Хиральные соединения в уролитах

Придавая большое значение асимметрии живого вещества, Л. Пастер считал ее именно той единственной разграничивающей линией, которую можно провести между живой и неживой природой, то есть тем, что отличает живое вещество от неживого. Высказанное предположение является актуальным в настоящее время при решении проблем биоминеральных взаимодействий, происхождения предбиологических молекул и для понимания процессов старения на молекулярном уровне. Биомакромолекулы (аминокислоты, сахара, нуклеиновые кислоты и фосфолипиды) обладают хиральностью, то есть зеркально-антиподобным свойством.

Считалось, что все живые организмы содержат и используют в своей жизнедеятельности только L-аминокислоты, а наличие и функции D-аминокислот долгое время оставались неустановленными. Последние исследования показали, что D-аминокислоты широко распространены в тканях живых организмов, в том чи- 38

сле и человека. Было установлено, что D-аспарагиновая кислота, в частности, обнаружена в хрусталике, головном мозге, костях, эритроцитах, зубах и в других органах и системах. Определены специфические функции D-форм отдельных аминокислот в здоровом организме [4, 5].

Известно, что количественное соотношение L- и D-энантиомеров изменяется в процессе жизнедеятельности организма. D-аминокислоты поступают в организм млекопитающих с пищей, образуются при метаболизме кишечной флоры, а также в результате спонтанной рацемизации аминокислот при биосинтезе и старении. При старении происходит рацемизация L-аминокислот с переходом их в D-форму в белках, причем в наибольшей степени подвержена этому процессу аспарагиновая кислота. Считается, что скорость рацемизации аминокислот в пептидах значительно выше, чем свободных аминокислот. Согласно В. А. Твердислову и его соавторам (2007), процессы рацемизации, в частности аспарагиновой кислоты, проходят без участия фер- ментов. Единичная замена аминокислотных остатков на их D-изомеры может приводить как к полной потере функциональности белков, так и к снижению активности ферментов. В обзорной работе [5] показано, что при некоторых психосоматических заболеваниях (шизофрения, болезнь Альцгеймера и Паркинсона), наблюдаются значительные изменения уровня некоторых D-аминокислот — D-Ser, D-Ala, D-Asp — в плазме крови, сером и белом веществе головного мозга и спинномозговой жидкости. Найдена положительная корреляция между концентрацией D-аминокислот и маркерами почечных заболеваний.

Влияние процессов рацемизации аминокислот в организме человека при уролитиазе на уровень концентрации D-форм в уролитах остается неизученным.

Целью данной работы является проведение сравнительного анализа концентраций D-аминокислот в уролитах, формирующихся в организме человека, и выявление зависимости соотношения D- и L-энантиомеров от возраста человека и минеральных фаз в составе патогенных биоминеральных образований.

Фактический материал и методы исследований

Изучено 19 проб уролитов (см. таблицу), минеральный состав которых определен методами рентгеновской дифрактометрии и ИК-спектроскопии. Идентифицированы следующие минеральные фазы: уэ-веллит (СаС2О4 • Н2О), уэдделлит (СаС2О4 • 2Н2О), струвит (MgNH4PO4 • 6H2O), ньюбериит (MgHPO4 • 3H2O), мочевая кислота (C5H4N4O3), карбонатсодержащий апатит-(СаОН) [1]. Возраст людей с уролитиазом составлял 22—75 лет.

Анализировались L- и D-изомеры 13 аминокислот: аланина (Ala), валина (Val), изолейцина (Ile), лейцина (Leu), аспарагиновой кислоты (Asp), глутаминовой кислоты (Glu), треонина (Thr), серина (Ser), фенилаланина (Phe), тирозина (Tyr), пролина (Pro), лизина (Lys) и метионина (Met).

