Идентификация метаболитов с антиоксидантными свойствами в листьях овощного амаранта (Amaranthus tricolor L.)

Амарант (род Amaranthus ) используется населением многих стран мира как зерновая, овощная и лекарственная культура. На африканском континенте листья овощных видов амаранта служат дополнительным источником полноценного белка, сбалансированного по незаменимым аминокислотам (1). Листья и молодые растения овощного амаранта в Индонезии, Китае, Индии, странах Юго-Восточной Азии — основной продукт,

^∗ Исследование проводится в рамках темы ¹ 0575-2017-0001, поддержанной программой развития биоресурсных коллекций ФАНО России.

обогащающий питание населения эссенциальными аминокислотами, биологически активными веществами и антиоксидантами (2, 3). Препараты из растений амаранта широко применяются в фитомедицине. В организме человека они выполняют регуляторные, защитные функции и уменьшают риск развития хронических заболеваний, вызванных свободнорадикальным окислением (4).

В России интродукция овощных видов амаранта с высоким содержанием безглютенового белка и низкомолекулярных антиоксидантов (витамина С, фенольных соединений, беталаиновых пигментов, сквалена) актуальна и необходима для устранения дефицита эссенциальных нутриентов. Детальное изучение состава метаболитов амаранта с антиоксидантными свойствами и широким спектром биологической активности необходимо для разработки функциональных продуктов и напитков на основе его листьев (5). Овощные виды амаранта также считаются ценной лекарственной культурой из-за высокого содержания бетацианинов, аскорбиновой кислоты, фенольных соединений и антиоксидантов иной природы (6). Доказаны антидиабетические (6-8), гепатопротекторные (9, 10), гастропро-текторные (11), противоопухолевые (12), антимикробные (13, 14) свойства экстрактов из листьев амаранта Amaranthus tricolor L .

Применение таких современных аналитических методов, как масс-спектрометрия и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), позволяет выявлять компоненты, не обнаруженные ранее при оценке пищевой и фармакологической ценности растительного сырья, чтобы разрабатывать на его основе инновационные биологически активные растительные препараты и продукты (15, 16).

В настоящей работе в листьях у овощного амаранта сорта Валентина мы впервые идентифицировали 37 метаболитов с антиоксидантными свойствами, относящихся к разным классам соединений (органические кислоты, сахара и их производные, фенолы, тритерпены, аминокислоты). Это расширяет возможности применения листьев амаранта для создания функциональных продуктов, проявляющих антистрессовую активность.

Цель нашего исследования заключалась в оценке качественного состава метаболитов в водных и спиртовых экстрактах листьев амаранта и накопления основных антиоксидантов в органах растений, выращенных в Московской области .

Методика . Материалом служили сырые и высушенные листья, соцветия, стебли, жилки, черешки и корень овощного амаранта ( Amaranthus tricolor L.) сорта Валентина (оригинатор — Всероссийский НИИ селекции и семеноводства овощных культур, ВНИИССОК, Московская обл.), а также биологически активная добавка фиточай «Амарантил», полученная из листьев амаранта сорта Валентина (ВНИИССОК, Россия). Растения выращивали в открытом грунте на опытных полях ВНИИССОК в 20152017 годах. Для изучения брали листья разного возраста: ювенильные, с полностью сформированной листовой пластинкой, старые. Свежий материал помещали в гомогенизатор, образцы готовили в соответствии с методиками для каждого вида исследований. Высушенные образцы измельчали в мельнице до размера частиц 1-2 мм. Использовали водные и спиртовые экстракты из свежего и высушенного растительного материала.

Количество амарантина в водных экстрактах определяли с учетом молярного коэффициента экстинкции 5,66½104 л•моль-1•см-1 и молярной массы 726,6 г•моль-1 (17). Концентрацию восстановленной формы аскорбиновой кислоты (АК) оценивали йодометрическим методом, основанным на титровании АК в экстрактах, окрашенных йодатом калия в кислой среде в присутствии йодистого калия и крахмала (18). Суммарное содержание антиоксидантов (ССА) в водном и спиртовом экстрактах определяли амперометрически (19), результат выражали в эквивалентах галловой кислоты (мг-экв. ГК/г).

