стимуляции целлюлозолитической микробиоты благодаря медленному высвобождению ионов из хелатной формы и отсутствию токсического шока. Комплексы Van 2 Zn и Van 2 Co могут рассматриваться как многофункциональные кормовые добавки но-

âîãî ïîêîëåíèÿ, ñî÷åòàþùèå àíòèìèêðîáíîå äåéñòâèå ñ óëó÷øåíèåì ïè-ùåâàðåíèÿ, ÷òî äåëàåò èõ ïåðñïåêòèâíîé àëüòåðíàòèâîé êîðìîâûì àíòè-áèîòèêàì. Îäíàêî â êà÷åñòâå îãðàíè÷åíèé ïðåäñòàâëåííîãî èññëåäîâàíèÿ ñëåäóåò îòìåòèòü îòñóòñòâèå äàííûõ ïî âëèÿíèþ èçó÷àåìûõ êîìïëåêñîâ íà ñòðóêòóðó è ìåòàáîëè÷åñêèå ïóòè ìèêðîáèîòû, à òàêæå êèíåòèêó ýëåìåíò-íîãî ïðîôèëÿ â ðóáöå, ÷òî ìîæåò ñòàòü öåëüþ äàëüíåéøèõ èçûñêàíèé ñîâìåñòíî ñ îöåíêîé ïðîäóêòèâíîñòè æèâîòíûõ è êà÷åñòâà æèâîòíîâîä÷å-ñêîé ïðîäóêöèè.

ФГБНУ Федеральный научный центр биологических си-     Поступила в редакцию стем и агротехнологий РАН,                            10 марта 2026 года

460000 Ðîññèÿ, ã. Îðåíáóðã, óë. 9 ßíâàðÿ, 29,                             Ïðèíÿòà ê ïóáëèêàöèè

Sel’skokhozyaistvennaya biologiya [ Agricultural Biology ], 2026, V. 61, № 4, pp. 719-743

CHELATE COMPLEXES BASED ON SMALL MOLECULES OF PLANT ORIGIN AS AN ANALOGUE TO ANTIBIOTIC DRUGS

D.E. Shoshin ^И , K.N. Atlanderova, B.K. Elemesov, G.K. Duskaev

The authors declare no conflict of interests

Acknowledgements:

The study was supported by the Russian Science Foundation ¹ 22-76-10008-P Ï.