Хроматографическое исследование фенольных соединений в лекарственных растениях Alchemilla subcrenata Buser и Veronica chamaedrys L
Автор: Живетев М.А., Дударева Л.В., Грашкова И.А., Войников В.К.
Журнал: Журнал стресс-физиологии и биохимии @jspb
Статья в выпуске: 1 т.12, 2016 года.
Бесплатный доступ
Объектами исследования были листья и соцветия субкренаты Альхемилла и вероника-чамаэдри, растущие на левом берегу в 700 м от края Байкала. Найдены некоторые небольшие различия в количестве и качестве фенольных соединений в листьях одного вида, даже выбранных за один раз. В то же время различия в количестве и качестве фенольных соединений в разное время суток были еще более выраженными. В соцветиях субкренаты Альхемилла динамика флавоноидов характеризуется более устойчивым составом, чем в листьях. Для тканей и органов Veronica было обнаружено более разнообразное сезонное коктейль фенольных соединений, чем в подкринале Alchemilla. Ожидайте, что разнообразие солей фенола в соцветиях сезонного коктейля Вероники было выше, чем в листьях.
Короткий адрес: https://sciup.org/14323984
IDR: 14323984
Текст научной статьи Хроматографическое исследование фенольных соединений в лекарственных растениях Alchemilla subcrenata Buser и Veronica chamaedrys L
Растения подвергаются значительному воздействию условий окружающей среды, и в первую очередь температуры, изменяющейся не только в течение года, но и в течение суток. На территории Сибири такие перепады особенно выражены и достигают вне зависимости от времени года 15-20 ºС в сутки, что не может не влиять на вторичный метаболизм растений. Из вторичных метаболитов растений наиболее значимыми являются фенольные соединения и, в частности, флавоноиды, роль которых как показателя устойчивости растений только возрастает (Pell, 1984).
Необходимость изучения лекарственных растений в Прибайкалье возрастает с учетом серьезных изменений в содержании биологически активных веществ в зависимости от района произрастания (Shaldaeva, 2009). Суточная и сезонная динамика лекарственных компонентов важна для научного обоснования оптимальных сроков и времени сбора растительного сырья применительно к конкретному региону.
В связи с этим, целью наших исследований было изучить изменения качественного состава флавоноидов и других фенольных соединений в листьях и соцветиях двух видов лекарственных растений: манжетки городковатой Alchemilla subcrenata Buser и вероники дубравной Veronica chamaedrys L. в условиях суточных перепадов температур атмосферного воздуха летом и ранней осенью.
MATERIALS AND METHODS
Пробы отбирались в 8-900, 14-1500 и 20-2100 25 июня, 15 августа и 19 сентября 2013 г. и 16 июня 2014 г. Для уменьшения влияния разрушающего солнечного света на фенольные соединения в листьях растений пробы отбирались в пасмурные дни, сопровождаемые более мягкими перепадами температур (табл. 1).
Общее содержание фенольных соединений после последовательной экстракции 80% метанолом, очистки объединенного экстракта хлороформом от липофильных пигментов и экстракции фенольного комплекса этиловым эфиром уксусной кислоты, определяли спектроскопическим методом с помощью реактива Фолина-Дениса (Zaprometov, 1971). Качественный состав экстракта исследовали на микроколоночном хроматогрофе «Милихром А-02» (Россия) с УФ-детекором при градиентном режиме хроматографирования (градиент 40 мин от 5 до 100 % ацетонитрила), колонка длиной 75 мм, диаметром 2 мм, скорость потока 100 мкл/мин, сорбент ProntoSil 120-5-C 18 AQ # 2362 (обращено фазный), объем пробы 4 мкл. Элюенты: 0,2 М LiClO 4 – 0,005 M HСlO 4 в H 2 O; CH 3 CN Идентификацию полученных хроматографических пиков проводили путем сравнения их УФ-спектров на длинах волн 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280, 300 нм с базами данных в программе МультиХром-СПЕКТР для Windows.
