Иммуногистохимическая верификация экспрессии p53 и bcl-2 в гепатоцитах печени крыс после механической травмы бедра

Введение. Печень играет важную роль в детоксикации вредных веществ и накоплении питательных. Структурно-функциональной единицей печени является печеночная долька, а основными клетками – гепатоциты. При этом гепатоциты периферической, промежуточной и центральной зон печеночной дольки обладают функциональными особенностями [1]. Так, гепатоциты периферической зоны активнее участвуют в процессах накопления питательных веществ и детоксикации вредных. Они сильнее повреждаются при действии токсических агентов. Гепатоциты центральной зоны более активны в процессах экскреции в желчь эндо- и экзогенных соединений. Они больше повреждаются при сердечной недостаточности, ишемии, а также при вирусном гепатите [2].

При ожогах конечностей, механических травмах и интоксикациях развивается воспалительная реакция и происходит выброс цитокинов в кровь. Одной из первых на это, наряду с иммунокомпетентными органами, реагирует печень [3]. В связи с чем изучение сложных механизмов регенеративных и регуляторных процессов, протекающих в печени, а особенно гибели гепатоцитов и регуляции апоптоза после механической травмы конечностей, является крайне актуальным [4].

Апоптоз считается жизненно важным компонентом различных процессов, направленным на поддержание гомеостаза в организме. Взаимосвязь апоптоза и антиапоптоза обеспечивает регуляцию жизнедеятельности клеток организма [5]. Белок bcl-2 обычно рассматривается как ингибитор апоптоза. Антиапоптотическая функция bcl-2 осуществляется за счет образования гетеродимеров с проапоптотическими белками, что способствует предотвращению проап-оптотических эффектов и ингибированию высвобождения цитохрома с последующим каскадом каспаз в клетках [6]. Известно, что на фоне механического воздействия на сегмент конечности происходит нарушение обмена веществ в органах и тканях, приводящий к развитию эндогенной интоксикации и развитию циркуляторно-гипоксических повреждений клеточных структур [7]. Экспрессия bcl-2 способствует выживанию и размножению функционально активных клеток.

Белок p53 является ключевым регулятором клеточного цикла и апоптоза, играя центральную роль в поддержании геномной стабильности. Он функционирует как транскрипционный фактор, активируя экспрессию генов, ответственных за репарацию ДНК, остановку клеточного цикла или запуск апоптоза в случае значительных повреждений генома [8].

Цель исследования. Оценить динамику экспрессии bcl-2 и p53 в гепатоцитах печени крыс после механической травмы бедра.

Материалы и методы. Объектом исследования являлись белые беспородные крысы массой 180–200 г. Животных контрольной (n=5) и опытной групп (n=20) содержали в одинаковых условиях при свободном доступе к воде и пищи. С помощью специальной установки крысам наносили механическую травму бедра, моделирующую высококинетическое повреждение тканей [9]. Все манипуляции выполнялись в соответствии с Федеральным законом № 498-ФЗ от 27.12.2018 «Об ответственном обращении с животными» и правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986). Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет» МЗ РФ (протокол № 3 от 18.03.2021). Группы формировались из общего потока травмированных животных путем рандомизации с помощью случайных чисел: группа I – контрольные животные (n=5); группа II – экспериментальные с механической травмой (n=20).

Забой производили под эфирным наркозом путем декапитации. Для иммуногистохимического исследования брали участок печени размером 0,5×1,5 см через 1, 3, 7, 14 сут после нанесения травмы. Образцы фиксировали в 10 % нейтральном растворе формалина на фосфатном буфере (ООО «Биовитрум», Санкт-Петербург).

Для более детального изучения антиапо-птотических реакций клеточных структур печени использовали иммуногистохимические методы окраски. С помощью меченых моноклональных антител выявляли bcl-2 (ингибитор апоптоза) и p53 (индуктор апоптоза). Окрашивание осуществляли согласно рекомендациям фирмы-производителя. Визуализацию результатов проводили с использованием системы детекции Ultra Vision ONE Detection System HRP Polymer. Препараты инкубировали с хромогеном DAV Plus Substrate System. Срезы докрашивали гематоксилином Майера и заключали в среду BioMount. Для оценки качества реакции использовали стекла с позитивным контролем для каждого из антигенов (Labvision, США). При оценке экспрессии bcl-2 и p53 оценивали количество имму-нопозитивных клеток на площади среза (10 000 мкм2). Подсчет клеток проводили на 30 полях зрения для каждой зоны и срока.

