Идентификация российских сортов фестулолиума с использованием микросателлитных маркеров

Фестулолиум ( × Festulolium F . Aschers. et Graebn) – многолетний рыхлокустовой злак озимого типа развития. Выведен на основе межродовой гибридизации различных видов овсяниц и райграса [1]. Растения этой ценной кормовой культуры отличаются высокой продуктивностью и питательностью, интенсивным побегообразованием, отав-ностью, отзывчивостью на удобрения, а также хорошей поедаемостью [2]. По состоянию на 2023 г. в Государственный реестр селекционных достижений, допущенных на территории России, внесено 22 сорта фестулолиума.

Важнейшим направлением использования генетических технологий в растениеводстве является разработка систем молекулярной идентификации ценных сортов и образцов сельскохозяйственных культур [3]. В настоящее время для этих целей успешно применяют различные типы ДНК-маркеров, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР). С их помощью удается избежать ограничений, сопряженных с изучением фенотипических признаков. Так, использование молекулярных маркеров позволяет автоматизировать процесс анализа, а также осуществлять тестирование вне зависимости от фазы развития растений и условий окружающей среды [4]. Полученные с их помощью данные могут использоваться для определения уникальности и однородности сорта, подбора родительских форм для скрещиваний, контроля гибридизации и дифференциации исходного материала [5].

Значительная часть сортов многолетних злаковых трав представляет собой сложногибридные популяции, обладающие высокой генетической гетерогенностью вследствие самонесовместимой перекрестноопылямой природы [6]. С учетом данных особенностей для сортовой идентификации важное значение приобретает выбор подходящей системы маркирования, позволяющей выявить уникальные и воспроизводимые ДНК-профили, характерные для определенного сорта. К одним из наиболее эффективных ДНК-маркеров относятся микросателлитные локусы (SSR – Simple Sequence Repeats), основанные на анализе простых повторяющихся последовательностей ДНК [7]. В исследовательской практике данный тип маркеров успешно использовался для изучения генетической изменчивости многолетних злаковых трав [8; 9], а также идентификации сортов райграса однолетнего, ежи сборной и овсяницы тростниковой [10–13].

Цель настоящего исследования заключалась в молекулярно-генетической идентификации российских сортов фестулолиума (× Festulolium F. Aschers. et Graebn.) с использованием микросателлитных маркеров.

Vestnik of Omsk SAU, 2023, no. 3(51)                                                                     AGRONOMY

Материалы и методы

Объектом исследования служили 10 сортов фестулолиума отечественной селекции (табл. 1). Семенной материал был предоставлен центром коллективного пользования «Биологические коллекции кормовых растений» Федерального научного центра кормопроизводства и агроэкологии имени В.Р. Вильямса (ФНЦ «ВИК им. В.Р. Вильямса»).

Перечень исследуемых сортов фестулолиума

Таблица 1

№ п/п	Название сорта	Оригинатор	Год включения в Госреестр*	Плоидность
1	Аллегро	ФНЦ «ВИК им. В.Р. Вильямса»	2012	4n
2	Пилигрим		2021	4n
3	Айвенго		2022	4n
4	ВИК-90		1997	4n
5	Фест	ФНЦ «ВИК им. В.Р. Вильямса» ООО «Грин Дир»	2012	4n
6	Кафес	ФГБНУ «ФИЦК им. А.Г. Лорха»	2021	4n
7	Синта	Уральский федеральный аграрный научно-исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук	2004	4n
8	Аэлита		–	8n
9	Дебют		2004	4n
10	Изумрудный	Уральский федеральный аграрный научно-исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук ЗАО «НПФ “Российские семена”»	2000	6n

Для выделения ДНК применяли модифицированный SDS-метод [14]. В качестве растительного материала использовали «балк-образцы», сформированные из 30 проростков семян от каждого сорта, выращенных в чашках Петри в течение 7 дней. Качество и количество полученной геномной ДНК определяли с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле и спектрофотометра Nabi Nano Spectrophotometer («MicroDigital Co., Ltd.», Корея).

Анализ сортов фестулолиума осуществляли с помощью шести микросателлитных маркеров (табл. 2), разработанных на основе информации о геноме райграса пастбищного ( Lolium perenne L.) [8; 9; 15; 16].

Таблица 2

Микросателлитные маркеры для анализа сортов фестулолиума

№ п/п	Название	Последовательность (5'-3') F/R	Мотив	Источник
1	LPSSRk02e08	TCTGAAAGCCCGAGTGAGCG CGACTGTGGCAGGGATGACG	[CTT]7	[9]
2	G03_089	TCACCAACACCACACTCCTC GCTGCTCGTACTGCTCGTAG	(CTCC)4	[15]
3	G01_002	CAAGACCAAACCGAGAGAGG TCTCCTCCTCGACTTCCAGA	(AG)7
4	AJ872206	GTGCAGCAGTTTGAATTGGA AGCATCGGGAGCTATGAATG	(GA)14	[16]
5	AJ872228	CCAACTAGACAAAGGGGATTG GGAGAGCACCATTCATCCAT	(TGA)8
6	LP165	CCATCACCTCCACTAT AGCTCGCAGTCTGTTG	(CT)14	[8]