RESULTS AND DISCUSSION
Динамика общего содержания фенол содержащих веществ демонстрировала не только тканевую, но и видовую специфичность (табл. 2). Так, 25 июня у вероники дубравной содержание фенольных соединений в соцветиях было стабильно выше, чем в листьях, однако динамика изменений их содержания была сходной. Максимум приходился на 900 (4,22 и 4,10 мг/г сырого веса для соцветий и листьев, соответственно), после чего наблюдалось уменьшение их содержания в течение дня (2,79 и 2,29 мг/г в 1400 и 2,30 и 1,69 мг/г в 2100). Соцветия манжетки городковатой продемонстрировали стабильно высокие содержания фенольных соединений (от 3,95 мг/г сырого веса утром до 3,12 мг/г вечером), в то время как в листьях этого растения в 1500 наблюдали скачкообразное увеличение содержания (5,31 мг/г) с последующим минимумом в 2100 (1,25 мг/г) (при исходном содержании в 900 3,28 мг/г). Если в теплое время года для листьев манжетки городковатой характерен суточный максимум днем (5,31 в июле и 8,13 мг/г 15 августа), то в сентябре после полудня наблюдается, наоборот, суточный минимум (2,43 мг/г). Для листьев вероники дубравной картина несколько иная: в августе максимум – в 1400 (2,03 мг/г), а в июне и сентябре высокое содержание фенолов приходится на 900 (4,10 и 4,84 мг/г) и постепенно снижается к вечеру в течение дня до 1,69 и 2,06 мг/г, соответственно.
С помощью ВЭЖХ показано, что в течение периода вегетации и даже в течение одних суток происходят изменения и в составе фенольных соединений и флавоноидов (табл. 3). Это детектируется изменением количества пиков и появлением соединений, не регистрируемых в другое время суток. Например, кемпферол 3-б-D-глюкопиранозид в листьях манжетки обнаружен только днем в августе и сентябре, и рано утром в июне, а кверцетин – утром и вечером в июне и только вечером в августе. Следует отметить, что спектр полифенолов, свойственных манжетке, ограничивается 21-32 соединениями, а для вероники характерно наличие 33-44 соединений во всех изученных частях растения. Уменьшение общего содержания фенольных соединений в листьях или соцветиях исследованных растений нередко сопровождалось увеличением их разнообразия. Так, вопреки ожиданиям, в июне спектр полифенолов, особенно у вероники, оказался выше в листьях, чем в соцветиях по данным за оба года исследований (табл. 3). В стеблях вероники в июне 2014 содержание фенольных соединений было средним. Не исключено, что в середине и конце лета эта закономерность может быть другой.
В июне наибольшее разнообразие фенольных веществ наблюдается вечером в листьях обоих исследованных видов лекарственных растений (но утром и вечером – в соцветиях), что может быть обусловлено необходимостью адаптации к ночной прохладе. В августе ситуация иная: в 900 у листьев вероники и в 9-1400 у листьев манжетки наблюдается максимум количества полифенолов при более затянутом прогреве атмосферного воздуха днем и наступлением тепла только во второй половине дня. Для сентября, характеризующегося в Сибири холодными вечерами, увеличение числа хроматографических пиков особенно сильно проявляется в 2100 как у вероники дубравной, так и у манжетки городковатой.
По-всей видимости, у этих растений фенольные соединения выполняют важную адаптационную роль к суточным температурным колебаниям в условиях резко-континентального климата Сибири и Предбайкалья. Не исключено, что эти вещества вторичного метаболизма растений активно задействуются и при других видах температурных воздействий, в том числе при адаптации к гипотермии и гипертермическому стрессу.
Очевидно, что для более полного проявления лекарственных свойств сбор представленных растений должен быть приурочен к утреннему или вечернему времени суток в зависимости от срока сбора.
