Хроматография и масс-спектрометрия в алгоритме диагностики печеночной и кишечной дисфункции у больных с механической желтухой и способы ее профилактики

Малоинвазивные хирургические вмешательства на внепеченочных желчных путях способны разрешить многие задачи лечения больных обструктивной желтухой, однако до настоящего времени значительное число больных поступает с запущенной формой механической желтухи. В связи с этим остается острой проблема лечения печеночной дисфункции и эндотоксикоза [1, 2, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 12, 14, 16].

Основной причиной осложнений и летальных исходов у этой категории больных является прогрессирующая до и в послеоперационном периоде печеночная дисфункция [3, 4, 5, 7, 8, 13, 14].

Среди механизмов развития данного состояния не совсем ясным и неизученным представляется роль и место нарушений деятельности кишечника и его функциональных взаимосвязей с печенью в зависимости от объема операционной травмы, хотя широко известно, что транслокация микробов в печень и желчные пути идет из кишечника [16, 18, 19, 20, 21, 22, 23]. Не разработаны показания, возможность, место и эффективность энтеральной коррекции печеночной дисфункции.

Целью настоящего исследования является совершенствование методов лечения механической желтухи на основе изучения новых патогенетических аспектов печеночной и кишечной дисфункции и обоснования эффективности ее коррекции с помощью методов малоинвазивной хирургии и энтеропротективной терапии.

В связи с этим, на кафедре хирургии МПФ, на курсе хирургической гепатологии при кафедре хирургии ФППОВ ПМГМУ им. И.М. Сеченова, в отделении экстренной хирургии печени и поджелудочной железы НИИ СП им. Н.В. Склифосовского и в клинико-биохимической лаборатории Института Хирургии им А.В. Вишневского начато пилотное исследование по изучению и определению токсических кишечных метаболитов в сыворотке крови и в желчи методами газовой хроматографии и масс-спектрометрии, и впервые проведена коррекция дисбиоза кишечника у больных механической желтухой.

Изучено влияние кишечного антибиотика – рифаксимина, и пребиотика – лактулозы на состояние микробиоценоза кишечника с целью воздействия на течение и исход патологического процесса при тяжелых и крайне тяжелых формах механической желтухи у больных старшего и пожилого возраста (табл. 1).

Табл. 1. Распределение больных по полу и возрасту

возраст	мужчины		женщины		всего
	кол-во	%	кол-во	%	кол-во	%
до 60 лет	17	11,5%	24	22%	41	34%
с 60 до 70 лет	18	12%	20	19,50%	38	32%
с 70 и выше	16	11%	25	24%	41	34%
Итого	51	34,50%	69	65,50%	120	100%

Средний возраст составил 67,5 лет.

Бекбауов С.А., Липницкий Е.М., Котовский А.Е.,Чжао А.В., Истратов В.Г. ХРОМАТОГРАФИЯ И МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ В АЛГОРИТМЕ ДИАГНОСТИКИ ПЕЧЕНОЧНОЙ И КИШЕЧНОЙ ДИСФУНКЦИИ У БОЛЬНЫХ С МЕХАНИЧЕСКОЙ ЖЕЛТУХОЙ И СПОСОБЫ ЕЕ ПРОФИЛАКТИКИ

У 120 больных механической желтухой различного генеза с подтвержденными клинико-лабораторными данными кишечно-печеночной дисфункции методами газовой хроматографии и масс-спектрометрии (ГХ и МС) в сыворотке крови определяли содержание летучих жирных кислот и токсических метаболитов: уксусную, пропионовую, масляную, изовалериановую, валериановую, изокапроновую, капроновую кислоты, фенолы, крезолы, фенилкарбоновые кислоты: фенилуксусную и фенилпропионовую, оксифенилкарбоновые кислоты, ди- и полиамины, ароматические амины, изожирные кислоты, а также исследовали сигнальные соединения кворум сенсинг – так называемых активаторов кооперативной чувствительности: лактонов, хинолонов и фурановых эфиров.

