Иммуногистохимическая оценка маркеров аутофагии в гиппокампе человека при старении и болезни Альцгеймера

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ / RESEARCH ARTICLES (2).1021                                                           ESU

(2).1021

Процесс аутофагии – высоко консервативный клеточный механизм элиминации поврежденных органелл и макромолекул, приобретает особую важность в ходе возрастных изменений организма для постмитотических популяций клеток, неспособных к обновлению путем деления, в частности для стареющих нейронов [1]. В эукариотических клетках реализуются такие виды этого процесса, как шаперон-индуцированная аутофагия, микроаутофагия, а также, макроаутофагия, которая в контексте развития возрастных и нейродегенеративных изменений мозга считается наиболее значимой [2]. Ключевой характеристикой макроаутофагии (в дальнейшем «аутофагии») является формирование специализированной везикулы, называемой аутофагосомой, вокруг субстрата, подлежащего элиминации и предварительно маркированного при помощи убиквитина. Важно отметить, что реализация одной из наиболее важных задач аутофагии - утилизации поврежденных митохондрий (митофагии) - обеспечивается убиквитином, фосфорилированном в положении Ser65(pS65-Ub). В инициации митофагии ключевую роль играет рецептор наружной мембраны митохондрий TOMM20, обеспечивающий захват аутофагосомой поврежденной митохондрии [3]. Далее инициируется слияние аутофагосомы и лизосомы с образованием аутофаголизосомы, в полости которой осуществляется гидролиз содержимого под действием лизосомальных ферментов [4-5]. Учитывая многоэтапность аутофагии, а также сложный механизм ее регуляции, целесообразно оценивать этот комплексный процесс с помощью маркеров, специфичных для различных его звеньев. Так, маркером ранних стадий аутофагии является аллостерический модулятор-белок Beclin1 - один из ключевых компонентов комплекса PI3K, инициирующего созревание аутофагосомы [6]. Маркером зрелых аутофагосом служит белок LC3b - компонент мембран аутофагосом, обеспечивающий через взаимодействие с адапторными белками, в частности с белком SQSTM1 (p62), селективный захват структур, подлежащих деградации [7-8]. Наконец, маркером лизосом, позволяющим оценить поздние стадии аутофагии, является интегрированный в лизосомальную мембрану рецептор LAMP2, критически важный для процесса слияния аутофагосом и лизосом, дефицит которого приводит к массивному накоплению аутофагосом [9-10].

Особое значение процесс аутофагии приобретает при болезни Альцгеймера (БА), основу морфологических изменений при которой составляют скопления аномальных белков - амилоидных бляшек (Ae) и нейрофибриллярных клубков (тау-белок). БА - самая распространенная форма деменции, составляющая приблизительно 60-70% всех ее случаев [11], является возраст-ассоциированным нейродегенератив-ным заболеванием, клинически проявляющимся прогрессирующим ухудшением памяти, а также развитием когнитивных и моторных нарушений [12]. Отсутствие эффективных методов диагностики и лечения данной патологии определяет БА как серьезную медико-социальную проблему, требующую активного изучения. Известно, что формирование нейрофибриллярных клубков, коррелирующее с развитием когнитивных нарушений при БА, начинается в области трансэнторинальной коры, распространяется на энторинальную кору, зону СА1 гиппокампа и, наконец, в неокортекс [13]. Наибольшая выраженность этих нарушений наблюдается в гиппокампе, что клинически проявляется неуклонным снижением памяти и расстройством высших мозговых функций [14].

Полученные к настоящему времени данные свидетельствуют о том, что разные зоны гиппокампа неодинаково уязвимы к агрегации патологических белков [15]. Так, при анализе волюметрических параметров, выполненном при помощи метода высокопольной МРТ у пациентов с БА, было выявлено снижение тканевого объема в зоне CA1 гиппокампа [14-16], а также в зубчатой извилине [16]. В исследовании D.H. Adler и соавт. (2018) с использованием 3d-анализа МРТ-изображений гиппокампа и последующим окрашиванием серийных гистологических срезов этой структуры показано, что наибольшим изменениям при БА подвержена зона CA1 гиппокампа, а зоны CA2/CA3 менее вовлечены в патологический процесс [17]. Это позволяет рассматривать зону СА1, нейроны которой обеспечивают организацию пространственной и эпизодической памяти, как один из основных участков поражения при БА [12].