Table 1. Метеорологические условия в течение суток (температура атмосферного воздуха и облачность) в даты отбора проб лекарственных растений
|
Метеорологические условия в течение суток в даты отбора проб |
||||||||
|
Время суток |
200 |
00 5 |
800 |
1100 |
1400 |
1700 |
2000 |
2300 |
|
16 июня |
||||||||
|
Температура воздуха |
+13,3 |
+12,2 |
+10,1 |
+13,9 |
+18,7 |
+20,3 |
+13,6 |
+13,0 |
|
Облачность |
облачно |
облачно |
облачно |
облачно |
облачно |
облачно |
облачно |
облачно |
|
15 августа |
||||||||
|
Температура воздуха |
+17,3 |
+17,1 |
+15,1 |
+17,5 |
+15,9 |
+16,2 |
+15,3 |
+19,1 |
|
Облачность |
облачно |
облачно |
облачно |
облачно |
облачно |
облачно |
облачно |
облачно |
|
19 сентября |
||||||||
|
Температура воздуха |
+8,1 |
+8,0 |
+7,7 |
+6,9 |
+7,0 |
+8,5 |
+4,7 |
+3,4 |
|
Облачность |
облачно |
облачно |
облачно |
облачно |
облачно |
облачно |
облачно |
облачно |
Table 2. Общее содержание фенольных соединений, мг/ г сырой массы в листьях и соцветиях манжетки городковатой и вероники дубравной
|
Вид растения |
Время суток |
Общее содержание фенольных соединений, мг/ г сырой массы |
|||
|
Соцветия |
Листья |
||||
|
25 июня |
25 июня |
15 августа |
19 сентября |
||
|
Alchemilla subcrenata |
9.00 |
3,95±0,43 |
3,28±0,73 |
3,22±0,21 |
4,84±0,34 |
|
14.00 |
3,81±0,18 |
5,31±0,57 |
8,13±0,41 |
2,43±0,20 |
|
|
21.00 |
3,12±0,15 |
1,25±0,06 |
2,92±0,20 |
4,17±0,69 |
|
|
Veronica chamaedris |
9.00 |
4,22±0,29 |
4,10±0,27 |
1,04±0,08 |
4,00±0,30 |
|
14.00 |
2,79±0,40 |
2,29±0,14 |
2,03±0,45 |
3,64±0,20 |
|
|
21.00 |
2,30±0,26 |
1,69±0,11 |
1,76±0,16 |
2,06±0,09 |
|
Table 3. Сводные данные ВЭЖХ тканей манжетки городковатой и вероники дубравной
|
Орган растения |
Дата отбора |
Время суток |
Число пиков |
Из них идентифицировано: |
|
|
Veronica chamaedrys |
Alchemilla subcrenata |
Alchemilla subcrenata |
|||
|
соцветия |
25 июня 2013 г |
900 |
36 |
26 |
|
|
1400 |
34 |
22 |
|||
|
2100 |
36 |
24 |
|||
|
лист |
25 июня 2013 г |
900 |
34 |
23-24 |
кемпферол 3-б-D-глюкопиранозид, фенилуксусная кислота, рутин, гиперозид, протоцеанидин В1, кверцетин 3-б-Д-глюкозид, кверцетин |
|
1400 |
41 |
22 |
|||
|
2100 |
44 |
32-35 |
кверцетин, периндопил |
||
|
лист |
15 августа 2013 г |
900 |
43 |
30 |
|
|
1400 |
37 |
31 |
кемпферол 3-б-D-глюкопиранозид |
||
|
2100 |
36 |
24 |
кверцетин, кемпферол |
||
|
лист |
19 сентября 2013 г |
900 |
33 |
24 |
|
|
1400 |
28 |
21 |
кемпферол 3-б-D-глюкопиранозид |
||
|
2100 |
38-39 |
26 |
|||
|
лист |
16 июня 2014 г |
1400 |
41 |
- |
- |
|
соцветия |
1400 |
36 |
- |
- |
|
|
стебель |
1400 |
38 |
- |
- |
|
В таблицах 4 и 5 приведены характерные результаты хроматографического исследования листьев манжетки городковатой утром (900) и вечером (2100), отобранных в течение одних суток (25 июня 2013) с одной экспериментальной площадки. Вечером разнообразие фенольных соединений в данном случае увеличилось на треть и дополнилось восемью новыми соединениями При этом в обеих пробах идентифицированный рутин утром (пик № 23, табл. 2) содержится в количестве всего 0,007 ± 0,001 мкг/мкл а вечером (пик № 24, табл. 3) его содержание заметно выше
(0,046±0,005 мкг/мкл). В то же время, в утренней пробе (900) идентифицирован еще один пик (№ 15, табл. 2), который вероятно представлен несколькими соединениями (рутин 0,125 ± 0,012 мкг/мкл, гиперозид 0,075 ± 0,007 мкг/мкл, протоцеанидин В1 0,167 ± 0,017 мкг/мкл и кверцетин 3-б-Д-глюкозид 0,171 ± 0,017 мкг/мкл) Не менее заметный на хроматограмме пик № 15 в пробе, отобранной в 2100 (табл. 3), имеющий большую площадь (53,2 мкл), очевидно, тоже соответствует рутину.