В желчи методами ГХ-МС-анализа исследовали метаболиты билирубина: ассоциированный с альбумином билирубин, билирубин диглюкоронид, билирубин моноглюкоронид, мезобилирубин, сульфат билирубина, комплексные соединения билирубина+пироллы, комплексные соединения билирубина+фосфолипиды и короткоцепочечные жирные кислоты.

Исследования проводили на хромато-масс-спектрометрической системе Agilent с масс-селективным детектором MSD–5973 на базе клинико-биохимической лаборатории КДО Института хирургии им. А.В. Вишневского.

Следует отметить, что уксусная, пропионовая, масляная, изовалериановая, валериановая, изокапроновая, капроновая относятся к летучим жирным кислотам (короткоцепочечные жирные кислоты, КЖК) и являются индикаторами биоценоза кишечника, при этом уксусная кислота является метаболитом аэробных микроорганизмов, а остальные КЖК – анаэробных. Фенолы и крезолы являются органными метаболитами почечной патологии; фенилкарбоновые кислоты: фенилуксусная и фенилпропионовая кислоты – являются органными метаболитами печеночной патологии; оксифенилкарбоновые кислоты, диамины, полиамины и ароматические амины являются органными показателями гипоксии печеночной ткани; изожирные высшие кислоты относятся к длинноцепочечным жирным кислотам, и являются органными показателями сепсиса и полиорганной недостаточности (ПОН).

В норме уровни КЖК и токсических кишечных метаболитов (ТКМ) колеблятся от 0,002 мкмоль\л до 0,02 мкмоль\л и являются биохимическими маркерами печеночной дисфункции.

У всех больных была механического характера желтуха с показателями билирубина крови выше нормы на 1000% (от 290 мкмоль\л и выше), мочевины – на 200% (20,7 ммоль\л) и креатинина – на 450% (0,598 ммоль\л).

У всех больных в качестве первого этапа разрешения желтухи были выполнены различные варианты малоинвазивных методов декомпресии желчных протоков (ЖП), а у 80 из них дополнены коррекцией дисбиоза кишечника с помощью энтеропротекторов: кишечного антибиотика

– рифаксимина (у 40 больных) и пребиотика – лактулозы (также у 40 больных).

В проведенном слепом рандомизированном исследовании все 120 больных были распределены на 3 группы.

• 1    группа – больные, которым произведена только декомпрессия ЖП.

• 2    группа – больные, которым после декомпрессии ЖП назначали рифаксимин в дозе 400 мг в сутки.

• 3    группа – больные, которым наряду с декомпрессией ЖП назначали лактулозу по 30 мл\сут.

• У    всех больных изучены показатели ТКМ через 7 дней после начала лечения (табл. 2).

Уровень содержания короткоцепочечных жирных кислот в группе I в пределах доверительных интервалов (р < 0,005) колебался: для уксусной кислоты- от 0,24 до 0,29 ммоль\л; для пропионовой кислоты- от 0,38 до 0,64 ммоль\л; для масляной кислоты – от 0,77 до 1,04 ммоль\л; для изовалериановой кислоты – от 0,58 до 0,69 ммоль\л; для валериановой кислоты – от 0,26 до 0,49 ммоль\л; для изокапроновой кислоты – от 0,58 до 0,67ммоль\л; для капроновой кислоты – от 0,31 до 0,38 ммоль\л; для фенолов – от 0,36 до 0,59 мкмоль\л; для крезола – от 0,42 до 0,67 ммоль\л; для фенилкарбоновых кислот – от 0,79 до 1,13 ммоль\л; для оксифенилкарбоновых кислот – от 0,46 до 0,77 ммоль\л; для ди- и полиаминов от 0,54 до 0,78 ммоль\л; для ароматических аминов – от 0,66 до 0,83 ммоль\л; для изожирных кислот – от 1,25 до 1,31 ммоль\л; для показателя анаэробно-аэробного соотношения К – от 82,6 до 83,1 ммоль\л (табл. 3). Полученные данные свидетельствуют о выраженном дисбактериозе кишечника.

