Идентификация гена устойчивости к антракнозу Lanr1 у люпина узколистного ( Lupinus angustifolius L.) с помощью ДНК-маркеров AnSeq3 и AnSeq4

Антракноз — инфекционное заболевание многих сельскохозяйственных культур, в том числе люпина узколистного Lupinus angustifolius L. Болезнь у растений люпина вызывает гриб Colletotrichum lupini (1). В годы развития эпифитотий антракноза происходит значительное снижение урожайности у восприимчивых к патогену сортов. Посевы люпина, сильно пораженные заболеванием, не рекомендуется использовать на семенные цели, зернофураж и силосование (2). По данным литературы, впервые в

СССР антракноз был обнаружен именно на люпине узколистном, который поражался в наибольшей степени по сравнению с другими видами (3). Однако благодаря многолетней селекции на устойчивость к антракнозу некоторые современные сорта L . angustifolius L . обладают толерантностью к болезни. В то же время необходимо отметить, что устойчивость носит не абсолютный, а относительный характер, потому что так называемые высокоустойчивые образцы могут поражаться инфекцией, но в меньшей степени, чем растения, которые считаются неустойчивыми.

До сих пор среди исследователей нет единого мнения по поводу общего числа генов, связанных с толерантностью к антракнозу (4). Американские сорта люпина узколистного Rancher, Frost и австралийские сорта Marri, Illyarrie, Yandee, Danja несут доминантный ген устойчивости к антракнозу An (5). Австралийский сорт Kalya обладает доминантным геном Lanr2 , обусловливающим среднюю устойчивость к антракнозу (6). Высокая устойчивость к антракнозу у австралийских сортов Wonga и Tanjil контролируется доминантным геном Lanrl (7). По данным гибридологического анализа, в генотипе белорусских сортов Миртан и Першацвет, показывающих устойчивость к антракнозу на уровне сортов Wonga и Tanjil, содержатся блоки из трех неаллельных доминантных генов Rcll Rcl2 Rcl3 .

Следует подчеркнуть, что в настоящее время селекционеры из разных стран развернули исследования по созданию более устойчивых к антракнозу сортов посредством объединения в одном генотипе неаллельных генов устойчивости к болезни (4). С целью быстрого и эффективного отбора устойчивых к антракнозу растений разрабатываются ДНК-маркеры, сцепленные с генами устойчивости к заболеванию. Так, австралийскими исследователями были предложены ДНК-маркеры AntjMl (7), AntjM2 (8), AnSeq3 и AnSeq4 (9), сцепленные с геном Lanrl . С помощью праймеров для соответствующих маркеров устойчивости к антракнозу у люпина узколистного можно определить наличие гена Lanrl в изучаемых образцах при использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим анализом ДНК-фрагментов.

Скрининг селекционного материала с применением ДНК-маркеров позволяет выявить и рекомендовать для включения в селекционный процесс устойчивые к антракнозу растения. В то же время, как показали результаты работы австралийских исследователей, прежде чем использовать ДНК-маркеры в селекции, необходим предварительный анализ их эффективности для тех или иных селекционных образцов (10). Ранее при изучении устойчивости к антракнозу, контролируемой геном Lanrl , мы применили маркеры AntjMl, AntjM2 для анализа ДНК у 14 сортов люпина узколистного российской и белорусской селекции (11). К настоящему времени наиболее близкими к Lanrl представляются ДНК-маркеры AnSeq3 и AnSeq4, которые фланкируют ген на расстоянии 0,9 сМ (9).

Целью настоящей работы было исследование возможности использования ДНК-маркеров AnSeq3 и AnSeq4, сцепленных с геном Lanrl , в селекции российских и белорусских образцов люпина узколистного, в связи с чем мы оценили наличие гена устойчивости к антракнозу Lanrl у сортов и образцов различного селекционного происхождения с помощью двух указанных молекулярных маркеров.

Методика. Материалом для исследования служили 50 сортов и образцов люпина узколистного ( Lupinus angustifolius L.) российской, белорусской, польской и австралийской селекции.

