Хроматографическое определение силильных производных кодеина и морфина

Введение. В настоящее время препараты из группы агонистов опиоидных рецепторов, например морфин и кодеин, широко применяются как лекарственные средства [1].

Термином «опиаты» обозначают природные и синтетические вещества с морфиноподобными анальгезирующими свойствами, влияющими на центральную нервную систему и гладкие мышцы [2, 5].

Опий представляет собой сложную смесь алкалоидов, получаемую из млечного сока снотворного мака [4].

В состав опия входит свыше 20 алкалоидов. Под алкалоидами понимают большую группу азотсодержащих органических оснований сложного состава, встречающихся в растительных (реже в животных) организмах и обладающих, как правило, сильным фармакологическим действием [9] (табл. 1).

Таблица 1

Основные алкалоиды опия

Алкалоид	Содержание в опии, %
Морфин	42
Кодеин	12
Носкапин (наркотин)	21
Тебаин	6,5
Папаверин	18

В зависимости от сорта и места произрастания снотворного мака в опии содержится от 2 - 3 до 15 - 20 % алкалоидов, главными из которых являются морфин, кодеин, наркотин, тебаин и папаверин.

В медицине опий применяется в виде порошка и галеновых препаратов (экстракты, настойки, таблетки и др.). Из алкалоидов, выделяемых из опия, в медицине применяются морфин, кодеин и др. [5].

Особое влияние опиатов на центральную нервную систему (эйфория и развивающаяся толерантность при повторном применении) приводит к возникновению физической и психической зависимости (наркомании) у потребителей. Эта особенность опиатов объясняет ограниченность их медицинского применения и показаний к немедицинскому использованию [2].

В последнее время значительно участились случаи приема препаратов из группы агонистов опиоидных рецепторов, таких как морфин и кодеин, в немедицинских целях в качестве наркотических средств. Активное изъятие этих препаратов службой по контролю за оборотом наркотиков вынуждает нар-козависимых лиц искать их заменители. Одним из них стал дезоморфин, который известен среди наркоманов как «крокодил».

При его кустарном получении образуется смесь из кодеина, морфина и дезоморфина, вследствие чего в экспертном заключении требуется указание точного процентного содержания каждого из этих компонентов. Существует целый ряд методов количественного анализа содержания кодеина и морфина [3, 7, 8] в исследуемых препаратах, но наиболее перспективным в настоящее время является метод газовой хроматографии с масс-селек-тивным детектором (ГХ-МС) [9, 10]. Однако практическое использование данного метода осложняется тем, что из-за высокой активности гидроксильных групп исследуемые вещества адсорбируются в инжекторе и хроматографической колонке, вследствие чего происходит трансформация веществ, их потеря и искажение результатов количественного определения.

Во избежание этого при количественном определении кодеин и морфин подвергают дериватизации – преобразованию полярных гидроксильных групп в неполярные без затрагивания основной структуры вещества. Наиболее перспективным методом деривати-зации является силилирование. Преимущества получаемых силильных производных состоят в том, что они более летучи, дают хорошее разделение на хроматограмме, интенсивные пики в масс-спектре, обеспечивают высокую чувствительность при определении. При этом дериват можно непосредственно вводить в хроматограф, что помогает избежать потерь при выпаривании.

Утвержденная методика силилирования уже устарела, и в настоящее время появились новые реактивы, которые могут значительно упростить этот процесс [11]. Одним из таких реактивов является BSTFA (N,O-Bis(trimethyl-silyl)trifluoroacetamide).

Цель исследования. Получение силильных производных кодеина и морфина на основе BSTFA для их количественного определения методом газовой хроматографии.

Материалы и методы. Исследования проводились в химической лаборатории Федеральной службы Российской Федерации по контролю за оборотом наркотиков по Ульяновской области.

Для проведения анализов использовались хроматограф Agilent Technologies 6890 N Network GC System; масс-селективный детектор Agilent Technologies 5973 N Network; термостат фирмы Binder серии FD (диапазон температур от +50 до +300 ºС).

