Иммуногистохимические критерии прогноза при раке эндометрия

Рак эндометрия (РЭ) занимает первое место в структуре онкогинекологической патологии, темпы роста показателей заболеваемости РЭ значительно выше таковых при других злокачественных опухолях репродуктивной системы у женщин [2, 12, 35]. По данным долгосрочного прогноза, в начале XXI века в большинстве развитых стран мира в структуре заболеваемости женского населения рак эндометрия выйдет на первое место, как это уже произошло в США [1, 5, 28]. По сводным данным Международной федерации акушеров и гинекологов, 5-летней выживаемости при раке тела матки удается добиться только у 67,7 % больных, в то время как 22,4 % пациенток погибают в этот срок наблюдения от прогрессирования опухолевого процесса [6, 9, 22].

Особенностью рака эндометрия является то, что продолжительное время он протекает бессимптомно, и подавляющее большинство пациенток имеют гормонально зависимый вариант опухоли (60–90 %), который развивается на фоне гиперэстрогении, а также на фоне целого комплекса сложных эндокриннометаболических нарушений, в частности патологии овуляторного процесса, нарушений углеводного и липидного обменов [3, 4, 7, 10]. По данным ряда авторов, первый, эстрогензави-симый, путь развития рака эндометрия реализу- ется медленно, характеризуется благоприятным клиническим течением и чувствительностью к гормональной терапии. Второй вариант онкогенеза связан с мутацией генов-супрессоров и характеризуется более агрессивным течением, а также отсутствием чувствительности к гормональной терапии [8, 12]. Такая ситуация требует отбора больных с плохим прогнозом для проведения соответствующего более агрессивного лечения и наблюдения. Однако биологическое поведение опухоли эндометрия остается в достаточной степени непредсказуемым даже для больных с одинаковым распространением опухолевого процесса [13, 14, 36]. В связи с этим в последнее время большое значение придается иммуногистохимическим маркерам для прогноза клинического течения различных новообразований и их исхода. В ряде исследований получены доказательства того, что некоторые из молекулярных маркеров являются независимыми прогностическими показателями [6, 9, 34, 37].

Определение рецепторов эстрогенов и прогестерона в клетках рака эндометрия Ввиду того, что матка является гормонально зависимым органом и клетки эндометрия имеют рецепторы, посредством которых реализуется гормональное воздействие, изучение рецептор- ного аппарата ткани к эстрогену и прогестерону является актуальным. До последнего времени основным методом определения рецепторов эстрогенов и прогестерона был биохимический [1, 5, 9, 33]. Этот метод позволяет получить количественный, усредненный результат наличия рецепторов гормонов в исследуемом тканевом фрагменте, без разграничения этих данных в нормальных клетках желез, стромы эндометрия и опухолевых клетках. В связи с введением в практику методов иммуногистохимии в настоящее время открылись новые возможности для более точного определения рецепторного аппарата и чувствительности опухоли к гормональной терапии. Исследование проводится в замороженных либо парафиновых тканевых срезах с помощью моноклональных антител [10, 14]. Активная форма стероидного гормона проникает через мембрану клетки, в цитоплазме связывается с рецептором, и образовавшийся комплекс переходит в ядро, что определяет специфический ответ клетки; в ядре рецептор, имеющий белковую природу, выявляется иммуногистохимически [2, 7, 32].

По данным различных исследований, рецепторы эстрогенов были обнаружены в нормальном эпителии эндометрия, при этом реакция была более выражена в пролиферативной фазе менструального цикла, чем в секреторной [5, 13, 30]. При определении рецепторов в гиперплазированном эндометрии в большинстве клеток железистой и атипической гиперплазии были выявлены рецепторы как эстрогенов, так и прогестерона [11, 17, 28]. Несколько меньшее количество рецепторов к эстрогену и прогестерону выявляется в опухолевых образцах, клетки стромы содержат относительно большое количество рецепторов прогестерона независимо от состояния эндометрия [8, 26, 31]. Установлено, что содержание рецепторов стероидных гормонов различно в опухолях на фоне гиперплазии эндометрия и атрофичного эндометрия [1, 9, 29]. Обнаружено, что в случаях, когда интраэпителиальная карцинома развивается на фоне атрофического эндометрия, рецепторы к стероидным гормонам определяются достаточно редко [14, 27]. При таком варианте наблюдаются низкие показатели выживаемости и отсутствие эффекта от гормональной терапии, а 3-летняя выживаемость составляет 32–36 % [2, 11, 25]. В тех случаях, когда карцинома развивается на фоне гиперплазированного эндометрия, чаще отмечается положительная реакция на стероидные гормоны, отдаленные результаты в таких случаях лучше – 3-летняя выживаемость достигает 90–94 %, также более высока эффективность гормональной терапии [5, 8, 24]. Особо важное прогностическое значение, по данным ряда авторов, отводится рецепторам прогестерона, так как их наличие в ткани эндометрия значимо влияет на показатели общей и безрецидивной выживаемости [9, 10, 23].

