Хорионический гонадотропин как регулятор фенотипического созревания интактных и интерлейкин- 2-активированных NK- и NKT-клеток

Объяснение причин толерантности иммунной системы матери к генетически чужеродному плоду является актуальной проблемой репродуктивной иммунологии, в рамках которой важнейшим направлением является анализ роли гормонов в регуляции иммунитета. Хорионический гонадотропин (ХГ) является ключевым гормоном с позиций сохранения и нормального развития беременности, одновременно обладая выраженным иммуномодулирующим действием (Ширшев, 2002).

В последнее время большое внимание уделяется исследованию функций клеток врожденного иммунитета, среди которых важную роль играют NK- и NKT- клетки.

NK-клетки – это клетки врожденной защиты, которые без предварительной иммунизации или активации могут распознавать и убивать аббе-рантные клетки-мишени и быстро продуцировать хемокины и цитокины, оказывающие защитные эффекты. Все NK-клетки крови делятся на две субпопуляции по уровням экспрессии молекул CD56 и CD16. Приблизительно 90% NK-клеток периферической крови экспрессируют низкие уровни CD56 (dim) и одновременно являются позитивными для CD16 (CD56^dimCD16⁺). CD16, в свою очередь, представляет собой низкоаффинный рецептор для Fc-фрагмента IgG1 и IgG3 (Fc γ RIII) и участвует в обеспечении реакции антителозависимой клеточной цитотоксичности. Оставшиеся 10% NK-клеток экспрессируют высокие уровни

CD56 (bright) и не экспрессируют СD16 (CD56brigthCD16-) (Trundley, Moffet, 2004). Эти субпопуляции различаются функционально: так, CD56dim NK-клетки обладают выраженной цитотоксичностью и имеют много цитолитических гранул, а CD56brigth-клетки представляют собой раннюю стадию дифференцировки CD56dim и являются основными цитокинпродуцирующими NK-клетками (Cooper et al., 2001). Кроме того, именно NK-клетки принимают активное участие в деструкции неоплазм и аллотрансплантантов. Во время беременности и сразу после родов активность NK-клеток периферической крови существенно снижена (Baley, Schacter, 1985).

Натуральные киллерные Т-клетки (NKT) являются отдельной субпопуляцией Т-лимофцитов. Реализуя функции, свойственные NK-клеткам, они одновременно являются мощными продуцентами цитокинов (Collucci et al., 2003). При распознавании антигена молекулами TCR NKT-клетки продуцируют большое количество цитокинов, особенно интерлейкин-4 (ИЛ-4) и гамма-интерферон (IFN- γ ). Благодаря этим свойствам NKT-клетки принимают участие в отторжении опухоли, предупреждении аутоиммунных реакций, защите от паразитарных или бактериальных инфекций, а также в изменении профилей цитокинов Т-клеток в ответ на растворимые белковые антигены (Ширшев, 2009). NKT клетки способны распознавать антигены в комплексе с CD1d или молекулой главного

комплекса гистосовместимости класса G (HLA-G), представленными на клетках плаценты, что может привести к аборту, а при повышении процента CD3+CD16+ клеток в I триместре беременности увеличивается риск развития гестоза (Борзова и др., 2005). Очевидно поэтому во время физиологически протекающей беременности функции NK/NKT клеток периферического пула супресси-рованы (Mahmoud et al., 2004; Clark et al., 2008).

В то же время, интерлейкин-2 (ИЛ-2) относится к ключевым цитокинам, инициирующим развитие специфического иммунного ответа. Хорошо известно, что ИЛ-2 усиливает цитотоксичность Т- и NK-клеток в отношении NK-чувствительных и NK-резистентных линий клеток-мишеней, и также опухолей и инфицированных вирусом клеток (Ширшев, 2009). Стимулированные ИЛ-2 NK-клетки трансформируются в лимфокинактивиро-ванные клетки (ЛАК-клетки), цитотоксические в отношении трофобластов (King, Loke, 1990). Известно, что в период беременности синцитиотро-фобласт, экспрессирующий ген ИЛ-2, секретирует данный цитокин в маточно-плацентарный компар-тмент (Boehm et al., 1989). Таким образом, в гемохориальной области клетки одновременно контактируют с ХГ и ИЛ-2, направленность эффектов которых может быть прямо противоположна.