В группе II у больных с применением рифаксимина наиболее значимые и достоверные значения получены у пропионовой кислоты: 0,21–0,14 ммоль\л; у изовалериановой кислоты: 0,34–0,14; у валериановой кислоты: 0,13–0,03 ммоль\л; у изокапроновой кислоты: 0,19–0,09 ммоль\л; у оксифенилкарбоновой кислоты: 0,34–0,18 ммоль\л. В группе Ш у больных с применением лактулозы получены следующие данные – масляная кислота: 0,52–0,32 ммоль\л; изокапроновая кислота: 0,56–0,33 ммоль\л; крезол: 0,48–0,28 ммоль\л, в то же время – изовалериановая кислота: 0,24–0,28 ммоль\л; валериановая кислота: 0,16–0,23 ммоль\л. Уровни КЖК в обеих группах (I и Ш) свидетельствуют о тенденции к нормализации кишечного микробиоценоза.

Табл. 2. Распределение больных по группам и по видам лечения

Виды лечения	I группа n = 40	II группа n = 40	III группа n = 40
без энтеропротекторов	Традиционное лечение
энтеропротекция с рифаксимином		По 200 мг 2 раза в течение 7 дней
энтеропротекция с лактулозой			15 мл 2 раза в течение 7 дней

Бекбауов С.А., Липницкий Е.М., Котовский А.Е.,Чжао А.В., Истратов В.Г.

ХРОМАТОГРАФИЯ И МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ В АЛГОРИТМЕ ДИАГНОСТИКИ ПЕЧЕНОЧНОЙ И КИШЕЧНОЙ ДИСФУНКЦИИ У БОЛЬНЫХ С МЕХАНИЧЕСКОЙ ЖЕЛТУХОЙ И СПОСОБЫ ЕЕ ПРОФИЛАКТИКИ

При изучении методами ГХ-МС-анализа в пробах желчи ассоциированные с альбумином формы билирубина колебались от контрольной группы к опытным: от 3,4 мкмоль\л до 1,8 мкмоль\л; билирубин диглюкоронид: от 6,1 до 5,3 мкмоль\л; билирубин моноглюкоронид: от 7,8 до 6,1 мкмоль\л; мезобилирубин: от 0,48 до 0,26 мкмоль\л; фосфолипиды+билирубин: от 12,7 до 10,3 мкмоль\л; пи-роллы+билирубин: от 0,23 до 0,16 мкмоль\л (табл. 4).

Также в периферической крови больных были обнаружены соединения, которые относятся к группе системы QS (Quorum Sensing – чувства кворума) или коллективного поведения микроорганизмов, представленных лактонами (бутиринолактон), хинолонами (2, 3, 6, 7-тетраги-дро-1-H-5-H-бензохинолон; 22- бихинолон), фурановым эфиром бора (N-N-диметил-метамин-тригидро-боран и 2-фуранил-2-пропионовая кислота). Первое место по содержанию в сыворотке крови тяжелых больных заняла 2-фуранил-2 пропионовая кислота, одно из родственных соединений фурановых эфиров бора с содержанием от 0,11±0,007 ммоль\л до 0,15±0,008 ммоль\л; на втором месте – классический представитель лактонов- бутиринолактон с содержанием от 0,08 ± 0,003 ммоль\л до 0,11 ± 0,007 ммоль\ л; на третьем месте -2,2-бихинолин – один из представителей хинолонов от 0,06 ± 0,007 моль\л до 0,10 ± 0,003 ммоль\л; на четвертом месте – N-N-диметил-метамин-тригидроборан с содержанием от 0,02 ± 0,003ммоль\л до 0,05±0,006 ммоль\л; на пятом месте – 2, 3, 6, 7 – тетрогидро-1-1-5-Р-бензохинолон с содержанием в сыворотке крови от 0,10 ± 0,002 ммоль\л до 0,12 ± 0,003 ммоль\л (табл. 5).