Образцы измельчали в гомогенизаторе в присутствии экстрагирующих жидкостей (бидистиллированная вода или 96 % этиловый спирт) при температуре 20-25 °С. Гомогенаты центрифугировали 15 мин при 10000 g и 4 °C. Аликвоту супернатанта использовали для определения содержания антиоксидантов, при необходимости разбавляя. Измерения проводили на приборе Цвет-Яуза 01-АА (НПО «Химавтоматика», Россия) в режиме постоянного тока.

Во фракциях, полученных из сухих соцветий, листьев и стеблей, определяли содержание простых фенолов и оксибензойных кислот, окси-коричных кислот и их эфиров, флавоноидов, конденсированных и полимерных полифенолов (20).

Спектральные характеристики растворов измеряли на спектрофотометре Helios Gamma («Thermo Electron Corporation», США) при X = 200600 нм. Количество хлорогеновой, галловой, феруловой кислот и арбутина в водном экстракте из добавки фиточай «Амарантил» определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на жидкостном хроматографе KNAUER («KNAUER Wissenschaftliche Ger a te GmbH», Германия). Использовали колонку с обращенной фазой длиной 150 мм, заполненную сорбентом Диасфер 110-С18 (Россия); зернение 5 мкм, элюент — смесь 0,03 % трифторуксусная кислота: ацетонитрил (70:30). Пики идентифицировали по времени удерживания, содержание индивидуальных веществ определяли при сравнении с градуировочным растворам. Качественный анализ метаболитов выполняли методом газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ/МС) на хроматографе JMS-Q1050GC («JEOL Ltd», Япония). Использовали капиллярную колонку DB-5HT («Agilent», США; длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,52 мкм; газ-носитель — гелий). Температурный градиент — от 40 до 300 °С, температура инжектора и интерфейса 280 °С, ионного источника — 200 °С. Скорость потока газа в колонке 2,0 мл/мин, время анализа 45 мин, режим ввода с делением потока, объем вводимой пробы 1 мкл. Для определения веществ проводили дериватизацию с использованием силилирующего агента N,O-бис(триметилсилил)трифторацетамида (БСТФА) (21). Идентификацию веществ осуществляли по параметрам удерживания и масс-спектрам библиотеки NIST-5 National Institute of Standards and Technology (США). Диапазон сканирования 33-900 m/z.

Все измерения проводили в трех повторностях, в таблицах представлены средние значения ( X ) и их стандартные отклонения (± x ).

Результаты. Характерная особенность листьев A. tricolor L. сорта Валентина — красная окраска разной интенсивности, которая зависит от их возраста и определяется количеством пигмента амарантина, обнаруженного во всех исследованных органах растения (листья, корни, черешки, стебли, соцветия). Водные экстракты разновозрастных листьев амаранта различались по содержанию основных метаболитов с антиоксидантными свойствами — амарантина, аскорбиновой кислоты каротиноидов (табл. 1). В ювенильных листьях аккумулировалось максимальное количество амаран-тина, содержание которого по мере роста и старения листовой пластинке снижалось. Аскорбиновая кислота преимущественно накапливалась в активно фотосинтезирующих листьях с полностью оформленной пластинкой, в стареющих — ее количество уменьшалось. В ювенильных листьях также отмечалась тенденция к повышению содержания аскорбиновой кислоты.