Однако, зона CA2 также играет существенную роль в когнитивных процессах [18, 19]. Она имеет решающее значение как для формирования и извлечения воспоминаний, связанных с социальными взаимодействиями, так и для запоминания временной последовательности объектов [18]. Пирамидные нейроны CA2 отличаются от нейронов других зон гиппокампа по морфологии, биофизическим и электрофизиологическим свойствам [20]. Показано, что зона СА2 играет важную роль в координации динамики гиппокампальной нейронной сети [21], и повреждение ее нейронов приводит к дефициту социальной памяти в модели болезни Альцгеймера у мышей [22]. Таким образом, анализ нейродегенерации в этой области в сопоставлении с зоной CA1 важен для понимания патогенеза БА.

Исследование процесса аутофагии при БА было проведено Bodi M. и соавт., 2016 в нейронах зоны СА1 гиппокампа. Его результаты, полученные с использованием иммуноблота, свидетельствуют о повышении уровней LC3 и адаптерного белка SQSTM1/p62, обеспечивающего взаимодействие убиквитинилированной дефектной структуры с LC3b. Однако применение указанного метода не позволяет сделать выводы о возможных зональных изменениях [23]. Информация об аналогичных исследованиях зоны СА2 при нормальном старении и при БА в настоящее время в основных библиографических базах данных отсутствует. Таким образом, распределение маркеров аутофагии в гиппокампе при различных вариантах нейродегенерации требует дополнительного изучения.

ЦЕЛЬ: проведение комплексной оценки аутофагии, а также выявление вероятной гетерогенности изменений этого процесса в различных зонах гиппокампа человека при старении и болезни Альцгеймера.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа была выполнена на базе лаборатории нейроморфологии Института мозга ФГБНУ «Российский центр неврологии и нейронаук». Все этапы исследования соответствуют законодательству Российской Федерации и нормативным документам Российского центра неврологии и нейронаук, а также одобрены локальным этическим комитетом Российского центра неврологии и нейронаук (протокол № 7-2/24 от 02.09.2024).

Был использован аутопсийный материал, полученный при исследовании трупов (n=15) людей, у которых данный диагноз был подтвер- жден клинически и патоморфологически (стадия по Braak 3–4), в возрастной группе более 85 лет (диапазон 85–89 лет). Причиной смерти всех пациентов стала тромбоэмболия легочной артерии, развившаяся на фоне гипертонической болезни в сочетании с постинфарктным или атеросклеротическим кардиосклерозом. В качестве групп сравнения был использован ауто-псийный материал головного мозга в случаях физиологического старения (без БА) старше 85 лет (85–99 лет), умерших по тем же причинам (n=20); аутопсийный материал головного мозга, полученный от людей 35–45 лет с диагнозом внезапной сердечной смерти (n=20).

Для всех трех групп были установлены единые критерии исключения: острый и перенесенный инсульт, хронические неврологические и нервномышечные болезни, заболевания сердечнососудистой и других систем с декомпенсацией (выраженной недостаточностью), острое течение инфекционных, инфекционно-аллергических и аутоиммунных заболеваний, злокачественные опухоли любой локализации III–IV стадии, алкоголизм и наркомания. Кроме того, в исследование не включались умершие с асимптомным гемодинамически значимым атеростенозом церебральных артерий (сужение просвета артерий на 70% и более), а также с артериальной гипертонией 3 степени в анамнезе. Для микроскопического анализа вырезались блоки из области гиппокампа (средняя часть височной доли) размерами: длина – 2–2,5 см, ширина – 1–1,5 см, толщина – 0,5–0,7 см. Полученные фрагменты фиксировались на протяжении 24 часов в 10-процентном нейтральном забуференном формалине, после чего проходили стандартную лабораторную проводку (обезвоживание в спирте, обработка ксилолом) и заливались в парафин.