Table 4. Выявленные пики и их УФ-спектры в листьях манжетки городковатой, отобранных утром в 900 25 июня 2013 г.
|
№ |
время, мкл (объем удерживания, мкл) |
высота пика, AU |
площадь пика, AU*мкл |
УФ-спектры относительно 210 нм |
|||||
|
220 нм |
230 нм |
240 нм |
250 нм |
260 нм |
280 нм |
||||
|
1 |
273,71 |
0,34 |
2,409 |
0,428 |
0,293 |
0,210 |
0,131 |
0,102 |
0,177 |
|
2 |
709,40 |
0,01 |
0,160 |
1,051 |
1,046 |
0,802 |
0,658 |
0,654 |
0,294 |
|
3 |
773,57 |
0,09 |
2,255 |
0,708 |
0,256 |
0,111 |
0,078 |
0,042 |
0,059 |
|
4 |
816,33 |
0,01 |
0,106 |
0,238 |
0,168 |
0,124 |
0,214 |
0,238 |
0,062 |
|
5 |
828,40 |
0,03 |
0,350 |
0,265 |
0,189 |
0,005 |
-0,059 |
-0,030 |
0,024 |
|
6 |
860,58 |
0,01 |
0,109 |
1,121 |
1,564 |
1,039 |
0,446 |
0,546 |
1,366 |
|
7 |
911,34 |
0,04 |
0,977 |
0,978 |
0,780 |
0,565 |
0,510 |
0,531 |
0,574 |
|
8 |
948,37 |
0,02 |
0,190 |
0,774 |
0,437 |
0,464 |
0,517 |
0,468 |
0,516 |
|
9 |
982,56 |
0,07 |
1,369 |
1,043 |
0,799 |
0,763 |
0,667 |
0,461 |
0,498 |
|
10 |
1003,86 |
0,05 |
0,731 |
0,924 |
0,793 |
0,538 |
0,417 |
0,427 |
0,286 |
|
11 |
1037,84 |
0,15 |
1,639 |
1,160 |
0,943 |
0,617 |
0,493 |
0,444 |
0,518 |
|
12 |
1055,40 |
1,03 |
14,696 |
1,032 |
0,958 |
0,686 |
0,552 |
0,552 |
0,394 |
|
13 |
1085,51 |
0,32 |
5,855 |
0,998 |
0,860 |
0,611 |
0,514 |
0,497 |
0,354 |
|
14 |
1136,83 |
0,05 |
0,870 |
1,048 |
0,922 |
0,374 |
-0,011 |
0,039 |
0,300 |
|
15 |
1181,13 |
1,34 |
26,178 |
0,586 |
0,434 |
0,399 |
0,555 |
0,593 |
0,242 |
|
16 |
1230,09 |
0,01 |
0,142 |
0,667 |
0,333 |
0,231 |
0,362 |
0,431 |
0,314 |
|
17 |
1261,68 |
0,08 |
1,306 |
0,669 |
0,622 |
0,506 |
0,514 |
0,692 |
0,497 |
|
18 |
1296,18 |
0,08 |
0,885 |
0,580 |
0,523 |
0,468 |
0,541 |
0,717 |
0,342 |
|
19 |
1330,86 |
0,37 |
4,977 |
0,686 |
0,541 |
0,427 |
0,416 |
0,537 |
0,352 |
|
20 |
1364,09 |
0,11 |
1,221 |
0,663 |
0,494 |
0,461 |
0,543 |
0,511 |
0,281 |
|
21 |
1403,21 |
0,03 |
0,439 |
0,135 |
-0,095 |
-0,089 |
-0,065 |
-0,018 |
-0,057 |
|
22 |
1423,06 |
0,05 |
0,593 |
0,867 |
0,763 |
0,630 |
0,560 |
0,644 |
0,394 |
|
23 |
1448,82 |
0,22 |
2,907 |
0,578 |
0,444 |
0,424 |
0,611 |
0,595 |