Для пробоподготовки и хроматографического анализа применялись следующие реактивы: морфин гидрохлорид х.ч., кодеин фосфат х.ч., метилстеарат х.ч. (в качестве внутреннего стандарта), ацетонитрил х.ч. (в качестве растворителя), BSTFA (в качестве сили-лирующего агента), триэтиламин х.ч. (в качестве средообразующего агента), дистиллированная вода.

В качестве силилирующего агента был использован BSTFA:

CH₃ CF 3 CH 3

CH3 Si        Si CH

C₃S_{N O} 3

^CH3           CH₃

Количественное определение кодеина и морфина проводили с использованием внут- реннего стандарта, которым являлся метил-стеарат.

Для получения силильных производных брали точную навеску 0,005 г морфина гидрохлорида или кодеина фосфата. К пробе в виале добавляли 0,4 мл ацетонитрила. Смесь энергично встряхивали. При этом соли морфина и кодеина выпадают в осадок. Для того чтобы разрушить их и получить растворы чистых веществ, подщелачивали среду 1 каплей три-этиламина. Добавляли 0,4 мл реактива BSTFA. Получившуюся смесь грели в термостате при температуре 60 ºС в течение 15 мин. Затем добавляли 0,005 г метилстеарата.

Полученные силильные производные с помощью BSTFA качественно определялись методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором, а количественно – методом газовой хроматографии.

Пробоподготовку проводили по указанной выше методике, вводя в приборы непосредственно 2 мкл деривата.

Хроматографирование осуществляли в следующих условиях: колонка капиллярная кварцевая длиной 12 - 25 м, заполненная ме-тилсиликоновой фазой (например, OV-101), детектор пламенно-ионизационный, температура испарителя – 280 ºС, детектора – 290 ºС, температура колонки меняется от 200 до 280 ºС со скоростью 10 град/мин. Газ-носитель – гелий (азот).

Зная точные навески кодеина и морфина, которые использовались для хроматографического анализа, определили их относительный массовый коэффициент к метил-стеарату. Расчет производили по следующей формуле:

л х т --т- X K х 100,

Scm Х mn где Sx – площадь пика силильного производного морфина; Sст – площадь пика внутреннего стандарта (метилстеарата); mст – масса внутреннего стандарта, мг; mп – масса исходной пробы, мг; K – относительный массовый коэффициент.

Данные по хроматографическому определению кодеина и морфина подвергали статистической обработке с определением критерия значимости по Стьюденту.

Результаты и обсуждение. Полученные значения площадей пиков при хроматографическом определении морфина и кодеина приведены в табл. 2 и 3.

В табл. 4 приведен перерасчет относительных массовых коэффициентов кодеина и морфина к метилстеарату.

При получении силильных производных с помощью BSTFA относительный массовый коэффициент получается больше (0,99 для кодеина и 0,97 для морфина), чем при получении их по утвержденной методике (0,96 для кодеина и 0,94 для морфина). Это показывает, что силилирование проходит более полно, а значит, и чувствительность определения значительно выше.

Таблица 2

Средняя площадь пиков при хроматографическом определении морфина

Вещество	Повторность, n
	1	2	3	4	5	6	7	8
Морфин	3273,2	3301,9	3245,4	3174,9	3290,6	3256,9	3203,7	3261,3
Метилстеарат	2506,3	2456,3	2521,2	2503,6	2428,7	2569,4	2399,9	2530,6

Таблица 3

Средняя площадь пиков при хроматографическом определении кодеина

Пересчет относительных массовых коэффициентов

Вещество	Повторность, n
	1	2	3	4	5	6	7	8
Кодеин	3427,6	3357,9	3245,4	3400,9	3394,5	3230,9	3422,7	3395,3
Метилстеарат	2059,5	2090,4	2020,9	2072,6	2040,7	2039,9	2093,3	2032,6

Таблица 4

Вещество	Повторность, n								Среднее значение, m
	1	2	3	4	5	6	7	8
Морфин	0,97	0,96	0,98	0,97	0,96	0,99	0,96	0,97	0,97
Кодеин	1,005	1,01	0,94	1,04	0,96	0,97	1,07	0,93	0,99

Заключение. По результатам проведенных исследований сделаны выводы о возможности и целесообразности использования разработанной методики получения силильных производных кодеина и морфина.