Полученные результаты определения уровня различных метаболитов с помощью ГЖХ-МС указывают на тенденцию к нормализации микробиоценоза кишечника в случае назначения рифаксимина или лактулозы, улучшения функции печени, в направлении ликвидации ее дисфункции.

Табл. 3. Токсические кишечные метаболиты

ТКМ в периферической крови больных с механической желтухой (M ± m, ммоль/л) n = 120

ТКМ в периферической крови (ммоль/л)	Норма (доноры)*	Группа I (базисная терапия)		Группа II (назначение рифаксимина)		Группа III (назначение лактулозы)
		1 день	7 день	1 день	7 день	1 день	7 день
уксусная	0,06 ± 0,003	0,24 ± 0,03	0,29 ± 0,04	0,21 ± 0,03	0,15 ± 0,02	0,23 ± 0,03*	0,11 ± 0,02
пропионовая	0,08 ± 0,004	0,38 ± 0,05	0,64 ± 0,07	0,21 ± 0,03	0,14 ± 0,02	0,36 ± 0,04*	0,23 ± 0,03
масленая	0,10 ± 0,005	0,77 ± 0,08	1,04 ± 0,11	0,66 ± 0,07	0,41 ± 0,05	0,52 ± 0,06	0,32 ± 0,04
изовалериановая	0,09 ± 0,006	0,58 ± 0,06	0,69 ± 0,07	0,34 ± 0,04	0,14 ± 0,02	0,28 ± 0,03	0,19 ± 0,02
валериановая	0,04 ± 0,003	0,26 ± 0,03	0,49 ± 0,05	0,13 ± 0,02	0,03 ± 0,002	0,23 ± 0,03	0,16 ± 0,02
изокапроновая	0,12 ± 0,006	0,58 ± 0,06	0,67 ± 0,07	0,19 ± 0,02	0,09 ± 0,004	0,56 ± 0,06*	0,33 ± 0,04
капроновая	0,07 ± 0,003	0,31 ± 0,04	0,38 ± 0,05	0,33 ± 0,04	0,26 ± 0,03	0,30 ± 0,04*	0,22 ± 0,03
фенолы	0,13 ± 0,007	0,36 ± 0,04	0,59 ± 0,06	0,48 ± 0,05	0,33 ± 0,04	0,42 ± 0,05	0,29 ± 0,03
Крезолы	0,15 ± 0,008	0,42 ± 0,05	0,67 ± 0,07	0,51 ± 0,06	0,36 ± 0,04	0,48 ± 0,05	0,28 ± 0,03
фенилкарбоновые	0,32 ± 0,04	0,79 ± 0,08	1,13 ± 0,12	0,88 ± 0,09	0,66 ± 0,07	0,81 ± 0,09	0,61 ± 0,07
оксифенилкарбоновые	0,26 ± 0,03	0,46 ± 0,05	0,77 ± 0,08	0,34 ± 0,04	0,18 ± 0,02	0,51 ± 0,06	0,22 ± 0,03
ди-и полиамины	0,21 ± 0,03	0,54 ± 0,06	0,78 ± 0,09	0,64 ± 0,07	0,42 ± 0,05	0,61 ± 0,07	0,39 ± 0,04
ароматические амины	0,24 ± 0,04	0,66 ± 0,07	0,83 ± 0,09	0,73 ± 0,08	0,59 ± 0,06	0,77 ± 0,08	0,51 ± 0,06
С14-С20 изожирные кислоты	1,01 ± 0,13	1,25 ± 0,16	1,31 ± 0,18	1,19 ± 0,13	1,02 ± 0,09	1,17 ± 0,12	1,05 ± 0,08
К анар/аэр. Соотношение	69,3 ± 7,2	82,6 ± 7,3	83,1 ± 7,9	79,6 ± 8,1	78,8 ± 8,5	78,6 ± 8,1	76,9 ± 7,9

Примечание: * – p < 0,05 – остальные значения по сравнению с контрольным p < 0,005.