Маркеры пролиферативной активности

Пролиферативная активность является ведущим фактором в механизме злокачественной трансформации клеток и в биологическом поведении уже возникшей опухоли [3, 8, 22]. До последнего времени репродукцию опухолевых клеток исследовали с помощью подсчета митозов, определения митотического режима, цитометрии [5, 9]. Однако в настоящее время существуют новые, более информативные методы для определения особенностей пролиферации клеток злокачественных опухолей [8]. Разработаны 3 основных способа оценки пролиферативной активности: введение больному перед операцией синтетического предшественника ДНК – БДУ (5-бром-2-дезоксиуридина) с последующей иммуногистохимической оценкой; определение антигена Ki-67 и определение ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA). В этом плане наиболее распространенным и перспективным маркером пролиферации является антиген Ki-67, который экспрессируется практически во всех фазах митотического цикла и, соответственно, отражает величину пролиферативного пула [7, 21].

По данным ряда исследований, пролиферативная активность прямо коррелирует со степенью гистологической злокачественности, степенью инвазии, наличием метастазов [3], тогда как имеется обратно пропорциональная связь между уровнем Ki-67 и наличием рецепции к стероидным гормонам [5, 10]. В настоящее время проведено достаточно большое количество исследований, посвященных изучению маркеров пролиферации при различных опухолях [2].

Выявлено, что индекс пролиферации является независимым прогностическим признаком, определяющим вероятность возникновения рецидива, общую и безрецидивную выживаемость [22]. Физиологическая роль антигена Ki-67 в жизни клетки пока еще не ясна. Тем не менее его присутствие на всех активных фазах митотического цикла позволяет использовать данный белок в качестве универсального маркера пролиферации при оценке активности роста злокачественных новообразований. Темп роста опухолевой массы представляет очень важную информацию для определения онкологической сущности опухоли и ее агрессивности. В таких случаях показатель пролиферативной активности ее является одним из решающих факторов, учитываемых при выборе тактики лечения. Кроме того, в настоящее время наряду с оценкой количественных параметров пролиферации началось активное изучение соединений, регулирующих прохождение клеток по митотическому циклу [11, 36]. К таким соединениям относятся циклины и ингибиторы циклинзависимых киназ, которые регулируют переход клеток из пресинтетической фазы G1 в фазу S (синтеза ДНК). Активность циклинзависимой киназы зависит от соответствующего ингибитора таким образом, что при его интенсивном функционировании наступает блок в G1-фазе и индуцируется апоптоз, и, наоборот, при подавлении его активности клетки беспрепятственно двигаются по митотическому циклу [12, 27, 32]. Наиболее изучены следующие ингибиторы циклинза-висимой киназы: р15, р16, р18, р19, р21, р27, р57. По данным литературы, уменьшение экспрессии циклинзависимых киназ обусловлено убиквитин-протеосомозависимой деградацией, которая сопровождается опухолевой прогрессией и плохим прогнозом [14, 31]. Однако относительно рака эндометрия значимость данных параметров остается малоизученной, так как согласованного мнения по данному вопросу нет.

Молекулярные маркеры апоптоза

Апоптоз занимает ведущее место в эмбриогенезе и инволюции тканей, в поддержании клеточного баланса в физиологических условиях и при удалении клеток с генетическими повреждениями, при лучевых повреждениях, росте и терминальной дифференцировке, он запрограммирован в развитии организма, включая рождение и старость, здоровье и болезнь [12, 27, 32]. Баланс пролиферативных процессов, дифференциации и апоптоза является ключевым в нормальном функционировании клеток. В основе злокачественной трансформации клеток лежит активация единичных или множественных клеточных онкогенов или генов-супрессоров [5, 11].