0,252 |
|
24 |
1954,71 |
0,01 |
0,317 |
0,318 |
0,100 |
-0,019 |
-0,008 |
0,032 |
0,057 |
Table 5. Выявленные пики и их УФ-спектры в листьях манжетки городковатой, отобранных вечером в 2100 25 июня 2013 г.
|
№ |
время, мкл (объем удерживания, мкл) |
высота пика, AU |
площадь пика, AU*мкл |
УФ-спектры относительно 210 нм |
|||||
|
220 нм |
230 нм |
240 нм |
250 нм |
260 нм |
280 нм |
||||
|
1 |
273,43 |
2,01 |
15,508 |
0,422 |
0,291 |
0,211 |
0,128 |
0,092 |
0,167 |
|
2 |
774,24 |
0,19 |
5,116 |
0,750 |
0,288 |
0,139 |
0,084 |
0,030 |
0,068 |
|
3 |
816,61 |
0,14 |
1,438 |
0,432 |
0,321 |
0,242 |
0,339 |
0,369 |
0,136 |
|
4 |
828,02 |
0,19 |
2,476 |
0,389 |
0,285 |
0,109 |
0,068 |
0,091 |
0,078 |
|
5 |
861,38 |
0,02 |
0,267 |
1,179 |
1,409 |
0,880 |
0,272 |
0,343 |
1,350 |
|
6 |
895,30 |
0,01 |
0,081 |
0,769 |
0,763 |
0,410 |
0,059 |
0,277 |
0,676 |
|
7 |
913,60 |
0,02 |
0,194 |
1,152 |
0,602 |
0,363 |
0,353 |
0,345 |
0,637 |
|
8 |
952,18 |
0,04 |
0,509 |
1,041 |
0,687 |
0,614 |
0,561 |
0,395 |
0,581 |
|
9 |
978,33 |
0,22 |
4,241 |
1,171 |
0,851 |
0,891 |
0,802 |
0,437 |
0,726 |
|
10 |
1008,37 |
0,01 |
0,119 |
0,242 |
0,202 |
-0,471 |
-0,679 |
-0,074 |
-0,649 |
|
11 |
1034,38 |
0,22 |
3,128 |
1,125 |
0,785 |
0,792 |
0,706 |
0,386 |
0,666 |
|
12 |
1054,93 |
0,33 |
4,106 |
0,912 |
0,862 |
0,574 |
0,459 |
0,496 |
0,256 |
|
13 |
1083,93 |
0,13 |
2,449 |
0,714 |
0,570 |
0,335 |
0,391 |
0,552 |
0,118 |
|
14 |
1136,69 |
0,05 |
0,748 |
0,867 |
0,737 |
0,717 |
0,914 |
0,825 |
0,177 |
|
15 |
1182,52 |
2,74 |
53,189 |
0,607 |
0,443 |
0,402 |
0,557 |
0,583 |
0,261 |
|
16 |
1229,49 |
0,03 |
0,407 |
0,603 |
0,361 |
0,338 |
0,727 |
0,514 |
0,295 |
|
17 |
1253,90 |
0,08 |
1,006 |
0,552 |
0,397 |
0,334 |
0,564 |
0,547 |
0,249 |
|
18 |
1267,80 |
0,14 |
1,796 |
0,755 |
0,662 |
0,472 |
0,406 |
0,596 |
0,648 |
|
19 |
1295,85 |
0,02 |
0,260 |
0,614 |
0,433 |
0,396 |
0,555 |
0,594 |
0,279 |
|
20 |
1329,57 |
1,50 |
21,712 |
0,669 |
0,517 |
0,406 |
0,377 |
0,538 |
0,384 |
|
21 |
1362,34 |
0,65 |
9,770 |
0,621 |
0,449 |
0,421 |
0,506 |
0,493 |
0,299 |
|
22 |
1401,73 |
0,13 |
2,201 |
0,308 |
0,112 |
0,089 |
0,111 |