Табл. 4. Метаболиты билирубина

Содержание суммарных КЖК, билирубина и его метаболитов в желчи больных с механической желтухой (M ± m, ммоль/л) n = 120

КЖК и метаболиты билирубина                                 Больные с механической желтухой разного генеза (n = 120)

в желчи (ммоль/л)	Группа I (базисная терапия)		Группа II (назначение рифаксимина)		Группа III (назначение лактулозы)
	1 день	7 день	1 день	7 день	1 день	7 день
билирубин, ассоциированный с альбумином	3,4 ± 0,04	3,8 ± 0,05	2,3 ± 0,03	1,8 ± 0,02	3,1 ± 0,04	1,6 ± 0,02
билирубин-диглюкоронид	6,1 ± 0,07	0,3 ± 0,08	4,8 ± 0,05	4,6 ± 0,05	5,91 ± 0,07	5,3 ± 0,06
билирубин-моноглюкоронид	7,8 ± 0,09	7,9 ± 0,09	7,3 ± 0,08	6,1 ± 0,07	7,12 ± 0,08	6,3 ± 0,07
мезобилирубин	0,48 ± 0,05	0,46 ± 0,05	0,44 ± 0,05	0,31 ± 0,04	0,43 ± 0,05*	0,26 ± 0,03
пирроллы+билирубин	0,23 ± 0,03	0,21 ± 0,03	0,22 ± 0,03	0,16 ± 0,02	0,24 ± 0,03	0,19 ± 0,02
КЖК (суммарно)	2,11 ± 0,12	2,13 ± 0,11	2,02 ± 0,09	1,19 ± 0,08	2,08 ± 0,06	1,13 ± 0,06

Примечание : * – p < 0,05 остальные значения по сравнению с контрольным p < 0,005.

Бекбауов С.А., Липницкий Е.М., Котовский А.Е.,Чжао А.В., Истратов В.Г. ХРОМАТОГРАФИЯ И МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ В АЛГОРИТМЕ ДИАГНОСТИКИ ПЕЧЕНОЧНОЙ И КИШЕЧНОЙ ДИСФУНКЦИИ У БОЛЬНЫХ С МЕХАНИЧЕСКОЙ ЖЕЛТУХОЙ И СПОСОБЫ ЕЕ ПРОФИЛАКТИКИ

Табл. 5. Активаторы кооперативной чувствительности

Содержание активаторов QS-системы микроорганизмов в периферической крови больных с механической желтухой (M ± m, ммоль/л) n = 120

Активаторов кооперативной чувствительности (ммоль/л)	Больные с механической желтухой (n = 120)
	Группа I (базисная терапия)		Группа II (назначение рифаксимина)		Группа III (назначение лактулозы)
	1 день	7 день	1 день	7 день	1 день	7 день
Лактоны	0,07 ± 0,006	0,08 ± 0,007	0,06 ± 0,005*	0,04 ± 0,005	0,05 ± 0,006	0,03 ± 0,004
Хинолоны	0,11 ± 0,007	0,10 ± 0,008	0,09 ± 0,007	0,06 ± 0,007	0,07 ± 0,008	0,03 ± 0,004
Фурановые эфиры	0,19 ± 0,08	0,17 ± 0,09	0,18 ± 0,09	0,13 ± 0,09	0,15 ± 0,09	0,08 ± 0,007

Примечание : статистически достоверное увеличение активаторов QS-системы определяется только у тяжелых и крайне тяжелых больных (n = 25) * – p < 0,05 остальное значение по сравнение с контрольным p < 0,005.