Для иммуногистохимического исследования на микротоме нарезались срезы толщиной 3 мкм, которые затем помещались на положительно-заряженные предметные стекла SuperFrost Plus (производства Thermo Scientific, США). Далее препараты высушивались в термостате при температуре 48°C в течение 24 часов.

При проведении иммуногистохимии применялись следующие антитела:

• 1.    Антитела к белку Ub (поликлональные; Abcam; США, ab140601; разведение – 1:200), маркирующему в клетке белки, предназначенные для протеасомной деградации;

• 2.    Антитела к белку pS65-Ub (поликлональные; MilliporeSigma; Германия, ABS1513-I; разведение – 1:150), селективно маркирующему поврежденные митохондрии;

• 3.    Антитела к белку SQSTM1 (поликлональные, ThermoFisher, США, PA5-20839; разведение – 1:200); адапторному белку, необходимому для взаимодействия убиквитинилированной дефектной структуры с рецепторами аутофагосом;

• 4.    Антитела к белку TOMM20 (моноклональные; Abcam; США, ab56783; разведение – 1:200), маркеру митохондрий;

• 5.    Антитела к белку Beclin-1 (поликлональные; Abcam; США, ab62557; разведение – 1:100), маркеру предшественника аутофагосомы;

• 6.    Антитела к белку LC3b (поликлональные; Abcam; США, ab243506; разведение – 1:200), маркеру аутофагосом;

• 7.    Антитела к белку LAMP2 (поликлональные; Invitrogen; США, PA1-655; разведение – 1:200), маркеру лизосом.

Для детекции связывания антител использовался полимерный набор визуализации NovoLink на основе пероксидазы (Novolink Polymer Detection Systems, Германия). Микрофотографии препаратов получали с помощью микроскопа Leica DMLB (Германия) и цифровой камеры Leica DC-300 (также Германия, предназначена для фотометрических задач). С использованием программы Leica Qwin 2.7 (Германия) в ядрах и перикарионах 150 нейронов на каждый случай оценивали интенсивность иммунопероксидазной реакции в зонах СА1 и СА2 гиппокампа. На изображениях с помощью графического планшета Wacom (Япония) выделяли тела нейронов и их ядра, после чего вычисляли среднюю яркость выделенной области (в условных единицах – 256 градаций для 8-битного изобра- жения, где 0 соответствует белому, а 255 – черному), вычитая при этом фоновое окрашивание.

Статистическую обработку и визуализацию данных выполняли с использованием программ Statistica 13.0 (Statsoft, США) и GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, Dotmatics, LLC, США). Проверку распределения на нормальность осуществляли по критерию Шапиро–Уилка. Межгрупповые сравнения проводились методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с апостериорным тестом Фишера (LSD). Статистически значимыми считались различия при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При старении в нейронах зоны СА1 гиппокампа уровень убиквитина не отличается от показателя группы молодых пациентов. Наблюдается тенденция к снижению реакции маркера поврежденных митохондрий pS65-Ub, и выраженное снижение количества маркера митохондрий TOMM20. Соотношение pS65-Ub/TOMM20, которые показывает долю поврежденных митохондрий, повышено относительно группы молодых пациентов. Обнаружено выраженное увеличение количества маркера адапторного белка p62/SQSTM-1 без значительного изменения других маркеров аутофагии (маркеры предшественника аутофагосом – Beclin-1 (тенденция к снижению), аутофагосом – LC3b, лизосом – LAMP2) (рис. 1).

