Идентификация Pseudomonas cichorii (Swingle 1925) Stapp 1928 в гидропонном производстве салата

Forcitations: Tesic S., Pakina E.N., Ignatov A.N. Identification of Pseudomonas cichorii (Swingle 1925) Stapp 1928 in hydroponic culture of lettuce in Russia. Vegetable crops of Russia. 2021;(3):110-115. (In Russ.)

Салат посевной, латук посевной или салат латук (лат. Lactúca satíva) — вид однолетних травянистых растений рода Латук семейства Астровые (Asteraceae). В качестве овощной культуры возделывается повсеместно в мире, особое развитие в последние годы получило выращивание салата в защищенном грунте при гидропонной технологии выращивания. Салат, как и многие овощные культуры, сильно подвержен различным заболеваниям, среди которых широко распространены бактериальные болезни, являющиеся одной из причин ежегодных потерь урожая [1].

Одним из распространенных патогенов салата является Pseudomonas cichorii – возбудитель бактериозов нескольких важных культурных растений. Pseudomonas cichorii относится к грамотрицательным бактериям, населяющим почву [2]. Он имеет широкий спектр хозяев и из-за своей высокой патогенности может оказывать значительное экономическое влияние на урожайность различных культур, включая салат. Название этого возбудителя происходит от растения Cichorium endivia , на котором он был впервые выделен в качестве фитопатогена [3]. Анализ мультилокусных последовательностей ряда консервативных генов (MultiLocus Sequence Analysis – MLSA) показал высокое генетическое разнообразие в популяции штаммов P. cichorii. Это генетическое разнообразие связано со специализацией ряда клональных групп патогена на разных растениях-хозяевах в удаленных географических районах [4].

P. cichorii – широко распространенная бактерия в регионах с высокой влажностью и умеренными температурами, где она наносит серьезный ущерб на многих культурах – от овощных до зерновых. Патоген включен в Список карантинных вредных организмов в Мексике, в Египте (список А1) и в Иордании (Список А2) [5].

Целью наших исследований было определение возбудителя бактериоза салата, впервые зарегистрированного в гидропонной культуре в 2019-2020 гг. в Хабаровском крае.

Материалы и методы

Исследование проводили на базе департамента Агробиотехнологии АТИ РУДН.

Материал исследований

Образцы были предоставлены коммерческой компанией – производителем салата, выращиваемого на проточной гидропонной линии в условиях минимального заражения микроорганизмами. В начале 2020 года до 30% растений проявляли симптомы почернения основания листьев (Рис. 1) и замедления роста.

Методика опыта

Выделение бактерий из пораженных образцов растений салата проводили методами, описанными в руководстве по определению фитопатогенных бактерий [6]. Листья промывают водой, после чего небольшие фрагменты (4 х 4 мм) размельчают в капле стерильной воды, и гомогенат высевают микробиологической петлей на неселективные агаризованные питательные среды (NBY, YDC, LB) [6]. Инкубацию проводили при 28оC в течение 47 суток. Отдельные колонии бактерий пересевали на диагностические питательные среды, проверяли на чистоту и закладывали на хранение. Для длительного хранения использовали метод криоконсервации в питательном бульоне с глицерином при -80оС.

Для сравнения физиологических признаков и вирулентности бактерий использовали референтные штаммы Pseudomonas cichorii GSPB 2097 (Göttinger Sammlung Phytopathogener Bakterien, Germany), CFPB 2101 (CIRM-Plant Associated Bacteria, France), NCPPB 3802 (National Collection of Plant Pathogenic Bacteria, FERA, UK), и штаммы близкородственных видов рода Pseudomonas: DC3000 (P. syringae pv. tomato), 1845 ( P. syringae pv. syrin-gae ), Pwf6 ( P. marginalis ), полученные из коллекции РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева.

Морфологические, физиологические и биохимические свойства бактерий

Идентификацию бактерий проводили с помощью физиолого-биохимических и молекулярных методов исследования, описанных в руководстве [6]. При первичном отборе фитопатогенных бактерий рода Pseudomonas в качестве критериев выбирают следующие: характеристика колоний (скорость роста, форма, окраска, синезеленая флуоресценция на среде Кинга Б); окраска по Граму; тест на оксидазу, леван, аргинин-дегидролазу; реакция сверхчувствительности (РСЧ) и тест по мацерации тканей ломтика клубня картофеля (пектолитические свойства).