Анализ данных литературы показал, что при гиперпластических процессах и раке эндометрия изучены лишь отдельные звенья как опосредованного через фактор некроза опухоли, так и митохондриального механизмов апоптоза [7, 9, 32]. При раке эндометрия наиболее изучено прогностическое значение онкогенов bcl-2, bax, с-erb B-2\HER-2\neu, c-myc и антионкогена р53. Bcl-2 является ведущим геном, определяющим механизм клеточной смерти, подавляя апоптоз. Этот ген кодирует образование белка, накапливающегося в митохондриях [4, 7, 24]. Экспрессия bcl-2 связана с факторами, указывающими на благоприятный прогноз, так как коррелирует с наличием рецепторов к стероидным гормонам и низкой степенью злокачественности [5, 15]. Высокая экспрессия bcl-2 выявляется в нормальном пролиферативном и гиперплазированном эндометрии без атипии, в то время как при атипической гиперплазии и в аденокарциноме его экспрессия существенно падает [3, 26, 30]. Это подтверждает тот факт, что данный протоонкоген не вовлечен в ранние процессы канце-рогенза, а выявленные значительные различия в экспрессии протоонкогена при простой и атипической гиперплазии позволяют предположить возможность использования bcl-2 в дифференциальной диагностике этих форм гиперплазии [2, 16, 26]. В последнее время появляются сведения о том, что экспрессия bcl-2, индекс bcl-2/ bax могут быть независимыми показателями общей и безрецидивной выживаемости [9, 12, 21]. Кроме того, в опухолях эндометрия, в отличие от нормального, атрофичного или гиперплазированного эндометрия, экспрессия bax, как правило, достаточно высока (85–89 %).

Повреждения гена р53 играют ключевую роль в канцерогенезе. Р-53 является продуктом гена-супрессора, регулирующего прохождение клетки по клеточному циклу, при необходимости репарации ДНК он тормозит пролиферацию клеток. Ген-супрессор р53 кодирует ядерный белок, модулирующий экспрессию генов, отвечающих за репарацию ДНК, деление клеток и апоптоз [2, 6, 21]. По меньшей мере, в половине всех случаев злокачественных опухолей обнаруживаются мутации в хромосоме 17 в области локализации гена-супрессора р53 [7, 32]. Основная роль гена р53 – регуляция процессов деления и контроль стабильности генома. Этот ген постоянно синтезируется в клетках, но является короткоживущим белком. Мутации гена р53 ведут к сверхэкспрессии этого белка, что и определяется при иммуногистохимическом исследовании [9, 19]. Мутации гена р53, часто встречающиеся в опухолях, приводят к синтезу функционально неполноценного белка, обладающего высокой стабильностью и накапливающегося в ядре, что иммуногистохимически выражается в отчетливом ядерном окрашивании. Выявлено, что AF-2 домен активированного Erά и С-терминальный регуляторный домен онкосупрессорного гена р53 способны к взаимодействию. Формирование данного комплекса приводит к утрате транскрипции р53-зависимых генов, к числу которых относят: гены, активация которых способствует подавлению клеточного цикла; гены, участвующие в р53-зависимомом апоптозе (Bax, ген Fas-рецептора, ген ингибитора IGF-I и IGF-II); гены, кодирующие ингибиторы ангиогенеза (тромбосподин I) [6, 9]. Таким образом, мутации р53 играют важную роль в патогенезе опухолевого роста, ассоциированы с агрессивностью клинического течения заболевания и с устойчивостью опухоли к химио- и лучевой терапии [10, 14, 28].

Во многих исследованиях убедительно показана роль сверхэкспрессии онкобелка HER-2\neu для оценки клинического течения и исхода заболевания при раке эндометрия [3, 4]. Протоонкоген с-erb B-2/HER-2/neu относится к семейству тирозин-киназных рецепторов эпидермального фактора роста, локализуется в 17-й хромосоме и кодирует трансмембранную тирозинкиназу рецептора ростового фактора. Амплификация этого онкогена может быть выявлена с помощью гибридизации in situ, а экспрессия кодируемого им белка р185 опре- деляется иммуногистохимически. Имеются данные о большом предсказательном значении онкогенной продукции специфического белка в отношении поведения опухоли по сравнению с количеством копий самого гена с-erb B-2 [2, 4, 32]. От активации гена с-erb B-2 зависит прогрессирование злокачественного процесса, что находит отражение в более быстром и частом возникновении рецидива, развитии метастазов и неблагоприятном исходе заболевания [7, 9].