1. Содержание метаболитов-антиоксидантов в органах у растений амаранта ( Amaranthus tricolor L.) сорта Валентина ( X ± x , Всероссийский НИИ селекции и семеноводства овощных культур, Московская обл., 2015 год)

Орган	¹ листа (снизу вверх)	Содержание		Суммарное содержание антиоксидантов,
		аскорбиновая кислота, мг%	амарантин, мг/г сырой массы
				мг-экв.	ГК/г сырой массы
Старые листья	1	161±15,0	0,26±0,02		2,32±0,11
	2	186±15,0	0,29±0,02		2,30±0,11
	3	176±15,0	0,44±0,05		2,25±0,11
Листья с оформленной	4	230±15,0	0,48±0,05		2,26±0,11
пластинкой	5	202±15,0	0,51±0,05		2,20±0,11
	6	216±15,0	0,57±0,05		2,21±0,11
Листья с неоформленной	7	149±15,0	0,55±0,05		1,81±0,10
пластинкой и ювенильные	8	133±15,0	0,72±0,05		2,00±0,11
	9 10	167±15,0	0,94±0,05		2,11±0,11
Жилка листа Черешки листьев	11	17±1,5	0,31±0,02 0,79±0,05		0,70±0,04 0,69±0,04
Стебель		10±1,5	0,21±0,02		0,43±0,03
Соцветие		130±15,0	0,75±0,05		1,18±0,05
Корень		10±1,5	0,11±0,02		0,45±0,03
П р и м е ч а н и е. ГК — галловая кислота. Пропуски означают отсутствие данных.

Поскольку содержание антиоксидантов в органах амаранта различалось, для анализа закономерностей их совместного изменения можно использовать интегральный показатель — суммарное содержание антиоксидантов (19). В молодых листьях с неоформленной пластикой оно оказалось меньше, чем в листьями с полностью оформленной. При этом жилки, черешки, стебли аккумулировали существенно меньше метаболитов с антиоксидантной активностью по сравнению с листьями.

Среди вторичных метаболитов, которые синтезируются в овощных растениях, биологической активностью выделяется группа фенольных соединений — веществ ароматической природы (13). Мы установили, что в листьях и плодах овощных и пряно-вкусовых растений широко распространены простые фенолы — оксибензойные, оксикоричные кислоты и их сложные эфиры, флавоноиды, полимерные и конденсированные полифенолы (20, 21). Роль вторичных метаболитов в растениях еще недостаточно изучена. Известно, что они обусловливают лекарственные и ядовитые свойства, участвуют в защите от биотических стрессоров, а также во взаимодействиях растений между собой и с другими организмами, в процессах размножения (окраска, запах цветков и плодов) (22). В листьях амаранта значительную долю фенольных соединений составляли флавоноиды (табл. 2).

2. Фракционный состав и содержание (% на абсолютно сухую массу) фенольных соединений (ФС) в соцветиях, листьях и стеблях у растений амаранта ( Amaranthus tricolor L.) сорта Валентина ( X ± x , Всероссийский НИИ селекции и семеноводства овощных культур, Московская обл., 2015 год)

Орган	Сумма ФС	Простые фенольные соединения и окси-бензойные кислоты	Оксикоричные кислоты и их эфиры	Флавоноиды	Конденсированные и полимерные ФС
Соцветия	5,52	0,55±0,05	0,09±0,01	3,94±0,11	0,94±0,11
Листья	5,47	0,43±0,05	0,09±0,01	4,21±0,11	0,74±0,11
Стебель	3,23	0,32±0,05	0,05±0,01	0,52±0,11	2,34±0,11

Содержание флавоноидов в листьях амаранта сравнимо с их количеством в лекарственных растениях (22). В соцветиях было обнаружено меньше флавоноидов и оксикоричных кислот, чем в листьях. Экстракты стебля имели минимальное содержание флавоноидов, но более высокие показатели по конденсированным и полимерным фенолам по сравнению с соцветием и листьями. В экстрактах из свежих листьев амаранта были обнаружены следующие физиологически активные вещества с антиоксили-тельной активностью: амарантин, аскорбиновая кислота, флаваноиды, про- стые фенолы и фенолкарбоновые кислоты.

Рис. 1. Спектральные кривые поглощения водных экстрактов из листьев амаранта ( Amaranthus tricolor L.) сорта Валентина (фиточай «Амарантил») (1) и выделенного из них пигмента амарантина (2) (Всероссийский НИИ селекции и семеноводства овощных культур, Московская обл., 2016 год).