Обсуждение

Согласно данным литературы при приеме лактулозы наблюдается снижение рН стула с 7,0 до 6,8, что ассоциируется с тенденцией нормализации нарушенного микробиоценоза, т.е. изменениями в микробиоте толстой кишки. Независимо от диеты в просвете толстой кишки и в стуле определяют 3 основных продукта ферментации углеводов: уксусную, пропионовую и масляную кислоты, составляющие в сумме 85–95% от всех КЖК. Добавление лактулозы, способной пройти в толстую кишку, вызывает значительное увеличение концентрации этих трех кислот в кишечном просвете. Помимо вышеупомянутых кислот в содержимом толстой кишки обнаруживаются также валериановая, гексановая и некоторые варианты изокислот. Они являются продуктами ферментации белков и, несмотря на невысокие концентрации указанных КЖК, наряду с аммиаком, оказывают токсическое действие на нервную систему. В условиях организма нейтрализация кислот обеспечивается выделением со слизью бикарбоната натрия и их абсорбцией в кровь. Повышение рН в просвете толстой кишки происходит и за счет ферментации белков. При избытке лактулозы в содержимом толстой кишки происходят качественные биохимические изменения. В присутствии лактулозы ферментация белков и образование этих токсичных метаболитов прекращаются. При применении лактулозы в высоких дозах (30 мл сиропа 3 раза в день) заметным становится влияние осмотического давления ее раствора и уменьшается время транзита в просвете кишки. Лактулоза появляется в стуле, за этим следует послабление кишечника, что позволяет использовать ее в качестве слабительного. Применение же рифаксимина способствует, по-видимому, элиминации части популяции чувствительной к антибиотику, практически не всасываемому из кишечника, микрофлоры и на фоне назначения лактулозы, избирательно стимулирующую индигенную анаэробную микрофлору, способствует подавлению избыточного бактериального роста в тонкой кишке. Об этом свидетельствует динамика определения в сыворотке крови тяжелых больных соединений, ассоциированных с сигнальной QS-системой микроорганизмов: 2-фуранил-2-пропионовой кислоты, бутиринолактона и различного типа хинолонов. Следует отметить, что понятие Quorum Sensing или «ощущение кворума» было предложено для интеграции молекулярных механизмов, контролирующих плотность популяции и зависящих в своей функции от QS-системы, подробно описанных в литературе (Петров и др, 2007, Бондаренко В.М. и Мацулечвич Т.В., 2007). Характерным признаком всех регуляторных систем, функционирующих по принципу QS-системы, является наличие двух регуляторных белков: одного сенсорного, ответственного за связывание своего аутоиндуктора, и второго – белка регуляторного ответа. Сигнальные молекулы реагируют с рецепторным доменом сенсорного белка, что приводит к изменению его конформации, посредством чего передающий модуль сенсорного белка проводит сигнал к другому компоненту QS-системы – белку-регулятору ответа. Передача сигнала осуществляется через фосфорилирование белка-регулятора с использованием остатков аминокислот гистидина и аспарагина. Показано, что в основе функции всех регуляторных QS-систем определяющим является возрастание концентрации секретируемого аутоиндуктора в зависимости от увеличения плотности клеточной культуры. Для оценки динамики изменения концентраций обнаруживаемых у больных механической желтухой сигнальных молекул QS-системы микроорганизмов необходимы специальные исследования.

Таким образом, у больных с печеночной и кишечной недостаточностью при механической желтухе необходима одновременная коррекция состояния печени и дисбио-за кишечника, что позволяет выполнять радикальные хирургические операции в более благоприятных условиях.

ХРОМАТОГРАФИЯ И МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ В АЛГОРИТМЕ ДИАГНОСТИКИ ПЕЧЕНОЧНОЙ И КИШЕЧНОЙ ДИСФУНКЦИИ У БОЛЬНЫХ С МЕХАНИЧЕСКОЙ ЖЕЛТУХОЙ И СПОСОБЫ ЕЕ ПРОФИЛАКТИКИ