Ген с-myc является центральным регулятором клеточного деления, находится в тесной взаимосвязи с геном р53 [6, 11]. Ген c-myc локализован в 8-й хромосоме, кодирует ядер-ный белок, являющийся транскрипционным фактором [12, 26]. Амплификация гена c-myc значительно чаще наблюдается в опухолях на поздних стадиях заболевания. Как правило, она коррелирует с высокой пролиферативной активностью новообразований, низкой степенью дифференцировки их клеток и уменьшением продолжительности жизни пациентов. В связи с этим амплификация гена c-myc служит неблагоприятным прогностическим показателем [11, 16, 25].

Маркеры ангиогенеза

Основными проявлениями злокачественного роста являются неограниченный инвазивный рост и метастазирование. Неоангиогенез – процесс формирования новых сосудов – является важнейшим патогенетическим звеном, поддерживающим эти свойства опухолей [5, 30, 37]. В настоящее время получены экспериментальные и клинические свидетельства, подтверждающие зависимость метастазирования от неоангиогенеза [3, 7]. Неоангиогенез является одним из определяющих факторов опухолевой прогрессии и играет ключевую роль в поддержании роста злокачественных новообразований и их метастатического потенциала [11, 13]. Определение риска возникновения рецидива, развития метастазов и исхода онкологического заболевания возможно по степени развития кровеносных сосудов в опухоли. В таких исследованиях для выявления эндотелиальных клеток используются маркеры – VIII фактор свертывания крови (Виллебрандта) и антигены CD31 и CD34. После проведения иммуногистохимического анализа антител к CD31 и CD34 проводится подсчет плотности сосудов в опухоли, которая является прогностическим признаком, часто не зависимым от других характеристик новообразования [5, 30]. В последнее время проведены иммунологические исследования с выявлением факторов ангиогенеза — сосудистого эндотелиального фактора (тимидин-фосфорилазы), гепатоцитарного ростового фактора — в различных опухолях. Было показано, что высокая экспрессия этих факторов при аденокарциноме эндометрия сопровождается большей инвазией, развитием метастазов и неблагоприятным исходом заболевания [12, 33].

Экспрессия PTEN

Ген PTEN играет важную роль в опухолевой супрессии, включая блок клеточного цикла и активацию апоптоза. Мутации данного гена и микросателитные нестабильности – часто встречающиеся генетические события при раке эндометрия [11]. Мутации опухолевого супрессорного гена PTEN относятся к наиболее ранним генетическим повреждениям при эндометриальной карциноме [7, 37]. Основываясь на целом ряде исследований, можно предположить, что потеря функции PTEN начинается на ранних стадиях эндометриального опухолевого генеза в условиях преобладания эстрогенов, что, как известно, увеличивает риск развития рака [9, 36]. При продолжительной стимуляции эстрогенами в условиях дефицита прогестинов железы эндометрия прекращают секрецию PTEN-протеинов [7, 32]. При этом смежные железы также могут быть PTEN-отрицательными, это предраковые повреждения, которые являются моноклональными [3, 17]. При определении PTEN-мутаций в случае предрака эндометрия их скорость составляет 55 %, при раке эндометрия – 83 % [6]. Таким образом, инактивация PTEN происходит во время инициации предрака из нормальных условий, и дополнительное повреждение PTEN аккумулируется при переходе из предопухолевого состояния в злокачественное новообразование. Снижение экспрессии PTEN является информативным показателем при эндометриальной неоплазии, включая предраковые повреждения [7, 18].

Таким образом, в настоящее время сообщается о более чем 100 прогностических фак- торах, дающих представление о клиническом поведении опухоли. Результаты проведенных международных исследований свидетельствуют о том, что при онкогинекологической патологии существует ряд иммуногистохимических критериев, которые позволяют прогнозировать течение опухолевого процесса и эффективность проводимого лечения. Однако согласованного мнения о прогностической роли иммуногистохимических маркеров при раке эндометрия в литературе не существует, что диктует необходимость дальнейшего изучения данной проблемы.