Статистическую обработку данных производили в пакете прикладных программ Statistica v. 7.0 (StatSoftInc, США). Вид распределения признаков в группах оценивали с помощью критерия Шапиро – Уилка. Сравнение данных, подчиняющихся закону нормального распределения, проводили с помощью параметрических методов (t-критерий Стьюдента – метод группирования выборок с наименее значимой разницей (Least Significant Difference method, LSD)). В случае ненормального распределения использовали непараметрические методы (U-критерий Манна – Уитни для парных сравнений и критерий Краскела – Уоллиса для множественного сравнения). Различия считали статистически значимыми с учетом поправки Бонферрони при р=0,008.

Результаты и обсуждение. Иммуногистохимический анализ показал, что у животных через одни сутки после нанесения механической травмы наблюдается увеличение экспрессии белка bcl-2: в центральной зоне дольки печени – на 130 %, промежуточной – на 145 %, в периферической – на 130 %. Доказано, что избыточная экспрессия bcl-2 обеспечивает выраженный гепа-топротекторный эффект и поддержание функциональной активности гепатоцитов печени крыс [10]. При оценке картины в динамике через трое суток отмечено снижение экспрессии bcl-2 во всех зонах дольки: в центральной – на 56 %, в промежуточной – на 53 %, в периферической – на 73 %. Через 7 сут во всех зонах дольки печени зафиксирована тенденция к увеличению количества помеченных маркером клеток. Через 14 сут наблюдается снижение показателей экспрессии маркера по сравнению с первыми сутками, что свидетельствует о низкой вероятности запуска апоптоза и наступлении восстановительного периода (табл. 1, рис. 1).

Таблица 1

Table 1

Number of bcl-2-positive cells (per 10,000 µm2) in rat liver

Зоны	Контроль Control group	1 сут Day 1	3 сут Day 3	7 сут Day 7	14 сут Day 14
Центральная Сentral zone	11,4±2,08	26,2±0,64	11,5±1,15*	13,7±0,94*	9,3±0,4*
Промежуточная Intermediate zone	11,2±2,1	27,6±0,81	13,1±0,65*	25,4±1,36□	12,9±0,68*▲
Периферическая Peripheral zone	10,3±2,5	23,0±1,68	6,1±0,4*	16,8±0,92*□	8,0±0,41*▲

Количество bcl-2-позитивных клеток (на 10 000 мкм2) в печени крыс

Примечание. Статистически значимые различия по сравнению с: * – 1-и сут, □ – 3-и сут, ▲ – 7-и сут. Метод LSD.

Note. * – the differences are statistically significant compared with Day 1 (p<0.008); □ – the differences are statistically significant compared with Day 3 (p<0.008); ▲ – the differences are statistically significant compared with: Day 7 (p<0.008). LSD Test.

центр / Central KW-H = 68,6; p=0,0000 пром / Intermediate KW-H = 79,6; p=0,0000 периф / Peripheral KW-H = 72,6; p=0,0000

Рис. 1. Количество bcl-2-иммунопозитивных гепатоцитов ( на 10 000 мкм² ) различных зон печени на фоне механической травмы бедра в динамике (KW-H - тест Краскела - Уоллиса ( ANOVA ) ; аналогичные результаты получены при использовании метода LSD)

Fig. 1. Number of bcl-2-immunopositive hepatocytes (per 10,000 μm²) in different liver zones against the mechanical thigh injury in dynamics (KW-H – Kruskal-Wallis test (ANOVA). Similar results were obtained with LSD test)

Таблица 2

Table 2

Number of p53-positive cells (per 10,000 µm2) in rat liver

Зона	Контроль Control group	1 сут Day 1	3 сут Day 3	7 сут Day 7	14 сут Day 14
Центральная Central zone	8,2±2,1	12,2±0,44	5,7±0,23▲	14,7±1,01▲□	9,6±0,45▲□ ▼
Промежуточная Intermediate zone	9,2±1,9	19,8±0,81	18,5±0,94	18,7±1,56	13,2±1,19▲□ ▼
Периферическая Peripheral zone	8,6±1,9	5,6±0,32	8,5±0,48▲	10,1±0,68▲□	9,3±0,57▲

Примечание. Статистически значимые различия по сравнению с: ▲ - с 1-и сут, □ - 3-и сут, ▼ - 7-и сут. Метод LSD.