На спектральной кривой экстракта из биологически активной пищевой добавки (фиточай «Амарантил») выделялись три максимума поглощения — 250-270, 325 и 540 нм (рис. 1), что свидетельствует о наличии компонентов фенольной природы. Один из максимумов (X = 540 нм) совпадал с максимумом для пигмента амарантина, полученного из листьев.

Рис. 2. Хроматографические профили водного экстракта из листьев амаранта ( Amaranthus tricolor L.) сорта Валентина (фиточай «Амарантил») при λ = 325 нм (А) , стандарта галловой кислоты при λ = 268 нм (Б) , стандартной смеси арбутина, хлорогеновой и феруловой кислот при λ = 325 нм (В) , пигмента амарантина при λ = 540 нм (Г) : 1 — арбутин, 2 — хлорогеновая кислота, 3 — феруловая кислота, 4 — галловая кислота, 5 — амарантин, 6 — изоамарантин (Всероссийский НИИ селекции и семеноводства овощных культур, Московская обл., 2017 год). Жидкостный хроматограф KNAUER (Германия).

При хроматографическом анализе фенольные соединения в водном экстракте листьев амаранта (фиточай «Амарантил») выявляли при 268 и 325 нм. В свежих листьях амаранта обнаружили хлорогеновую, феруловую, галловую кислоты и арбутин (соответственно 2,05±0,10; 0,01; 1,51±0,04 и 473±20 мкг/мл), а также неидентифицированные соединения с временем удерживания 4-8 мин (рис. 2, А, В). V.B. Gopal с соавт. (23) в водном 1034

экстракте листьев амаранта обнаружили галловую и феруловую кислоты в количестве 0,083 и 0,001 мкг/мл. Галловую кислоту анализировали при X = 268 нм, красный пигмент — при X = 540 нм. В области поглощения красного пигмента определялись два компонента — собственно амарантин и его изомерная форма (изоамарантин) (рис. 2, Г). Спектры амарантина, выявленного методом ВЭЖХ, и стандарта пигмента полностью совпали.

Спиртовая вытяжка из листьев амаранта имела интенсивно-зеленую окраску из-за экстрагируемого хлорофилла. Ее спектр существенно отличался от спектра водного экстракта, особенно в области 350-500 нм и 600-

700 нм (рис. 3). В диапазоне 250-300 нм спектральные кривые водного и спиртового экстрактов были похожи.

Рис. 3. Спектральная кривая поглощения этанольного экстракта листьев амаранта ( Amaranthus tricolor L.) сорта Валентина (Всероссийский НИИ селекции и семеноводства овощных культур, Московская обл., 2017 год).

Следовательно, спиртом из листьев экстрагируется большее количество окрашенных компонентов. Хроматографический анализ этанольного экстракта листьев амаранта также провели на длинах волн 268 и 325 нм. Были обнаружены галловая, хлорогеновая и феруловая кислоты (рис. 4). При минимуме поглощения (см. рис. 3, X = 540) нм регистрировали только пик растворителя.

Рис. 4. Хроматографические профили экстракта листьев амаранта ( Amaranthus tricolor L.) сорта Валентина для анализируемой пробы (А, Б) и стандартной смеси (В, Г) при λ = 268 нм (А, В) и λ = 325 нм (Б, Г): 1 — галловая кислота, 2 — хлорогеновая кислота 3 — ферулловая кислота (Всероссийский НИИ селекции и семеноводства овощных культур, Московская обл., 2017 год). Жидкостный хроматограф KNAUER (Германия).

Полученные нами данные о количественном содержании феноль- ных соединений в листьях Amaranthus tricolor L. расширяют представление о содержании пищевых и лекарственных низкомолекулярных метаболитов в растениях амаранта и дополняют имеющиеся в научной литературе сведения. Все метаболиты, идентифицированные методом ВЭЖХ, — биологически активные вещества, которые проявляли антиоксидантную активность. Фенольные кислоты и бетацианин — амарантин характеризуются антибактериальными (13, 14), антимикотическими, противовоспалительными, ранозаживляющими свойствами (23). Феруловая кислота обладает радиопротекторными свойствами (24), гликозилированный гидрохинон арбутин проявляет антиоксидантную активность (25).