Рис.1. Симптомы бактериоза, вызываемого Pseudomonas cichorii на растениях салата в гидропонной культуре

Fig. 1. Symptoms ofPseudomonas cichoriion lettuce in hydroponic culture

Характеристика колоний

При описании колоний отмечали форму, размер, консистенцию, наличие пигмента колоний или выделение пигмента в среду. Определение Грам-реакции проводили по методу Ryu [7] с использованием водного 3% раствора КОН: 1 каплю наносили на предметное стекло на мазок бактерии. Тянущаяся бактериальная масса за петлей – реакция грамм (-) бактерий, Грамм (+) бактерии остаются без изменений.

В качестве инокулюма для постановки биохимических и физиологических тестов использовали суспензию бактерий (108 КОЕ/мл), приготовленную из 48 - часовой культуры, выращенной при 28оC на питательном агаре Кинга Б [6].

Наличие оксидазы определяли методом Ковача (Кovacs) [8]. Бактерии выращивали на среде с 1% глюкозой. Мазок бактериальной массы помещали на фильтровальную бумагу, пропитанную 1%-ным раствором тетра- метилпарафенилен-диаминодигидрохлорида. Окраска пурпурного цвета через 10 сек указывает на положительную реакцию. Если окрашивание не появляется в течение 60 сек. – реакция отрицательнаяе. Для проведения теста на агринин-дегидролазу: петлей (2–4 мм в диаметре) делали посев 18-часовой микробной культуры в питательные среды, не содержащие аминокислоты (контроль) и содержащие аргинин. Через 48 ч культивирования при 28°С отмечают результаты. Изменение цвета среды с аминокислотой и бромтимоловым синим с оливковозеленого на синий вследствие защелачивания среды образовавшимися аминами (диаминами) или аммиаком свидетельствует соответственно о наличии аргининдегидролазы. Тест на образование левана проводили на среде с 5% сахарозой.

Дополнительные биохимические признаки (наличие каталазы, утилизацию цитрата, гидролиз желатина, крахмала, казеина, редукцию нитрата) определяли стандартными методами [6, 8].

Пектолитические свойства бактерий оценивали по способности размягчать ломтики клубней картофеля. Для этих целей части растений тщательно промывают водой, погружали в 0,5% раствор KMnO 4 на 30 мин., затем промывали стерильной водой и подсушивали. После того как они подсохли, их разрезали скальпелем пополам и на одной из половинок делали насечку, на которую наносили 0,5 мл бактериальной суспензии. Зараженный материал закрывали второй половинкой и помещали во влажную камеру при температуре 28^оC на 48 часов. Реакцию РСЧ определяли инфильтрацией бактериальной суспензии в лист растений табака ( Nicotiana tabacum L. Сорт Samsun NN).

Для оценки вирулентности выделенных бактерий использовали молодые (стадия 5-8 настоящих листьев) растения салата (сорт Кирибати, Rijk Zwaan), эндивия ( Cichorium endivia , сорт Витлуф, ООО Гавриш), капусты пекинской ( Brassica rapa , сорт ТСХА2), моркови (Daucus carota subsp. sativus, сорт Нантская, Седек) и томата ( Solanum lycopersicum , сорт Хурма, ООО Поиск). Растения заражали инфильтрацией бактериальной суспензии в черешок листа.

Молекулярно-генетическая диагностика бактерий

Выделение ДНК

Выделение ДНК из 48-ч культуры бактерий проводили с помощью набора «Проба-ГС» («ДНК-технология», Москва) согласно рекомендациям производителя. Концентрацию и чистоту ДНК исследуют при проведении электрофореза на агарозном геле с использованием в качестве стандарта ДНК маркера (100 bp Fermentas).

Секвенирование ПЦР-фрагментов и анализ нуклеотидных последовательностей

Для амплификации ДНК неизвестных штаммов использовали универсальные праймеры 8UA/519B на участок гена 16S рРНК, которые амплифицируют продукт 500 п.о. [9, 10]. Синтез праймеров проводили в ЗАО «Синтол», Москва. Реакцию ПЦР проводили в ДНК-амплификаторе «StepOne (ThermoFisher Co., США)». Для амплификации ДНК с праймерами 8UA/519B, смесь реактивов для постановки одной реакции объемом 25 мкл содержала: 5 мкл 10x ПЦР буфера MagMix (ООО «Диалат Лтд», Москва), 20пМ каждого праймера, и 20 нг целевой ДНК.

Температурно-временные параметры амплификации для праймеров 8UA/519B включали пре-денатурацию 96 – 15 мин, далее 35 циклов, состоящих из денатурации 95оC – 15 сек, отжига праймеров 55 – 30 сек, элонгации 72оC – 30 сек; после завершения циклической амплификации – досинтез ДНК при 72оC – 10 мин и хранение до выключения амплификатора – при +4оC .

Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 1% агарозном геле с добавлением бромистого этидия (1 мкг/мл) при напряженности электрического поля 5 В/см. Для фиксации полученных данных использовали установку гель-документации BioDoc II. Секвенирование продуктов амплификации проводили в прямом и обратном направлениях по методу Сэнгера на базе ЗАО “Евроген” (Москва).

Редактирование полученных сиквенсных спектрограмм проводили с помощью программы BioEdit Sequence Alignment Editor 7.1.3.0 [11]. Нуклеотидные последовательности участков генов изучаемых видов были проанализированы с помощью и базы данных NCBI и программного обеспечения «BioEdit».

Филогенетическое дерево для фрагмента гена 16S rRNA было построено при помощи программы MEGA-X [12].

Результаты и обсуждение

Из свежесобранных листьев салата с симптомами почернения основания листьев (рис. 1) выделяли предполагаемых патогенов на питательных средах Кинга Б, Чапека-Доусона, YDC, LB, NBY [6, 13]. На всех питательных средах наблюдали рост бактериальных колоний, причем доминировали (>90%) колонии серо-белого цвета, круглые, плоские, дающие водорастворимый сине-зеленый флуоресцентный пигмент на среде Кинга Б.

Для фитопатогенных псевдомонад в качестве надежного метода идентификации основных групп патогенов применяю LOPAT (Levan, Oxidase, Potato, Arginine, Tobacco - тест на синтез Левана, образование Оксидазы, мацерацию тканей ломтика клубня картофеля, тест на аргинин-дегидролазу и реакция сверхчувствительности (РСЧ) на табаке). По ключевым биохимическим признакам теста LOPAT (-,+,-,-,+) [13], проведенного для 12 изоля-тов бактерий из салата, сходных с большинством колоний по морфологическим признакам, бактерии принадлежали Группе III рода Pseudomonas ( P. cichorii , EPPO Code: PSDMCI) (Табл. 1).

Все изоляты были положительны по синтезу левана на среде с сахарозой, положительны в тесте на оксидазу, отрицательны в тесте на ломтиках картофеля (пектолити-ческие свойства), и в реакции на аргининдегидролазу. Все изоляты давали СРЧ на растениях табака в течении 12 часов после инфильтрации суспензии бактерий в лист растений.

Оценка вирулентности выделенных изолятов на ряде других культурных растений (эндивий, Пекинская капуста, морковь и томат) (Табл. 2), показала, что бактерии были более агрессивны (вирулентны) по отношению к салату, чем к другим растениям. и однородность их биохимических признаков, отличающих P. cichorii от близких видов рода Pseudomonas (Табл. 3) показали, что они представляют группу бактерий, специализированных на салате.

Таблица 1. Признаки LOPAT [6, 13] для выделенных изолятов и типовых культур Pseudomonas cichorii, P. syringae и P. marginalis Table 1. LOPAT traits [6, 13] for isolates and type cultures of Pseudomonas cichorii, P. syringae, and P. marginalis

Изолят, штамм.	Растение	Тесты
Pc 01	Салат	L*	O	P	A	T
Pc 02	-	-	+	-	-	+
Pc 03	-	-	+			+
Pc 04	-	-	+	-	-	+
Pc 05	-	-	+	-		+
Pc 06	-	-	+	-	-	+
Pc 07	-	-	+	-		+
Pc 08	-	-	+ +	-	-	+
Pc 09	-	-	+			+
Pc 10	-	-	+	-	-	+
Pc 11	-	-	+	-		+
Pc 12	-	-	+	-	-	+
GSPB 2097	Салат, типовой штамм P. cichorii	-	+	-		+
CFPB 2101	-	-	+	-	-	+
NCPPB 3802	Томат, типовой штамм P. cichorii	-	+	-		+
DC3000	Томат, типовой штамм P. syringae pv. tomato	+	-	-	-	+
1845	Подсолнечник, референтный штамм P. syringae	+	-	-	-	+
Pwf6	Картофель, референтный штамм P. marginalis	+	+	+	+	+

• *L: леван на среде с сахарозой, O: оксидаза, P: реакция ломтиков картофеля, A: аргинин, T: РСЧ на листьях табака

+, наличие признака, -, отсутствие признака

Таблица 2. Реакция выделенных изолятов и типовых культур Pseudomonas cichorii при заражении некоторых культурных растений Table 2. Reaction of isolates and typical cultures of Pseudomonas cichorii by infection of some cultivated plants