Учитывая важную роль NK- и NKТ-клеток при беременности как эффекторов неспецифической резистентности организма, целью работы являлась оценка фенотипического созревания этих клеток под воздействием ХГ, а также в условиях стимуляции клеток ИЛ-2.

Материалы и методы

В работе использовали суспензию мононукле-арных лейкоцитов периферической крови здоровых небеременных женщин в фолликулярной фазе менструального цикла. Мононуклеарные клетки получали центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина (1,077 г/см³) (Petrof et al., 1980). Полученную суспензию (1х10⁶ мл) после двойной отмывки раствором Хэнкса инкубировали в полной питательной среде (среда 199 с добавлением 10 mM HEPES; 2 mM L -глутамина; 100 мкг/мл гентамицина и 10% ЭТС) с гормоном в течение суток при 37⁰С в условиях 5% СО 2 .

ХГ в культуры вносили в дозах, соответствующим I и III триместру беременности (100 МЕ/мл и 10 МЕ/мл, соответственно). Рекомбинантный ИЛ-2 (“Sigma”, США) использовали в физиологической дозе 100 МЕ/мл, соответствующей его уровню при формировании иммунного ответа (Kurosaka et al., 2003) .

После инкубации с гормоном супернатанты собирали, а клетки отмывали фосфатно-солевым буфером (0.01 М фосфат натрия, 0.145 М хлорид натрия, рН 7.2) и оценивали фенотип лимфоцитов методом проточной цитометрии. Жизнеспособность клеток после суточной инкубации с гормоном, определяемая в тесте с эозином, составляла 95–98%.

Клетки окрашивали моноклональными антителами к соответствующим поверхностным антигенам согласно методике производителя (Beckman, Coulter, США). Оценивали экспрессию пар мембранных молекул с использованием двухпараметрических реагентов, меченных контрастными по цвету флуорохромами: флюоресцеинизотиоциона-том (FITC) и фикоэритрином (PE). Результаты учитывались на проточном цитофлюориметре EPICS XL (Beckman Coulter, США). Лимфоцитарное окно (гейт) выставляли на основе комбинации прямого и бокового светорассеивания и размера клеток. При учете результатов подсчитывали не менее 10000 клеток. Для контроля неспецифического связывания и выделения негативного по флюоресценции лимфоцитарного окна использовали соответствующие изотипические контроли.

Определяли содержание NK-клеток с фенотипом CD3^-CD16⁺CD56⁺ (CD3-FITC/CD16,56-PE) и NKT-клеток с фенотипом CD3⁺CD16⁺CD56⁺ (CD3-FITC/CD16,56-PE), согласно стандартным процедурам окрашивания поверхностных маркеров. Статистическая обработка данных проводилась с помощью парного t -критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Установлено, что ХГ в дозах, соответствующих I и III триместру беременности, повышает количество CD3-CD16+56+NK-клеток (табл. 1). Как было сказано выше, субпопуляция NK-клеток периферической крови представлена CD16+CD56+ (CD16+CD56dim) и CD16-CD56+ (CD16-CD56bright) NK-клетками, причем NK-клетки с фенотипом CD16+56+ обладают наибольшей цитолитической активностью (Mittag et al., 2005). Таким образом, эффекты гормона направлены на изменение экспрессии молекулы CD16 на CD56+ NK-клетках, что ассоциировано с регуляцией их цитотоксического потенциала.

Установлено, что ИЛ-2 оказывал достоверный стимулирующий эффект на количество NK-клеток, более чем в два раза повышая их количество. Известно, что стимулированные ИЛ-2 NK-клетки трансформируются в ЛАК-клетки, цитотоксические в отношении трофобластов (King, Loke, 1990). Гормон при совместном внесении с ИЛ-2 сохранял свое стимулирующее действие в отношении NK-клеток. Однако, стимулирующий эффект высокой дозы ХГ совместно с ИЛ-2 был ниже, чем самостоятельный эффект ИЛ-2 (табл. 1).

Таким образом, ХГ оказывает стимулирующий эффект на фенотипическое созревание NK-клеток, но в высокой дозе отменяет ЛАК-трансформирую-щее действие ИЛ-2. Важно отметить, что снижение уровня ЛАК-клеток способствует успешному развитию беременности и, по-видимому, является еще одним механизмом, при помощи которого ХГ реа- лизует свои множественные регуляторные и фето-протекторные эффекты. В то же время, повышение содержания NK-клеток под действием ХГ, вероятно, связано как с необходимостью увеличения пула CD16+CD56+ NK-клеток периферической крови в связи с последующей их миграцией в децидуальную оболочку, так и направлено на защиту матери и эмбриона от микробной атаки и малигнизации клеток трофобласта.