0,132 |
0,057 |
|
23 |
1420,34 |
0,26 |
3,915 |
0,626 |
0,536 |
0,465 |
0,477 |
0,582 |
0,326 |
|
24 |
1447,00 |
1,25 |
18,088 |
0,572 |
0,442 |
0,417 |
0,592 |
0,581 |
0,252 |
|
25 |
1486,53 |
0,02 |
0,321 |
0,564 |
0,286 |
0,181 |
0,269 |
0,289 |
0,171 |
|
26 |
1532,52 |
0,01 |
0,072 |
0,639 |
0,742 |
0,402 |
0,078 |
0,150 |
0,698 |
|
27 |
1546,56 |
0,01 |
0,094 |
0,531 |
0,391 |
0,208 |
0,081 |
0,044 |
0,427 |
|
28 |
1566,01 |
0,02 |
0,234 |
0,648 |
0,512 |
0,395 |
0,352 |
0,538 |
0,399 |
|
29 |
1601,12 |
0,01 |
0,154 |
0,562 |
0,391 |
0,422 |
0,503 |
0,352 |
0,253 |
|
30 |
1683,68 |
0,02 |
0,220 |
0,511 |
0,423 |
0,421 |
0,619 |
0,581 |
0,225 |
|
31 |
2251,99 |
0,01 |
0,191 |
0,539 |
0,063 |
0,209 |
0,535 |
0,808 |
0,269 |
|
32 |
2579,34 |
0,02 |
0,318 |
0,825 |
0,043 |
-0,001 |
0,015 |
0,035 |
-0,006 |
CONCLUSIONS
Изучение суточных и сезонных изменений количественного и качественного состава фенольных соединений в листьях двух видов травянистых лекарственных растений: манжетки городковатой Alchemilla subcrenata и вероники дубравной Veronica chamaedrys выявило, на наш взгляд, существенные особенности содержания фенольных соединений и флавоноидов в зависимости от сроков сбора лекарственного сырья и времени суток.
ACKNOWLEDGMENT
Работа выполнена при поддержке Интеграционной программы «Фундаментальные исследования и прорывные технологии как основа опережающего развития Байкальского региона и его межрегиональных связей».
Список литературы Хроматографическое исследование фенольных соединений в лекарственных растениях Alchemilla subcrenata Buser и Veronica chamaedrys L
- Pell E.J. (1984) Secondary metabolism and air pollutants. In: Gaseous air pollutants and plant metabolism, Koziot M.J., Wratley F.R. (ed.) Butterworths: London, 222-237
- Shaldaev T.M. (2009) Soderzhanie flavonoidov v prirodnyh populjazijah Artemisia absinthium L., proizrastajushchej v lesostepnoj zone zapadnoj Sibiri. Himija rastitelnogo syrja, 2, 169-170
- Zaprometov M.N. (1971) Fenolnye soedinenija i metody ih issledovanija. In: Biohimicheskie metody v fiziologii rastenii, pod red. Pavlinoj O.A. M.: Nauka, 185-197