ДНК выделяли индивидуально из семян в 3-кратной повторности по методике, использованной ранее (11). ПЦР проводили в амплификато- ре Терцик («ДНК-Технология», Россия). В состав реакционной смеси объемом 10 мкл входила геномная ДНК (10-20 нг), прямой и обратный праймеры (0,3 мкМ), Taq-полимераза Е 338 (0,25 ед.), MgCl2 (1,5 мМ), dNTPs (0,15 мМ), В321 AS буфер (1 мкл). Использовали ферменты и реактивы фирмы «СибЭнзим» (Россия). Условия амплификации — начальная денатурация 1 мин при 95 °С; далее 30 циклов: денатурация 30 с при 95 °С, отжиг 20 с при 51 °С для праймеров в случае маркера AnSeq3 и при 53 °С для праймеров к маркеру AnSeq4, элонгация 10 с при 72 °С; заключительная элонгация 2 мин при 72 °С. Использованные праймеры к маркерам AnSeq3 и AnSeq4 сайтспецифичны (9) и синтезированы фирмой «Синтол» (Россия). Разделение фрагментов ДНК проводили в 11-13 % полиакриламидных гелях с использованием камеры для вертикального электрофореза VE-20 («Хеликон», Россия). Продукты ПЦР разделяли в течение 5-6 ч при напряжении 270-300 В. Гель помещали в раствор бромистого этидия (концентрация 0,5 мг/л) на 20-30 мин. После окрашивания его визуализировали на сканере гелей GelDocXR («Bio-Rad», США). В качестве контролей для определения длины маркерных аллелей использовали продукты ПЦР с ДНК растений, представляющих сорта австралийской селекции Tanjil, Wonga, Kalya.

Результаты. Нами были исследованы 50 образцов люпина узколистного разного происхождения (табл.).

Образцы люпина узколистного, включенные в исследование по идентификации аллелей ДНК-маркеров AnSeq3 и AnSeq4 гена устойчивости к антракнозу Lanrl

Предоставлено Россией          |        Предоставлено Белоруссией ~

Сорта и образцы российской селекции (всего 13): Радужный, Сидерат 38, Кристалл, Снежеть, Белозерный 110, Смена, Надежда, Брянский 123, Витязь, Узколистный 53-02, Вектор, Белозерный 121, СН 78-07

Сорта и образцы белорусской селекции (всего 23): Привабны, Першацвет, Милан, Гелена, Миртан, Хвалько, Ян, БГБ-6, Геркулес, Жодинский, Ранний, БГБ-3, Миртан 312, МК-ВДС-Беис, ПЭЛ-МРЛ, Ра-монок, 4Б-129, БГБ-1, БГБ-2, БГБ-4, Вада 40, Василек, Дивный

Сорта и образцы польской селекции (всего 10): Барон, Борута, Бояр, Граф, Зевс, Калиф, Нептун, Регент, Цезарь, Эльф

Сорта и образцы австралийской селекции (всего 4): Tanjil, Wonga, Kalya, W2248 _______________________ Примечание. Российский и белорусский селекционный материал был предоставлен соответственно Всероссийским НИИ люпина (г. Брянск) и НПЦ НАН Беларуси по земледелию (г. Жодино).