Vestnik of Omsk SAU, 2023, no. 3(51)

AGRONOMY

Общий объем ПЦР-смеси составлял 20 мкл и содержал 1,5х Taq Turbo buffer, 0,2 мМ dNTP mix, 1,5 ед. Taq-ДНК полимеразы, 0,5 мкМ каждого праймера и 30 нг ДНК. Амплификация осуществлялась на приборе Bio-Rad T100 («Bio-Rad», США) при использовании условий, указанных в ранее проведенных исследованиях [8; 9; 15; 16]. Для предварительной детекции фрагментов амплификации использовали электрофорез в 1,6%-ном агарозном геле при 90 V в течение 1,5 часов. Визуализацию результатов осуществляли на приборе GelDoc XR Plus («Bio-Rad», США) с помощью пакета программ Image Lab version (версия 6.0.1) при сравнении с маркером молекулярного веса 100 bp Ladder GeneRuler («Thermo Fisher Scientific», США). Микросателлитные локусы, позволяющие получить отчетливые и воспроизводимые ПЦР-продукты со всеми исследуемыми образцами, отбирали для последующего анализа с использованием системы капиллярного электрофореза Qsep 1 Plus («BiOptic Inc.», Тайвань) и программного обеспечения Q-Analyzer.

Для оценки аллельного состава микросателлитных маркеров составляли бинарные матрицы, где присутствие фрагмента обозначали как «1», а отсутствие – «0». Расчет генетических дистанций между исследуемыми сортами c использованием индекса Dice и их кластеризацию методом ближайших соседей (Neighbor-Joining, NJ) осуществляли с помощью программы DARwin (версия 6.0.21) [17]. Для оценки достоверности результатов кластеризации применяли бутстреп-анализ с использованием 10 000 реплик.

Результаты исследований

Из 6 протестированных SSR-маркеров для последующего анализа с детекцией результатов методом капиллярного электрофореза отобрано 3 SSR-локуса (G03_089, AJ872206, LP165), генерирующих отчетливые и воспроизводимые ампликоны (рис. 1).

Рис. 1. Схематичная электрофореграмма продуктов амплификации образцов фестулолиума с SSR-праймером LP165 по результатам детекции с использованием системы капиллярного электрофореза Qsep1 Plus: 1 – Аллегро; 2 – Пилигрим; 3 – Фест; 4 – Айвенго; 5 – Кафес; 6 – ВИК 90; 7 – Синта; 8 – Аэлита; 9 – Изумрудный; 10 – Дебют; 11 – Маркер молекулярного размера C109200

Vestnik of Omsk SAU, 2023, no. 3(51)

AGRONOMY

В общей сложности с помощью отобранных SSR-маркеров удалось обнаружить 35 аллелей. Их размер варьировал от 86 до 331 п.н. Наибольшим числом аллелей (24) характеризовался SSR-локус AJ872206. В среднем, с использованием одного информативного маркера получили более 11 аллелей (табл. 3).

Таблица 3

Характеристика информативных SSR-локусов в изучаемой выборке сортов фестулолиума

№ п/п	Локус	Число выявленных аллелей	Количество уникальных аллелей	Процент уникальных аллелей	Диапазон длин аллелей, п.н.
1	G03_089	9	2	22,2	220–331
2	AJ872206	24	5	20,8	171–245
3	LP165	2	1	50,0	86–100
Сумма		35	8	–	–
Среднее		11,7	2,7	31,0	–

По результатам генотипирования для исследуемых сортов фестулолиума были рассчитаны генетические дистанции на основе индекса Dice (табл. 4).

Таблица 4

Генетические дистанции между сортами фестулолиума по результатам анализа с использованием SSR-локусов

Сорт	1	2	3	4	5	6	7	8	9
2	0.62	–	–	–	–	–	–	–	–
3	0.54	0.43	–	–	–	–	–	–	–
4	0.52	0.41	0.18	–	–	–	–	–	–
5	0.72	0.43	0.54	0.52	–	–	–	–	–
6	0.64	0.26	0.45	0.43	0.45	–	–	–	–
7	0.59	0.53	0.45	0.43	0.63	0.55	–	–	–
8	0.61	0.54	0.47	0.45	0.65	0.56	0.24	–	–
9	0.88	0.86	0.78	0.76	0.96	0.88	0.83	0.85	–
10	0.61	0.59	0.51	0.49	0.69	0.61	0.56	0.58	0.56

Попарный сравнительный анализ выявил максимальные генетические различия между сортами фестулолиума Фест и Изумрудный (0,96). Напротив, наиболее близкими оказались сорта селекции ФНЦ «ВИК им. В.Р. Вильямса» Айвенго и ВИК 90 – с генетической дистанцией 0,18.

На основании выявленных дистанций между исследуемыми образцами методом ближайших соседей (Neighbor joining method, NJ) построена дендрограмма (рис. 2).