При БА в нейронах этой зоны уровень убиквитина не отличается от показателя группы старения. Наблюдается тенденция к увеличению количества маркера поврежденных митохондрий pS65-Ub при сохранении низкого уровня маркера митохондрий TOMM20. Соотношение pS65-Ub/TOMM20, показывающее долю поврежденных митохондрий, сохраняется высоким как в группе старения. Обнаружено достоверное снижение количества маркера предшественника аутофагосом – Beclin-1 и увеличение количества маркера адаптерного белка p62/SQSTM-1, маркеров аутофагосом LC3b и лизосом LAMP2 (рис. 1).

Ub, Hippocampus, CA1

campus, CA1

p62/SQSTM-1, Hippocampus, CA1

Beclin-1, Hippocampus, CA1

LC3b, Hippocampus, CA1

LAMP2, Hippocampus, CA1

Рис. 1. Результаты морфометрического анализа иммуногистохимического распределения маркеров Ub, pS65-Ub, TOMM20, pS65-Ub/TOMM20, p62/SQSTM-1/ Beclin-1, LC3b, LAMP2 в нейронах зоны СА1 гиппокампа

Fig. 1. Results of morphometric analysis of the immunohistochemical distribution of markers Ub, pS65-Ub, TOMM20, pS65-Ub/TOMM20, p62/SQSTM-1/Beclin-1, LC3b, LAMP2 in neurons of the CA1 zone of the hippocampus

При старении в нейронах зоны СА2 гиппокампа наблюдалось увеличение уровня убиквитина. Количество маркера поврежденных митохондрий pS65-Ub достоверно не изменялось. Обнаружено выраженное снижение количества маркера митохондрий TOMM20. Соотношение pS65-Ub/TOMM20, показывающее долю поврежденных митохондрий, повышено относительно группы молодых пациентов. Уровень маркера аутофагосом LC3b снижался. Количество маркеров адаптерного белка p62/SQSTM-1, предшественника аутофагосом Beclin-1 и маркера лизосом LAMP2 достоверно повышалось (рис. 2).

При БА в нейронах этой зоны наблюдалось снижение уровня убиквитина. Количество маркера поврежденных митохондрий pS65-Ub до- стоверно не изменялось при сохранении низкого уровня маркера митохондрий TOMM20. Соотношение pS65-Ub/TOMM20, показывающее долю поврежденных митохондрий, сохраняется высоким как в группе старения. Обнаружено снижение количества адаптерного белка p62/SQSTM-1, предшественника аутофагосом Beclin-1 и маркера лизосом LAMP2. Наблюдалось увеличение уровня маркера аутофагосом LC3b (рис. 2).

Дисфункция митохондрий, проявляющаяся накоплением активных форм кислорода и нарушением энергетического обмена, является одним из основных факторов старения, особенно для нейронов, функционирование которых требует высоких энергетических затрат.

Ub, Hippocampus, CA2

pS65-Ub, Hippocampus, CA2

TOMM20, Hippocampus, CA2

pS65-Ub/TOMM20, Hippo-

p62/SQSTM-1, Hippocampus, CA2

Beclin-1, Hippocampus, CA2

LC3b, Hippocampus, CA2

LAMP2, Hippocampus, CA2

Рис. 2. Результаты морфометрического анализа иммуногистохимического распределения маркеров Ub, pS65-Ub, TOMM20, pS65-Ub/TOMM20, p62/SQSTM-1/ Beclin-1, LC3b, LAMP2 в нейронах зоны СА2 гиппокампа

Fig. 2. Results of morphometric analysis of the immunohistochemical distribution of markers Ub, pS65-Ub, TOMM20, pS65-Ub/TOMM20, p62/SQSTM-1/Beclin-1, LC3b, LAMP2 in neurons of the CA2 zone of the hippocampus

Поддержание клеточного гомеостаза в значительной степени зависит от процесса аутофагии, позволяющего своевременно удалять поврежденные митохондрии. Возраст-зависимое снижение активности этого процесса приводит к накоплению дефектных органелл и увеличению риска развития нейродегенеративных заболеваний [24]. При этом следует иметь в виду, что чрезмерная активация процесса аутофагии также может способствовать энергетической недостаточности и усугублять развитие возраст-зависимых и патологических изменений головного мозга [25].