Были выявлены преимущества разработанного метода получения силильных производных:

• 1.    Относительный массовый коэффициент получается больше, чем при получении их по утвержденной методике. Это показывает, что силилирование проходит более полно, а значит, и чувствительность определения повышается.

• 2.    Время, затрачиваемое на проведение пробоподготовки, сокращается более чем в 3 раза.

• 3.    Уменьшение количества реагентов, используемых в получении силильных производных, увеличивает чистоту получаемых хроматограмм, которые не засоряются лишними пиками.

Недостатком данного метода можно считать то, что реактив BSTFA, будучи активным силилирующим агентом, силилирует все задержавшиеся в колонке вещества. Поэтому после его применения необходимо чистить колонку, вводя холостую пробу, и проверять остаточную память колонки перед проведением каждого анализа.

• 1.    Веселовская, Н.В. Наркотики / Н.В. Веселовская, А.Е. Коваленко. – М. : Триада – Х, 2000. – 204 с.

• 2.    Голиков, С.Н. Общие механизмы токсического действия. / С.Н. Голиков, И.В. Саноцкий, Л.А. Тиунов. – Л. : Медицина, 1986. – 279 с.

• 3.    Катаев, С.С. Определение дезоморфина в моче / С.С. Катаев, Н.Б. Зеленинин, Е.А. Шилова // Проблемы экспертизы в медицине. – 2007. – №1. – С. 32–36.

• 4.    Криминалистическое исследование опийного и масличного маков / А.В. Гаевский и др. – М. : Высш. шк., 1991. – 248 с.

• 5.    Лужников, Е.А. Клиническая токсикология / Е.А. Лужников. – М. : Медицина, 1999. – 416 с.

• 6.    Мелентьев, А.Б. Определение морфина и кодеина в крови в виде их пропионовых эфиров методом газовой хроматографии – масс-спектрометрии / А.Б. Мелентьев // Журн. аналитической химии. – 2004. – Т. 59, №6. – С. 637–641.

• 7.    Методические рекомендации по исследованию веществ не установленной природы на принадлежность к наркотическим средствам, психотропным, сильнодействующим и ядовитым веществам с использованием методов капельных аналитических (цветных химических) реакций и тонкослойной хроматографии. – Ульяновск : Отдел специальных экспертиз ЭКЦ УВД, 2007. - 35 с.

• 8.    Нестерова, Е.Н. Основы токсикологии : учебное пособие для студентов / Е.Н. Нестерова. – Брянск : Изд-во Брянской гос. инженерно-технологической академии, 2006. – 51 с.

• 9.    Савчук, С.А. Разработка и применение унифицированных методов хроматографического анализа в системе химико-токсикологических и судебно-химических лабораторий / С.А. Савчук. – М. : ЭКУ Госнаркоконтроля России, 2003. – 21 с.

• 10.    Сборник методических рекомендаций по криминалистическому исследованию наркотических средств и психотропных веществ. – М. : ЭКЦ МВД, 2004. – 200 с.

• 11.    Симонов, Е.А. Метод тонкослойной хроматографии в исследовании наркотиков / Е.А. Симонов. – М. : ЭКУ Госнаркоконтроля России, 2003. – 20 с.

CHROMATOGRAPHIC DETERMINATION OF SILYLIC DERIVATIVES OF CODEINE AND MORPHINE

L.A. Mikheeva, P.N. Pimonova, L.F. Enikeeva, O.V. Frolova

Ulyanovsk State University