Изолят, штамм	Исходное растение:	Салат	Эндивий	Пекинская капуста	Морковь	Томат
Pc 01	Салат	+++	+	+	+	+
Pc 02	-	+++	+++	+	+	+
Pc 03	-	+++	+	+	+	+
Pc 04	-	+++	+	+	+	+
Pc 05	-	+++	+	+	+	+
Pc 06	-	+++	+	+	+	+
Pc 07	-	+++	+	+	+	+
Pc 08	-	+++	+	+	+	+
Pc 09	-	+++	+	+	+	+
Pc 10	-	+++	+	+	+	+
Pc 11	-	+++	+	+	+	+
Pc 12	-	+	+	+	+	+
GSPB 2097	Салат	++	++	++	+	++
CFPB 2101	-	++	++	++	+	++
NCPPB 3802	Томат	-	+	++	+	+++

+, слабовирулентен

++, средневирулентен +++, сильновирулентен

Таблица 3. Диагностические биохимические признаки выделенных изолятов и типовых культур Pseudomonas cichorii Table 3. Diagnostic biochemical signs of isolates and type cultures of Pseudomonas cichorii

Изолят, штамм	Каталаза	Цитрат	Желатин	Редукция нитрата	Казеин	Крахмал
Pc 01	+	-	-	-	-	-
Pc 02	+	-	-	-	-	-
Pc 03	+	-	-	-	-	-
Pc 04	+	-	-	-	-	-
Pc 05	+	-	-	-	-	-
Pc 06	+	-	-	-	-	-
Pc 07	+	-	-	-	-	-
Pc 08	+	-	-	-	-	-
Pc 09	+	-	-	-	-	-
Pc 10	+	-	-	-	-	-
Pc 11	+	-	-	-	-	-
Pc 12	+	-	-	-	-	-
GSPB 2097	+	-	-	-	-	-
CFPB 2101	+	-	-	-	-	-
NCPPB 3802	+	-	----

+, наличие признака,

-, отсутствие признака

Четыре изолята (01, 04, 06 и 12), показавшие наибольшую агрессивность при проведении РСЧ на листьях табака, были использованы для ПЦР амплификации фрагмента гена 16S рРНК (c праймерами 8UA/519B) и для них был получен ПЦР продукт ожидаемой длиной около 500 п.о. ПЦР фрагменты были секвенированы и при поиске гомологов в Генбанке показали высокое сходство (99-100%) с ранее депонированными последовательностями Pseudomonas cichorii.

Таким образом, впервые в РФ был обнаружен и идентифицирован патоген салата Pseudomonas cichorii в гидропонной культуре.

Заключение

Особое развитие в последние годы получило выращивание салата в защищенном грунте при гидропонной технологии выращивания. Несмотря на значительные дости-

жения в селекции растений и технологии выращивания салата, в последние годы увеличивается вредоносность бактериозов и других болезней. Появление новых возбудителей болезней в России – в стране с различными климатическими и почвенными условиями и большим разнообразием культурных и диких растений, представляет потенциальную опасность для сельскохозяйственного производства. В нашей работе впервые получено подтверждение распространения вида Pseudomonas cichorii в гидропонной культуре салата в РФ. Хотя, согласно базе данных Европейской Организации Карантина и Защиты Растений (EPPO, ЕОЗКР), P. cichorii был впервые описан в России в 1965 году на основании микробиологических методов идентификации, выделенные изоляты бактерии недоступны в коллекциях для подтверждения данного вывода современными диагностическими методами. В

10         20         30         40         50         60         70         80         90        100

....|.... I....I....I.... I.... I....I....I....I....I.... I.... I....I....I....I....I....I.... I.... I.... I

ENA|AB021398.1 P. Cichorii     ATGCAAGTCGGGCGGCAGCACAGGTACTTGTACCGGGTGGCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGCTCG

Pseudomonas cichorii 12        ATGCAAGTCGGGCGGCAGCACAGGTACTTGTACCGGGTGGCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGCTCG

110 120 130 140 150 160 170 180 190 200

.... I....I....I .... I .... I .... I .... I .... I....I....I.... I .... I ....I .... I .... I .... I .... I .... I .... I .... I ENA|AB021398.1 P. Cichorii GAAACGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGA Pseudomonas cichorii 12 GAAACGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGA

210 220 230 240 250 260 270 280 290 300

.... I.... I....I.... I.... I.... I....I....I....I....I.... I.... I.... I....I....I.... I....I.... I.... I.... I ENA|AB021398.1 P. cichorii GGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT Pseudomonas cichorii 12 GGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT

310 320 330 340 350 360 370 380 390 400

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| ....I....I....I ENA|AB021398.IP. cichorii GGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGTCG Pseudomonas cichorii 12 GGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGTCG

410 420 430 440 450 460 470 480 490 500

.... I .... I .... I .... I .... I .... I .... I .... I .... I .... I .... I .... I .... I .... I .... I .... I .... I .... I .... I .... I ENA|AB021398.1 P. cichorii TTACCTAATACGTGACGATTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGG Pseudomonas cichorii 12 TTACCTAATACGTGACGATTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGG

ENA|AB021398.1 P. cichorii     AAT

Pseudomonas cichorii 12        AAT

Рис. 2. Выравнивание последовательностей (BIOEDIT) фрагмента гена 16S rRNA, амплифицированного с праймерами 8UA/519B,для изолята Pseudomonas cichoriiРс12 и образца Генбанка ENA|AB021398.1 Pseudomonas cichoriiATCC 10857 Fig. 2. Sequence alignment (BIOEDIT)ofa 16S rRNA gene fragmentamplified with primers 8UA / 519B forPseudomonas cichoriiPc12 isolate and Genbank sample AB021398.1 Pseudomonas cichoriiATCC 10857

AB724289.1:2-1409 Pseudomonas cichorii strain: MAFF 311430

---------- NR 026532.1:28-1435 Pseudomonas cichorii strain PC1

MK356419.1:10-1417 Pseudomonas cichorii strain ICMP 5891

Pseudomonas cichorii 01

Pseudomonas cichorii 06

ENA|AB021398.1 Pseudomonas cichorii ATCC 10857.

Pseudomonas cichorii 12

Pseudomonas cichorii 04

3X913785.1:1-1408 Pseudomonas cichorii strain BC3286

CP007039.1:736028-737435 Pseudomonas cichorii JBC1

MK356431.1:10-1417 Pseudomonas cichorii strain ICMP 4438

--------------------------- MK302219.1:3-1403 Pseudomonas cichorii strain JBRI-MO-0004

-----AB680093.1:28-1435 Pseudomonas syringae strain: NBRC 3508

-------------------1 MK382420.1:10-1417 Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola strain ICMP ТП1 97

CP042804.1:701234-702641 Pseudomonas amygdali pv. tabaci str. ATCC 11528 61

CP020351.1:777147-778554 Pseudomonas amygdali pv. lachrymans strain NM002

----------------- MN752851.1:48-1453 Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca strain KR2-8

1 MK501753.1:34-1439 Pseudomonas cichorii strain B5-2-1

KU923374.1:48-1453 Pseudomonas cichorii strain Pc-Gd-5

----------------- KP295476.1:3-1406 Pseudomonas cichorii strain Msu3A i---------------------------------------------------------1

0.0050

Рис. 3. Эволюционная история фрагмента (500 п.о.) гена 16S rRNA для Российских изолятов Pseudomonas cichorii01,04,06, 12 и образцов генбанка Pseudomonas cichorii и родственных псевдомонад. Дерево получено методом Ближнего Соседа (the Neighbor-Joining method) [14]. Достоверность ветвей оценивалась методом бутстрепа (bootstrap test)(500 посвторений) и показана у узлов дерева [15,16]. Дерево построено при помощи программы MEGA X [12].

то же время, P. cichorii является для стран-импортеров важным регулируемым объектом и наличие его в РФ имеет важное значение для беспроблемного экспорта сельскохозяйственной продукции за рубеж.

Двенадцать изолятов P. cichorii были выделены из пораженных растений, собранных в тепличном комплексе на Дальнем Востоке РФ и изучены по комплексу биохимических признаков и четыре изолята (01, 04, 06 и 12), показавшие наибольшую агрессивность при проведении

РСЧ на листьях табака, были использованы для ПЦР амплификации и секвенирования ДНК фрагмента гена 16S рРНК. Полученные фрагменты ДНК показали высокое сходство (99-100%) с последовательностями P. cicho-rii из Генбанка. Оценка вирулентности выделенных изоля-тов на ряде других культурных растений, и однородность их биохимических признаков показали, что они представляют группу бактерий вида P. cichorii, специализированных на салате.

Об авторах:

Светлана Тешич (Svjetlana Tesic) – магистрант Аграрно-технологического института ФГАОУ ВО РУДН, ,

Aboutthe authors:

Svjetlana Tesic – MSc student, Agrarian and Technological Institute, People’s Friendship University of Russia (RUDN University), ,

Elena N. Pakina – Cand. Sci. (Biology), Ass. Professor, Chair of Agrobiotechnology Department, Agrarian and Technological Institute, People’s Friendship University of Russia (RUDN University), ,

Aleksandr N. Ignatov – Doc. Sci. (Biology), Professor, Agrarian and Technological Institute, People’s Friendship University of Russia (RUDN University), ,