Для извлечения аминокислот из белковой составляющей применяли кислотный гидролиз в 6М HCl при 105 °С в течение 12 часов. Выделенные из гидролизата аминокислоты очищали от примесей и переводили в N-пентафторпропионовые изопропиловые эфиры соответствующих аминокислот. Идентификация и определение содержания аминокислот в образцах выполнены на газовом хроматографе GC-17A (Shimadzu, капиллярная колонка Chirasil-L-Val). Подробно методика описана в статье [3].

Результаты и обсуждение исследований

Содержание и распределение аминокислот в изученных уролитах подробно описаны в работе [1]. Анализ белковой составляющей уролитов позволил выделить отдельные аминокислоты, доминирование которых специфично для конкретного типа уролитов: в оксалатных наблюдаются относительно высокие концентрации аланина и пролина, в фосфатных — лизина, а в уратных — глицина и тирозина.

В результате проведенных исследований D-формы были выявлены только для трех аминокислот: аланина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты.

Установлено, что для оксалатсодержащих образцов (уэвеллита и уэдделлита) характерен высокий по казатель D/L для Asp, тогда как D-Glu и D-Ala, часто являющиеся маркерами жизнедеятельности микроорганизмов, установлены только в некоторых образцах и имеют низкие содержания (см. таблицу). В литературе имеются данные показателей соотношений D/L-Asp в эмали в зависимости от возраста коренных зубов [9], а также в дентине с учетом фактического возраста человека [8, 11]. Поскольку уролиты не относятся к долгоживущим образованиям in vivo, в отличие от зубов и костей, это наводит на мысль о влиянии оксалат-ионов (щавелевой кислоты) на ускорение процесса рацемизации аспарагиновой кислоты в патогенных биоминеральных образованиях.

В фосфатных уролитах значение D/L-Asp меняется от 0.010 до 0.099. Выявлено, что повышенные концентрации D-Asp характерны для фосфатных уролитов, в составе которых наряду с апатитом содержится уэвел-лит. Биоминеральные образования, состоящие только из апатита или струвита, имеют пониженный уровень D-Asp.

Кроме того, в струвитсодержащих образцах зафиксированы высокие показатели отношений D/L-Glu (0.095—0.106). Формирование фосфатных уролитов издавна связывали с проникновением бактериальной инфекции в мочевыводящие органы. Пептидогликаны, входящие в состав клеточной стенки бактерий, можно рассматривать как один из источников связанных D-Glu и D-Ala [6]. В связи с этим присутствие их в белковой составляющей может свидетельствовать об участии микроорганизмов в генезисе фосфатных биоминералов (струвита, апатита).

В мочекислых уролитах отношения D/L-Asp меняются от 0 до 0.089 (см. таблицу). При этом в уролитах, содержащих только мочевую кислоту, концентрация D-Asp значительно ниже, чем в образцах, содержащих примеси солей щавелевой кислоты (уэвеллита и уэдделлита). На основе полученных данных можно предположить, что на содержание L-Asp в белковой составляющей оказывает влияние присутствие оксалат-ионов в патогенных твердых образованиях. В данном типе уролитов не обнаружены D-Glu и D-Ala. Результаты исследований наводят на мысль о генетической специфике кристаллических образований органического состава изученных уролитов, формирование которых часто связано с метаболическими нарушениями в организме человека.

Источником D-аминокислот в уролитах, на наш взгляд, могут быть урина, компоненты микробиальной клеточной стенки с цитоплазмой и протеом уролитов, представляющий многообразный спектр белков. Как связанные с пептидами, так и свободные D-аминокислоты, в частности D-Asp, D-Ser и D-Ala, в избытке содержатся в моче и сыворотке крови [6]. D-Asp найден во фрагментах коллагена типа I в моче пожилых людей. У трех здоровых добровольцев в 24-часовых пробах урины наибольшие количества были определены для D-Ser (64—199 моль/день) и D-Ala (24—138 моль/день). В среднем от 0.4 до 1.1 г свободных аминокислот ежедневно выделяется с мочой здорового взрослого человека [6]. На экскрецию D-стереоизомеров в физиологических жидкостях влияет возраст, рацион питания, физиологическое состояние и антибиотикотерапия [10].