Таблица 1

Влияние ХГ и ХГ совместно с ИЛ-2 на уровень NK-клеток CD3-CD16+CD56+

Исследуемый показатель	n	NK-клетки CD3-CD16+CD56+
Контроль	5	7.86 ± 1.04
ХГ (10 МЕ/мл)	5	13.24 ± 1.29 p =0.0005*
ХГ (100 МЕ/мл)	5	13.11 ± 1.26 p =0.0055*
ИЛ-2 (100 МЕ/мл)	5	18.30 ± 2.91 p =0.005*
ХГ (10 МЕ/мл) + ИЛ-2 (100 МЕ/мл)	5	16.45 ± 1.57 p =0.0006*
ХГ (100 МЕ/мл) + ИЛ-2 (100 МЕ/мл)	5	11.85 ± 1.69 p =0.01* p =0.012^

Здесь и в табл. 2 *достоверные (p<0,05) отличия по t -критерию Стьюдента с контролем; ^в сравнение с ИЛ-2; #в сравнении с ХГ.

Показано, что ХГ независимо от дозы увеличивает процент CD16+CD56+NKT-клеток. ИЛ-2 не оказывал самостоятельного эффекта в отношении этих клеток. Гормон при совместном внесении с ИЛ-2 сохранял свое стимулирующее действие в отношении NKT-клеток (табл. 2).

Таблица 1

Влияние ХГ и ХГ совместно с ИЛ-2 на уровень NKT-клеток CD3+CD16+CD56+

Исследуемый показатель	n	NKТ-клетки CD3+CD16+CD56+
Контроль	5	1.38 ± 0.27
ХГ (10 МЕ/мл)	5	3.33 ± 0.786 p =0.003*
ХГ (100 МЕ/мл)	5	4.18 ± 0.73 p =0.007*
ИЛ-2 (100 МЕ/мл)	5	1.73 ± 0.27
ХГ (10 МЕ/мл) + ИЛ-2 (100 МЕ/мл)	5	5.59 ± 0.616 p =0.001* p =0.0005^ p =0.005#
ХГ (100 МЕ/мл) + ИЛ-2 (100 МЕ/мл)	5	5.61 ± 1.52 p =0.002* p =0.009^

Важно отметить, что в случае совместного стимулирующего эффекта низкой дозы ХГ (10 МЕ/мл) и ИЛ-2, эти агенты выступают как костимуляторы. Таким образом, присутствие ИЛ-2 не изменяет на- правленность стимулирующего эффекта ХГ, а в случае низкой дозы ХГ усиливает его эффект.

Известно, что формирование фенотипа CD16+CD56+NKT-клеток является терминальной стадией активации NKT-клеток и связано с максимальной цитотоксической активностью (Ou et al., 2002). Таким образом, гормон выступает индуктором фенотипического созревания NKT-клеток. Кроме того, NKT-клетки составляют субпопуляцию регуляторных Т-лимфоцитов, которые наряду с дендритными клетками играют ведущую роль в Тh1/Th2 девиации и формировании периферической толерантности (Boyson et al., 2002). Известно, что NKT-клетки периферической крови имеют большое значение в период имплантации, индуцируя цитокиновое окружение Th2-типа (Boyson et al., 2002). Таким образом, выявленные эффекты ХГ в отношении CD16+CD56+ NKT-клеток являются одним из возможных механизмов участия гормона в поддержании баланса цитокинов и периферической толерантности при беременности.

В целом, полученные данные свидетельствуют о том, что ХГ способствует фенотипическому созреванию NK- и NKT-клеток, ассоциированному с усилением их цитотоксической активности. В условиях активации NKT-клеток ИЛ-2 стимулирующий эффект ХГ сохранялся. В то же время, ХГ, оказывая стимулирующий эффект на фенотипическое созревание NK-клеток, в высокой дозе отменяет NK-активирующее действие ИЛ-2.

Работа поддержана программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и молодежным научным грантом Уральского отделения РАН.