Результаты настоящего исследования демонстрируют, что в нейронах зоны СА1 гиппокампа при старении не наблюдается изменения концентрации ключевых белков, реализующих функцию аутофагии: маркеров инициации процесса (Beclin-1), аутофагосом (LC3b) и лизосом (LAMP2). Все они остаются на уровне показателей контрольной группы. При этом в нейронах рассматриваемой зоны выявляется повышенное накопление адапторного белка p62/SQSTM-1, который необходим для взаимодействия убик-витинилированной дефектной структуры с рецепторами аутофагосом. Это может быть связано с увеличением количества дефектных структур, подлежащих селективной аутофагии или с недостаточной эффективностью их расщепления. Обращает на себя внимание наблюдаемая тенденция к снижению количества выявляемых маркером pS65-Ub поврежденных митохондрий. Наряду с этим отмечается еще более выраженное снижение общего количества митохондрий

(маркер TOMM20), что приводит к повышению показателя соотношения pS65-Ub/TOMM20. Снижение общего количества митохондрий может определяться как активизацией митофагии (что менее вероятно в связи с вышеотмеченной тенденцией к снижению уровня pS65-Ub), так и понижением активности митогенеза – процесса образования новых митохондрий [26] что, очевидно, зависит в том числе и от нарушений энергетического метаболизма и создает замкнутый круг нарушений.

Установленное данным исследованием отсутствие повышения уровней маркеров аутофагосом и лизосом может указывать на отсутствие блока терминальных этапов аутофагии. Сопоставление этого с результатами о накоплении белка-адаптера аутофагии p62/SQSTM-1 может указывать на то, что недостаточность компенсаторного ответа системы аутофагии обусловлена нарушениями прежде всего на этапе образования аутофагосом.

Помимо вышесказанного, настоящее исследование показало, что пул общего убиквитина, определяемый в зоне СА1 при старении, неизменен относительно молодых пациентов. Поскольку этот показатель включает свободную и конъюгированную фракции, отсутствие его роста не исключает перераспределения между ними. Так в исследовании на лабораторных животных было показано, что при старении мозга происходят изменения в сайтах убиквитинили-рования белков, что приводит к снижению активности убиквитин-протеасомной системы [27]. Это согласуется с предположением об отсутствии устойчивого компенсаторного увеличения резерва убиквитин-протеасомной системы в ответ на накопление дефектных структур.

Таким образом, в нейронах зоны СА1 гиппокампа при старении выявлены изменения маркеров, указывающие на дисбаланс между накоплением дефектных структур (включая поврежденные митохондрии) и снижением реакции систем убиквитинилирования и аутофагии в нейронах зоны СА1.

В этих же нейронах при БА снижен уровень маркера предшественника аутофагосом Beclin-1 по сравнению с группой старения, что может указывать на подавление или истощение основного пути инициации аутофагии. Несмотря на это, количество аутофагосом (маркер LC3b) увеличено, что согласуется с ранее опубликованными данными о повышении уровня LC3b в гомогенате гиппокампа при БА [23]. Такое несоответствие может объясняться несколькими механизмами, которые не исключают друг друга: во-первых, возможна активация Beclin-1-независимых путей образования аутофагосом; во-вторых, накопление аутофагосом возможно вследствие нарушения поздних этапов аутофагии – замедления слияния с лизосомами или снижение деградаци-онной функции лизосом [28].

Количество лизосом (маркер LAMP2) также повышено по сравнению с группой старения. Этот рост может иметь двойственный характер: с одной стороны, он может отражать компенсаторное увеличение лизосомального компонента аутофагии, с другой – накопление поврежденных лизосом, которые становятся субстратом для селективной аутофагии (лизофагии) [29]. Последнее предположение согласуется с данными литературы о нарушении функции лизосом при БА, более того, лизосомы считаются основным местом внутриклеточного накопления токсичного бета-амилоида. Для уточнения этой гипотезы, необходимы дальнейшие исследования функционального состояния лизосомального компартмента.