По результатам кластеризации сорта фестулолиума распределились по трем отчетливым кластерам. В первом сгруппировались образцы, обладающие райграсовым морфотипом: ВИК 90, Пилигрим, Айвенго и Фест селекции ФНЦ «ВИК им. В.Р. Вильямса», а также сорт Кафес, полученный в ФИЦ картофеля имени А.Г. Лорха.

Во втором кластере наблюдается объединение сортов Дебют, близкого по своим морфо-биологическим признакам к Lolium perenne L., и Изумрудный, отнесенного по морфотипу к овсянице тростниковой. Оба сорта разработаны селекционерами из Уральского Федерального аграрного научно-исследовательского центра. Помимо Дебюта и Изумрудного в данном кластере с 25%-ной бутстреп-поддержкой расположился сорт райграсового морфотипа Аллегро селекции ФНЦ «ВИК им. В.Р. Вильямса».

В третьем кластере оказались сорта фестулолиума райграсового морфотипа Синта и Аэлита (бутстреп-поддержка 79%), выведенные в Уральском Федеральном аграрном научно-исследовательском центре методом отдаленной гибридизации и полиплоидии.

Vestnik of Omsk SAU, 2023, no. 3(51)                                                                     AGRONOMY

I                                          П                       III

21                               25                 78

Рис. 2. Дендрограмма сортов фестулолима по результатам анализа с микросателлитными маркерами.

Цифровые коды соответствуют обозначениям сортов на рис. 1, римские цифры – номерам выявленных кластеров

В целом, по результатам кластеризации на основе генетических дистанций исследуемый материал распределен в соответствии с происхождением и хозяйственноценными признаками. Сгруппированные в единые кластеры сорта, несмотря на различное происхождение, с высокой вероятностью имеют общую генетическую основу. Данную информацию можно использовать в селекционных программах для создания генетически дивергентных комбинаций для скрещиваний.

Полученные данные о ДНК-профилях сортов фестулолиума были использованы для составления молекулярно-генетических формул (табл. 5), где латинские буквы соответствуют SSR-локусу, а нижний индекс размеру выявленного ПЦР-продукта в парах нуклеотидов.

Таблица 5

Молекулярно-генетические формулы по результатам генотипирования образцов фестулолиума с SSR-маркерами

Маркер	G03_089	LP165	AJ872206
Сорт/Код маркера	А	B	С
Аллегро	A 331, 327, 300 B 100 С 214, 197
Пилигрим	А 331, 300 B 100 С 245*, 239, 232, 231, 218, 214, 197, 192, 188, 184, 178
Фест	A 300 B 100 С 218, 212, 202, 197, 192, 184, 181
Айвенго	A 331, 300 B 100 С 239, 232, 228, 218, 212, 202, 197, 192, 184, 181
Кафес	A 331, 300 B 100 С 232, 231, 226, 220, 218, 208, 203, 188, 184, 181, 176, 170
ВИК 90	A 324, 300 B 100 С 243, 239, 232, 231, 218, 203, 197, 192, 188, 184
Синта	A 324, 300 B 100 С 223, 212, 197, 192, 181, 176
Аэлита	A 327, 300, 220 B 100 С 223, 212, 197, 192, 188, 181, 176, 170
Изумрудный	A 297 B 86 С 231, 228, 214, 212, 202
Дебют	A 324, 300 B 100 С 239, 228, 212, 208, 202, 197

Примечание : жирным начертанием выделены сортоспецифичные ПЦР-продукты.

Vestnik of Omsk SAU, 2023, no. 3(51)

AGRONOMY

C помощью SSR-маркера G03_089 удалось выявить сортоспецифичные аллели для двух сортов: Аэлита и Изумрудный. SSR-локус AJ872206 позволил обнаружить пять сортоспецифичных аллелей для трех сортов (Пилигрим, Кафес, ВИК 90). При амплификации с праймерами, разработанными к маркеру LP165, уникальные аллели не выявлены.

Таким образом, по результатам анализа с SSR-маркерами уникальные ДНК-профили по отдельным комбинациям праймеров удалось выявить для пяти сортов фесту-лолиума (Пилигрим, Кафес, ВИК 90, Аэлита, Изумрудный). Наряду с этим, уникальные спектры по совокупности информативных микросателлитных маркеров обнаружены для всех анализируемых образцов.

Заключение

С использованием набора из шести микросателлитных маркеров осуществлен анализ коллекции российских сортов фестулолиума. По результатам тестирования отобраны три информативных SSR-локуса, с которыми обнаружено 35 аллелей. На базе генетических дистанций установлены филогенетические взаимоотношения между исследуемыми образцами. Уникальные аллели в изучаемой выборке удалось обнаружить для пяти сортов фестулолиума (Пилигрим, Кафес, ВИК 90, Аэлита, Изумрудный) с использованием двух SSR-локусов (G03_089, AJ872206). Полученные в ходе исследования сведения о распределении ДНК-спектров «балк-образцов» фестулолиума послужили основой для составления молекулярно-генетических формул, пригодных для их последующей ДНК-идентификации.

Результаты исследования имеют практическую значимость для использования при сортовой идентификации с целью контроля генетической изменчивости сортов фестулолиума и защиты авторских прав селекционеров.