Результаты качественного ГХ/МС-анализа водного и спиртового экстрактов из листьев амаранта иллюстрирует рисунок 5.

Рис. 5. Фрагменты масс-спектров водного (А) и этанольного (Б) экстрактов из листьев амаранта ( Amaranthus tricolor L.) сорта Валентина (Всероссийский НИИ селекции и семеноводства овощных культур, Московская обл., 2017 год). Газовый хромато-масс-спектрометр JMS-Q1050GC («JEOL Ltd», Япония).

На хроматограммах хорошо видны качественные различия между экстрактами по компонентному составу. По библиотечным масс-спектрам было идентифицировано более 30 индивидуальных веществ — 15 в водном экстракте и 19 в спиртовом экстракте, относящихся к разным классам химических соединений (табл. 3).

В экстрактах листьев Amaranthus tricolor были обнаружены шесть органических кислот: в водном — валериановая и коричная, в спиртовом — янтарная, пропеновая, метилмалоновая и рибоновая. Выявлено пять насыщенных жирных кислот липидов: в водном экстракте — миристиновая (C_13:0), пальмитиновая (C_15:0), маргариновая (C_15:0) и стеариновая (C_17:0), в спиртовом — пальмитиновая (C_15:0) и лигноцериновая (C_23:0). Жирные кислоты обладают бактерицидной, вирицидной и фунгицидной активностью, приводящей к подавлению развития патогенной микрофлоры и дрожжевых грибков. Среди неомыляемых липидов к биологически активными веществами относятся фитостеролы. Известно, что сквален (C₃₀Н₅₀) — уникальный фитостерол семян амаранта, участвующий в син-1036

тезе холестерина в качестве его предшественника (26), и активный антиоксидант с антиканцерогенным и ранозаживляющим действием. Адекватное количество потребления сквалена — 400 мг/сут. Сквален служит предшественником ряда ценных фармакологических веществ: сердечных гликозидов, гликоалкалоидов, сапонинов. Сквален, впервые выявленный нами в водном экстракте листьев амаранта сорта Валентина, повышает их фармакологическую ценность.

В водной фракции экстракта листьев амаранта нами идентифицированы пять углеводов: моносахара галактоза и манноза, циклические формы (галактопираноза и фруктофураноза) и кетогексоза тагатоза. В спиртовом экстракте были обнаружены семь углеводов и их циклические формы, производное сахара (глюконовая кислота) и два шестиатомных спирта — инозитол и маннит. Многоатомные спирты проявляют крио- и осмопротекторные свойства в клетке.

• 3.    Метаболиты, выявленные в водном и этанольном экстрактах из листьев амаранта ( Amaranthus tricolor L . ) сорта Валентина методом газовой хромато-масс-спектрометрии (Всероссийский НИИ селекции и семеноводства овощных культур, Московская обл., 2017 год)