Note. * – the differences are statistically significant compared with Day 1 (p<0.008); □ – the differences are statistically significant compared with Day 3 (p<0.008); ▲ – the differences are statistically significant compared with Day 7 (p<0.008). LSD Test.

центр / Central KW-H = 64,2; p=0,0000 пром / Intermediate KW-H = 15,4; p=0,0015 периф / Peripheral KW-H = 33,0; p=0,0000

Рис. 2. Количество р53-иммуннопозитивных гепатоцитов ( на 10 000 мкм² ) различных зон печени на фоне механической травмы бедра в динамике (KW-H - тест Краскела - Уоллиса ( ANOVA ) ; аналогичные результаты получены при использовании LSD)

Fig. 2. Number of p53-immunopositive hepatocytes (per 10,000 μm²) in different liver zones against mechanical thigh injury in dynamics (KW-H – Kruskal-Wallis test (ANOVA). Similar results were with LSD test)

Заключение. Полученные данные подтверждают, что после механической травмы в печени активируются как про-, так и антиапо-птотические механизмы, обеспечивающие восстановление органа. В начальный период травмы преобладают антиапоптотические процессы, что выражается в резком увеличении

уровня bcl-2 (рис. 3а). Однако через 3 сут он снижается, что может свидетельствовать о переходе к фазе перестройки клеточного состава печени. Через 7 сут наблюдается вторая волна роста концентрации bcl-2, что может быть связано с процессами регенерации (рис. 3б), а через 14 сут – восстановление гомеостаза.

Рис. 3. Иммуногистохимическая реакция bcl-2 и p53 в ткани печени после механической травмы. Снижение цитоплазматической экспрессии bcl-2 в гепатоцитах с 1-х (а) по 7-е сут (б) после воздействия.

Выраженное ядерное окрашивание гепатоцитов антителами к p53 через 1 сут (в) с последующим значительным снижением через 7 сут (г) после воздействия. Объектив ×40, шкала – 30 мкм

Fig. 3. Immunohistochemical reaction of bcl-2 and p53 in liver tissue after mechanical injury. Decreased bcl-2 cytoplasmic expression in hepatocytes is noted from day 1 (a) to day 7 (b) after exposure. Pronounced nuclear staining of hepatocytes with antibodies to p53 is observed in one day (c) with a subsequent significant decrease in seven days (d) after exposure. Magnification ×40, scale – 30 μm

Баланс между bcl-2 и p53 играет ключевую роль в регуляции клеточной гибели и выживания после травмы (рис. 3) [18, 19]. Например, в экспериментальной работе по моделированию эндотоксинового шока у свиней через 6 ч продемонстрировано усиление апоптоза в печени и селезенке на фоне уменьшения содержания bcl-2 [20]. В нашем случае повышение p53 че-

рез 1 сут (рис. 3в) может свидетельствовать о запуске апоптоза поврежденных клеток, а его последующее снижение через 7 сут (рис. 3г) – о завершении активных регенераторных процессов. В совокупности данные изменения указывают на динамическую адаптацию печени к повреждению и последующее восстановление ее клеточного состава.

При иммуногистохимическом анализе экспрессии маркера регулятора апоптоза (p53) наблюдается ее усиление в центральной зоне через 1 сут, через 3 сут отмечается тенденция к снижению, затем резкий подъем уровня p53 через 7 сут и последующее снижение через 14 сут. В промежуточной зоне значительных изменений не зафиксировано, но через 14 сут уровень p53 снижается. В периферической зоне уровень p53 увеличивается через 1 сут, достигает максимума на 7-е сут, а затем постепенно снижается.

Начальное снижение уровня p53 в центральной зоне может свидетельствовать о подавлении апоптоза на ранних сроках повреждения [11]. По-

вышение уровня p53 через 7 сут указывает на активацию стресс-ответа и возможное увеличение апоптоза в ответ на механическое повреждение. Отметим, что при изучении апоптоза и пролиферации печеночных клеток на 1, 2, 5 и 7-е сут после термического ожога 40 % поверхности тела крыс показано, что оба процесса были усилены во все сроки по сравнению с контролем на фоне снижения синтеза белка, что связано с экспрессией ядерного фактора NF-kappaB [12].

В периферической зоне уровень p53 также возрастает, но более плавно, что может свидетельствовать о постепенной адаптации (табл. 2, рис. 2.) [13].

Количество p53-позитивных клеток (на 10 000 мкм2) в печени крыс