ДНК-фрагменты длиной 92 и 87 п.н., соответствующие маркерам AnSeq3 и AnSeq4, были получены для всех 50 селекционных образцов, включенных в исследование. В ходе сопоставления маркерных аллелей, выявленных для австралийских контрольных сортов и других селекционных образцов, определили аллели восприимчивости (S) и устойчивости (R) к антракнозу. Аллели AnSeq3 и AnSeq4 представляют собой однонуклеотидные полиморфизмы (single nucleotide polymorphism — SNP), имеющие одинаковую длину для каждого маркера. При электрофоретическом разделении в полиакриламидном геле фрагменты, соответствующие маркерным аллелям устойчивости для AnSeq3 из-за наличия одной замены нуклеотида C на T располагались ниже ампликонов аллелей восприимчивости, тогда как для AnSeq4 наблюдалось обратное распределение вследствие единичной замены G на A в нуклеотидной последовательности (7). Так, у сортов Tanjil и Wonga (положительные контроли устойчивости по гену Lanrl) ДНК-фрагменты для аллелей AnSeq3 и AnSeq4 располагались соответственно ниже и выше амплифицируемых у сорта Kalya (отрицательный контроль устойчивости по гену Lanrl). Продукты ПЦР, полученные для ДНК каждого из сортообразцов люпина узколистного, включен- ных в исследование, воспроизводились во всех трех повторностях. Маркерные аллели AnSeq3, AnSeq4 для различных сортов и образцов российской, белорусской и австралийской селекции представлены на рисунке.

Результаты электрофоретического разделения ПЦР-продуктов, полученных для аллелей ДНК-маркеров AnSeq3 (1-34, вверху) и AnSeq4 (1-34, внизу) восприимчивости и устойчивости к антракнозу, у изученных сортов и селекционных образцов разного происхождения: А — фотодокументирование, Б — схематические изображения; 1, 17, 18, 34 — Tanjil, 2 — Радужный, 3 — Сидерат 38, 4 — Кристалл, 5 — Снежеть, 6 — Белозерный 110, 7 — Смена, 8 — Надежда, 9, 26 — Wonga, 10, 27 — Kalya, 11 — Брянский 123, 12 — Витязь, 13 — Узколистный 53-02, 14 — Вектор, 15 — Белозерный 121, 16 — СН 78-07, 19 — Привабны, 20 — Першацвет, 21 — Митан, 22 — Гелена, 23 — Миртан, 24 — Хвалько, 25 — Ян, 28 — БГБ-6, 29 — Геркулес, 30 — Жодинский, 31 — Ранний, 32 — W 2248, 33 — БГБ-3; S и R — соответственно маркерные аллели восприимчивости и устойчивости, сцепленные с геном Lanrl (12 % полиакриламидный гель; описание сортов и селекционных образцов см. в тексте статьи).

В результате при ПЦР-анализе для образцов российской селекции не были выявлены R-аллели ДНК-маркеров AnSeq3 и AnSeq4, сцепленных с геном Lanrl , который контролирует устойчивость к антракнозу у австралийских сортов Wonga и Tanjil. Ранее информация о том, что современные внесенные в Государственный реестр селекционных достижений РФ сорта Всероссийского НИИ люпина не содержат устойчивых маркерных аллелей, сцепленных с геном Lanrl , нами была получена также с помощью других ДНК-маркеров — AntjM1 и AntjM2 (11). Известно, что генетический материал, который находится в основе устойчивости к антракнозу у австралийских сортов Wonga и Tanjil, в селекции исследованных в настоящей работе российских сортов использован не был, что подтвердили результаты молекулярно-генетического анализа аллелей ДНК-маркеров гена Lanrl . Сортам польской селекции, как и российским образцам, соответствовали маркерные аллели восприимчивости к антракнозу по гену Lanrl . По фенотипическим проявлениям у сортов польской селекции, включенных в настоящее исследование, выраженная устойчивость к антракнозу на уровне австралийских сортов Tanjil и Wonga отсутствовала, что согласуется с данными по маркерам AnSeq3 и AnSeq4.

Для большинства белорусских образцов были характерны аллели восприимчивости к антракнозу. Аллели устойчивости по двум маркерам AnSeq3, AnSeq4 обнаружили только у компонента биологического банка генов узколистного люпина БГБ-6. Этот селекционный образец имеет близкородственные связи с сортами Wonga и Tanjil и также проявляет высокую устойчивость к антракнозу в полевых и лабораторных испытаниях (4).