  Rt, мин	Соединение	Экстракт
  22:07	Органические кислоты Пропеновая кислота, Acrylic acid, C 3 H 4 O 2	С
  14:04	Янтарная кислота, Succinic acid, C4H4O4	С
  16:34	Метилмалоновая кислота, Monoamidoethyl malonic acid, C4H6O4	С
  20:47	Валериановая кислота, Pentonic acid, СН3 (СН2)СООН	В
  22:41	Рибоновая кислота, Ribonic acid, C5H10O5	С
  22:51	Коричная кислота, Cinnamic acid (Isoferulic acid), C9H8O2	В
  17:51	Жирные кислоты Стеариновая кислота, Octadecanoic (Stearic) acid, С17Н35COOH	В
  19:07	Миристиновая кислота, Myristic acid, С13Н27СООН	В
  23:11	Маргариновая кислота, Heptadecanoic acid, С16Н33СООН	В
  21:15	Пальмитиновая кислота, Hexadecanoic acid, С15Н31СООН	В, С
  36:27	Лигноцериновая кислота, Tetracosanoic acid, С23Н47COOH	С
  18:36	Сахара Рибоза, D-(-)-Ribofuranose, C5H10O5	С
  19:03	Галактопираноза, β -L-Galactopyranose, C6H13O8	В
  19:26	Галактоза, D-Galactose, C6H16O6	В, С
  20:11	Тагатоза, D-(-)Tagatofuranose, C6H12O6	В
  20:36	Фруктоза, D-(-)-Fructofuranose, C5H8O6	С
  20:51	Фруктофураноза, D-(-)-Fructopyranose, C5H8O6	С
  20:55	Глюкофураноза, Glucofuranose, C6H6O6	В
  20:56	Талоза, D-(+)-Talofuranose, C5H12O6	С
  21:28	Манноза, D-Mannopyranose, C6H12O6	В, С
  22:17	Глюкопираноза, β -D-Glucopyranose, C6H6O6	С
  19:43	Производные сахаров Лактон глюконовой кислоты, Gluconic acid γ -lacton, C6H12O7	С
  21:51	Спирты Инозитол, Inositol, C6H12O6	С
  22:07	Маннит, D-Mannitol, C6H12O6	С
  22:08	Сорбитол, D-Sorbitol, C6H14O6	В
  36:06	Другие соединения Сквален, ненасыщенный тритерпен, антиоксидант, Squalen, C30H50	В
  16:48	Пролин, L-Proline, C 3 H 9 NO 2	С
  19:30	D-(+)-Ribono-1,4-lactone	В
  23:06	Бетаин безводный, Methanaminium (Betaine) Glycine	В
  39:57	Риботимидин, 5-Methyluridine, C10H14N2O6	С
  40:31	Витамин Е, (+)- α -Tocopherol	C
  П р и м е ч а н и е.	Rt — время удерживания, В — водный экстракт, С — спиртовой экстракт.

В литературе имеются данные, что моносахара и их производные (спирты, лактоны), накапливаясь в клетке, способны выполнять протекторные функции при действии стресс-факторов. Следует отметить глюкозу, фруктозу, маннозу, манит, инозитол, галактозу, которые проявляют антиоксидантные свойства в клетке при низких температурах. Защитное действие моносахаров обусловлено их способностью неспецифически связывать свободные радикалы, предотвращать развитие перекисного окисле- ния липидов и инактивировать активные формы кислорода (27-30).

В наших опытах в спиртовом экстракте листьев Amaranthus tricolor L . сорта Валентина присутствовал витамин Е, который служит универсальным протектором клеточных мембран от окислительного повреждения, проявляет нейропротекторные, антиоксидантные свойства и снижает риск заболевания раком. Микромолярные количества витамина Е уменьшают активность 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА-редуктазы, отвечающей за синтез холестерина, снижая его количество в организме (31).

Таким образом, комплексный анализ состава метаболитов в листьях амаранта ( Amaranthus tricolor L . ) сорта Валентина показал, что в них присутствуют мощные антиоксиданты — сквален, раннее обнаруженный только в семенах, аскорбиновая кислота, содержание которой сопоставимо с таковым у перца, галловая, а также феруловая, хлорогеновая кислоты, сахара и их производные, тритерпены, бетацианины с антиоксидантной активностью. Фармакологическая ценность идентифицированных метаболитов заключается в их способности снижать риск развития патологий со свободно-радикальной компонентой (сердечно-сосудистых, онкологических, диабета и др.), что позволяет использовать эти природные соединения в антиоксидантной терапии в качестве антистрессоров. Высокое содержание таких метаболитов у изученного сорта, их пищевая и фармакологическая ценность обусловливают его перспективность для применения в пищевых и лекарственных технологиях на основе создания нетоксичных антиоксидантных пищевых добавок, функциональных продуктов (чаев, натуральных красителей, безалкогольных витаминных напитков, кондитерских начинок) и фитопрепаратов на основе листьев и экстрактов из листьев.