Ранее при исследовании количественного содержания L- и D-форм аспарагиновой кислоты в эма- 39

Соотношение D/L энантиомеров аминокислот в белковой составляющей уролитов, сформированных в организме человека

D/L ratio of enantiomers of amino acids in the protein component of uroliths, formed in the human body

Уролиты Uroliths	№ образца Sample No.	Биоминералы Biominerals	Возраст индивида, г Age of individual	D/L Asp	D/L Glu	D/L Ala
Оксалатные Oxalate	19 к	уэвеллит \ whewellite	?	0.053	0	0
	58	уэдделлит \ whedellite	22	0.03	0	0.014
	59	уэвеллит, уэдделлит whewellite, whedellite	70	0.081	-//-	-//-
	79	уэвеллит whewellite	60	0.085	-//-	0.032
	87	-//-	69	0.152	0.037	0.038
Фосфатные Phosphate	46	апатит, уэвеллит apatite, whewellite	45	0.099	0.059	0.025
	48	-//-	50	0.074	0.034	0.01
	51	апатит, уэвеллит, струвит apatite, whewellite, struvite	56	0.082	0.095	0.032
	52	апатит,	53	0.039	0.024	0.031
	53	струвит apatite, struvite	42	0.051	0.106	0.002
	69	-//-	24	0.01	0	0.012
	35	струвит, уэвеллит struvite, whewellite	35	0.061	0.124	0
	47	ньюбериит \ newberyite	?	0.042	0.022	0.002
Мочекислые Urate	29 к	мочевая кислота \ uric acid	?	0.056	0	0
	45	-//-	75	0	-//-	-//-
	54	-//-	56	0.039	-//-	-//-
	61	мочевая кислота, уэвеллит uric acid, whewellite	53	0.089	-//-	-//-
	72	мочевая кислота uric acid	55	0.046	-//-	-//-
	77	-//-	64	0	-//-	-//-

Примечание: ? — нет данных возраста Note: ? — no data on age ли была установлена положительная корреляция между коэффициентом рацемизации и возрастом человека [8, 9,10]. Исследования показали, что D-аспарагиновая кислота в эмали после 60 лет может составлять до 8 % всей аспарагиновой кислоты. В настоящее время анализ содержания D-аспарагиновой кислоты в долгоживущих тканях (зубы, кости) считается надежным методом оценки возраста человека в развитых странах [7, 8, 11].

В нашем случае отсутствие представительной выборки камнеобразователей не позволяет достоверно говорить о влиянии возраста на степень рацемизации аспарагиновой кислоты в мочевых камнях. Однако следует отметить, что в изученных уролитах самые низкие отношения D/L-аспарагиновой кислоты также установлены у людей, чей возраст составляет 22 и 24 года.

Выводы

Таким образом, показано, что концентрация D-энантиомеров в составе органической составляющей в патогенных биоминералах зависит от состава минеральной фазы. В оксалатсодержащих уролитах отмечены значительные изменения баланса L- и D-формы Asp. Уровень аспарагиновой кислоты повышен в фосфатных и мочекислых уролитах в присутствии оксалат-ионов, и напротив, пониженные концентрации D-Asp 40

наблюдаются в тех случаях, когда они имеют мономи-неральный состав. Полагаем, что ионы щавелевой кислоты оказывают влияние на степень рацемизации аспарагиновой кислоты в патогенных биоминеральных образованиях. Содержание D-изомеров в уролитах обусловлено частичной рацемизацией L-аминокислот на одноименные D-аминокислоты деятельностью микроорганизмов и составом органической составляющей урины.

Исследования выполнены при частичной финансовой поддержке проекта УрО РАН № 18-5-5-44 «Процессы и механизмы минералообразования, надмолекулярной организации минерального вещества, комплексной переработки минерального сырья и формирования наноструктури-рованных материалов».

Аналитические исследования выполнялись в ЦКП «Геонаука».