Общий пул убиквитина в нейронах зоны СА1 при БА остается неизменным по сравнению с группой старения. При этом наблюдается тенденция к повышению количества поврежденных митохондрий, выявляемых маркером pS65-Ub, и выраженное снижение общего количества митохондрий (маркер TOMM20). Как и при старении, увеличение соотношения pS65-Ub/TOMM20 может отражать как увеличение доли поврежденных митохондрий в общем митохондриальном пуле, так и сокращение общего количества функционирующих митохондрий. В отличие от старения, в случае БА наблюдается тенденция к росту абсолютного числа поврежденных митохондрий, что предполагает реальное увеличение нагрузки на механизмы, реализующие митофа-гию. Вместе с тем, накопление белка p62/SQSTM-1, необходимого для взаимодействия убиквитинилированной дефектной структуры с рецепторами аутофагосом, выраженное в большей степени, чем при старении, согласуется с предположением о повышенной нагрузке на систему селективной аутофагии в том числе, за счет увеличения пула дефектных митохондрий.

Таким образом, при БА в нейронах зоны СА1 на фоне высокой нагрузки дефектными структурами очевидно имеет место дизрегуляция аутофагии на нескольких уровнях: наблюдаются снижение Beclin-1-зависимой инициации аутофагии и признаки блока ее терминальных этапов, проявляющиеся накоплением белка p62/SQSTM-1, необходимого для взаимодействия убиквитинилированной дефектной структуры с рецепторами аутофагосом, накоплением аутофагосом и лизосом, что отличает процесс нейродегенерации при БА, от такового при старении нейронов этой зоны гиппокампа.

В нейронах зоны СА2 при старении наблюдается увеличение количества инициирующего аутофагоцитоз Beclin-1 и маркера лизосом LAMP2. Однако, количество зрелых аутофагосом (маркер LC3b) снижается, что может указывать на нарушение процесса образования аутофагосом – несмотря на сигнал к инициации, формирование зрелых аутофагосом, вероятно, неэффективно.

При этом по результатам исследования отмечается увеличение общего пула убиквитина, что может отражать эффективный ответ на клеточный стресс, поскольку убиквитин выступает в роли системы контроля качества, маркируя поврежденные белки (количество которых при патологических условиях возрастает) для дальнейшего распознавания адаптерными белками с целью утилизации в аутофагосомах [27]. Напомним, что в нейронах зоны СА1 такого изменения количества убиквитина при старении не наблю- далось, что может отражать снижение эффективности системы контроля качества при очевидном накоплении дефектных структур. Помимо этого, в нейронах зоны СА2 наблюдается увеличение количества убиквитинилированных структур, маркированных белком p62/SQSTM-1 и предназначенных для взаимодействия с рецепторами аутофагосом, а также повышение доли поврежденных митохондрий (повышение соотношения pS65-Ub/TOMM20 на фоне снижения показателя ТОММ20), что свидетельствует об увеличении нагрузки на систему аутофагии при старении в нейронах зоны СА2 при сопутствующем нарушении энергетического метаболизма.

Таким образом, в нейронах зоны СА2 есть признаки очевидно малоэффективной реакции системы аутофагии на накопление поврежденных структур, в то время как в нейронах зоны СА1 такой реакции не обнаружено. Это позволяет предположить различный характер уязвимости нейронов зон СА1 и СА2 при нейродегенерации, ассоциированной со старением: в СА1 преобладает отсутствие компенсаторного ответа, в СА2 – неэффективность образования аутофагосом.

