Иммобилизация о-дифенолоксидазы льна

Введение. Иммобилизация - это процесс прикрепления ферментов к поверхности природных или синтетических материалов, включение их в полимерные материалы, полые волокна и мембранные капсулы, поперечная химическая сшивка. При иммобилизации ферментов происходит стабилизация каталитической активности, т.к. этот процесс препятствует денатурации белков (Кестнер, 1974; Тривен, 1983; Волова, 1999). Сравнительное исследование фермента о-ДФО биотканей льна в растворе и иммобилизованном состоянии важно, поскольку позволит не только получить новые сведения о его биокаталитических свойствах, но и расширить теоретические представления о взаимосвязи структуры и функций ферментов, осуществляющих биокатализ в объме водной фазы и на поверхности раздела (в иммобилизованном состоянии). Помимо этого, иммобилизованную форму фермента можно использовать для создания тест-систем для определения перекисных соединений в продуктах питания, в частности, в льняном масле.

Методика. На две полоски фильтровальной бумаги наносили 10 капель САЧ (сывороточный альбумин человека - коммерческий препарат: концентрация 2,2-10"⁵ М, сухое вещество содержит не более 6% воды по массе), 20 капель экстракта о-ДФО (5,13-10"⁵ М) и дополнительно 10 капель раствора бензидина (1,08-10"³ М). Капли наносили поочередно с последующим высушиванием. Диаметр пятен от капель составил 4-6 мм во всех вариантах нанесения компонентов. Аналогичная методика была применена и для пластин «Sorbfil». Растворы пероксида водорода готовили разбавлением исходного (2,283-10"² М). Концентрация разбавленного раствора составляла

1,083 • 10"2 М, т.е. на три порядка больше концентрации фермента.

Вслед за этим проводили погружение иммобилизованных форм о-ДФО в растворы Н2О2. При окислении бензидина образовывалось восстановленное соединение синего цвета, количество которого определяли фотометрически при Х=540 нм. Затем проводили просушивание и сканирование, с последующим сравнением интенсивности окрашенных зон. Чем больше концентрация пероксида водорода (в интервале (1,083 - 2,283)-10"2 М), тем интенсивнее была окраска пятен. Интенсивность окраски демонстрировала успешность иммобилизации; реакция с участием фермента о-ДФО шла как в объёме водного раствора, так и на твердом носителе, на котором был иммобилизован фермент. При большей концентрации перекиси водорода ферментативная реакция протекала интенсивнее с увеличенным выходом продуктов. Наиболее оптимальным твёрдым носителем были выбраны пластинки «Sorbfil».

Рис. 1 . Внешний вид тестовых систем иммобилизованной о-дифенолоксидазы льна на пластинках «Sorbfil» (а) и фильтровальной бумаге (б)

По разработанной схеме в условиях стационарной кинетики и насыщения фермента субстратом были получены кинетические кривые D-т при ионных силах 0,1 -^0,4 М и проведены расчёты ферментативных параметров kkat и Км. Затем были построены зависимости kkat и Км от ионной силы раствора (I) для сравнения ферментативного поведения иммобилизованного биокатализатора и свободной формы фермента.

Рис. 2. Зависимость Км и kKat от ионной силы (I) раствора

Результаты и обсуждение. Из рис. 2 видно, что при повышении ионной силы до 0,2 М, одновременно возрастают и Км, и к_кат (для иммобилизованной формы). При дальнейшем повышении ионной (М) силы от 0,2 до 0,3 наблюдается снижение указанных значений. Из графика видно, что (1) для иммобилизованной о-ДФО льна оптимальное для проявления каталитических свойств значение ионной силы составляет 0,2 М; (2) графики изменений значений и Км, и k_Kat для иммобилизованной формы о-ДФО льна расположены выше графиков изменений значений К_м и k_Kat для водорастворимой формы биокатализатора. Это свидетельствует о худшем взамимодействии фермента с субстратом для иммобилизованной формы в сравнении с водорастворимой формой. В то же время биокатализ (k_Kat) идёт значительно (~ в 3 раза) интенсивнее в случае иммобилизованной о-ДФО льна.

Заключение. Иммобилизация трёхкратно усиливает каталитическую активность о-ДФО льна в сравнении с растворимой формой.

Лихуша П.С. Иммобилизация о-дифенооксидазы льна / П.С. Лихуша, Г.П. Лапина // Вести. ТвГУ. Сер. Биология и экология. 2014. № 3. С. 27-30.