Для сорта Миртан были выявлены маркерные аллели устойчивости только по AnSeq3. В предыдущей работе с маркерами AntjM1 и AntjM2 у этого сорта мы обнаружили восприимчивые аллели, причем с помощью праймеров для маркера AntjM2 был амплифицирован аллель, который не идентифицировался у других образцов, что характеризует генетическое своеобразие названного сорта (11). Вариацию аллелей устойчивости/вос-приимчивости к антракнозу по маркерам AnSeq3 и AnSeq4 можно объяснить различной генетической основой белорусского сорта Миртан и австралийского сорта Tanjil. Несмотря на то, что сорт Миртан характеризуется относительно высокой устойчивостью к антракнозу, при его селекции не использовался австралийский устойчивый к заболеванию материал. Таким образом, представляется вероятным то, что у сорта Миртан маркер AnSeq3 дает «ложноположительные» результаты по сравнению с маркером AnSeq4 и выявленный при этом аллель устойчивости не связан с геном Lanrl.

Кроме сорта Миртан и образца БГБ-6, относительно высокой устойчивостью к антракнозу, обусловленной наличием в генотипах растений блока из нескольких неаллельных генов Rcl , обладает сорт Першацвет. Гены устойчивости к антракнозу, характерные для этого сорта, по всей видимости, неаллельны Lanrl , что согласуется с результатами настоящих исследований, в которых для сорта Першацвет не наблюдали устойчивость к антракнозу по маркерным аллелям, сцепленным с геном Lanrl . Следует отметить, что аллели восприимчивости выявили у остальных белорусских образцов люпина узколистного, которые не имели близкородственных связей с австралийскими сортами Wonga и Tanjil. R-аллели маркеров An-Seq3 и AnSeq4 были также обнаружены у австралийской селекционной линии Walan 2248. Этот факт отражает результаты программы селекции на устойчивость к антракнозу, реализуемой в Австралии при создании сортов узколистного люпина.

В целом оказалось, что ДНК-маркеры AnSeq3 и AnSeq4 позволяют достаточно эффективно выявлять устойчивые и восприимчивые к антракнозу генотипы по гену Lanrl . Так, для 50 сортов и селекционных образцов люпина узколистного неоднозначная информация по аллелям изученных маркеров была получена только у сорта Миртан. Эти результаты подтвердили необходимость предварительного анализа применимости ДНК-маркеров при широкомасштабных скрещиваниях, так как использование «ложноположительных» маркерных аллелей может привести к ошибкам при выборе устойчивых к антракнозу растений.

Стабильно высокая устойчивость сортов Tanjil, Wonga, несущих ген Lanrl , подтверждена в различных условиях испытаний (4, 5, 12). Поэтому включение гена Lanrl в генотипы новых сортов, полученных после скрещивания белорусского или российского селекционного материала с устойчивыми к антракнозу австралийскими образцами, способно повысить общую устойчивость к заболеванию. Для индивидуального, высокоточного и быстрого отбора генотипов, содержащих ген Lanrl , могут быть применены соответствующие ДНК-маркеры.

Таким образом, при изучении образцов люпина узколистного (Lu-pinus angustifolius L.) разного происхождения у сортов российской и польской селекции не были обнаружены аллели устойчивости к антракнозу по маркерам AnSeq3 и AnSeq4, сцепленным с геном Lanrl. У белорусского селекционного образца БГБ-6 аллели устойчивости были выявлены по обоим изученным маркерам AnSeq3 и AnSeq4, для сорта Миртан — только по маркеру AnSeq3. Устойчивый и восприимчивый к антракнозу австралийский селекционный материал использовался в качестве контролей соответствующих аллелей AnSeq3 и AnSeq4. Проведенные исследования показали, что использование ДНК-маркеров AnSeq3 и AnSeq4, сцепленных с геном Lanrl, может быть полезно в селекции российских и белорусских сортов, несущих ген Lanrl устойчивости к антракнозу. В то же время при широкомасштабных скрещиваниях необходимо предварительно оценивать применимость выбранных ДНК-маркеров, так как использование «ложноположительных» маркерных аллелей может привести к ошибкам при отборе устойчивых к антракнозу растений.