Реакция регуляторных белков аутофагии в нейронах зоны СА2 при БА отличается от таковой при старении. Уровень белка предшественника аутофагосом Beclin-1 снижен, что соответствует данным о нарушении инициации аутофагии при БА [30]. Однако количество аутофагосом (маркер LC3b), напротив, увеличивается, как и в нейронах зоны СА1 при БА, что может объясняться возможной активацией Beclin-1-независимых путей образования аутофагосом [31], а также замедлением созревания или слияния аутофагосом с лизосомами. В пользу последнего предположения может свидетельствовать снижение лизосомального маркера LAMP2 при БА по сравнению с группой старения. Отсутствие компенсаторного увеличения количества лизосом на фоне сохраняющейся нагрузки может ограничивать терминальный этап аутофагии. В этом случае, рост числа аутофагосом отражает не столько усиление образования, сколько нарушение их эффективной и своевременной деградации.

Пул общего убиквитина снижен по сравнению со группой старения и не отличается от показателей контрольной группы. Аналогичным образом изменяется количество структур, маркированных белком p62/SQSTM-1 для дальнейшего взаимодействия убиквитинилированной дефектной структуры с рецепторами аутофагосом. Это может указывать на отсутствие характерного для физиологического старения накопления убиквитина и субстратов, подлежащих деградации.

Интересны данные, касающиеся деградации поврежденных митохондрий. Количество митохондрий, маркированных pS65-Ub, достоверно не изменяется по отношению к другим исследованным группам и этот показатель характеризуется значительной волатильностью, что, очевидно, требует дополнительных исследований и обсуждений. При этом общее количество митохондрий (маркер TOMM20) снижается, а отношение pS65-Ub/TOMM20 повышается, что свидетельствует о возрастании доли поврежденных митохондрий, направляемых на митофагию, в общем пуле этих структур, аналогично тому, что наблюдается при старении. Указанные изменения свидетельствуют о нарушении энергообеспечения клеточного метаболизма, в том числе и процессов аутофагии.

Таким образом, в нейронах зоны СА2 при БА нарушены, вероятнее всего, поздние этапы аутофагического процесса (слияние аутофагосом с лизосомами и их деградация), тогда как при старении ключевым изменением является снижение образования аутофагосом на фоне компенсаторного увеличении количества лизосом. Очевидно, что это различие должно быть учтено при разработке новых методов терапии. Так, при старении мишенью воздействия может являться процесс образование аутофагосом, в то время как при БА активация этого процесса может привести к патологическому накоплению аутофагосом и акцент должен смещаться на этапы созревания и слияния.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о наличие зональной гетерогенности старения гиппокампа. В нейронах зоны СА2 выявляется компенсаторная реакция системы аутофагии (увеличение маркеров инициации процесса и лизосомального ответа), которая оказывается неэффективной из-за дефекта образования аутофагосом. В нейронах зоны СА1 не обнаружено признаков компенсаторной активации аутофагии в ответ на нагрузку, что приводит к накоплению дефектных структур.

Возможно, именно эти выявляемые различия определяют более выраженные изменения эпизодической и пространственной памяти (СА1) при старении, при относительной более длительной сохранности социальной памяти (СА2). Несмотря на то, что при БА нейроны зон СА1 и СА2 характеризуются рядом общих признаков (снижение Beclin-1-зависимой инициации аутофагии и накопление аутофагосом), зональная специфичность изменений также ярко выражена. Нейроны зон СА1 и СА2 демонстрируют принципиально разные изменения маркеров pS65-Ub, p62/SQSTM-1 и LAMP2, что указывает на гетерогенность патологических процессов. Полученные различия между СА1 и СА2 при БА, безусловно, требуют проведения дополнительных исследований для выяснения причин такой зональной специфичности (разная уязвимость нейронов, особенности регуляции аутофагии, различия в микроокружении) и возможной связи этих молекулярных особенностей с известной селективной уязвимостью зоны СА1 при БА. Выявленные нарушения терминальной стадии аутофагии делают процесс слияния аутофагосом с лизосомами перспективной мишенью для разработки таргетных терапевтических стратегий, направленных на восстановление эффективного клиренса дефектных структур в нейронах.