Иммуногистохимические показатели серозных карцином яичников и возможный механизм развития резистентности к препаратам платины

В настоящее время развитие резистентности к препаратам платины, формирующейся у 75–90 % больных раком яичников (РЯ), является острой проблемой клинической онкологии, резко снижающей шансы пациенток с распространенным РЯ на получение эффективной помощи и определяющей высокую летальность [1, 2]. При этом обнадеживающие результаты первых курсов лекарственного лечения не гарантируют сохранение платиночув-ствительности опухолей на дальнейших этапах терапии. Решение данной проблемы связано с выявлением механизмов развития платинорезистент-ности и поиском эффективных прогностических маркеров. На современном этапе еще не удалось выявить ни одного молекулярно-генетического, иммуногистохимического (ИГХ) или биохимического показателя, позволяющего прогнозировать развитие устойчивости к платиносодержащим режимам химиотерапии [3–5], подобно тому, как это имеет место в отношении выживаемости пациентов с опухолями некоторых других локализаций [6–8].

Известно о связи мутаций в генах BRCA 1/2 c чувствительностью к препаратам платины при РЯ и раке молочной железы (РМЖ) [9]. Однако чувствительностью к указанным факторам могут обладать и пациентки, у которых такие мутации отсутствуют. Ранее в качестве маркеров динамики чувствительности РЯ к препаратам платины рассматривались показатели активности белка ERRCI [6, 7], однако дальнейшие исследования не подтвердили их прогностическую значимость [8, 9]. Распространенность случаев отсутствия сверхэкспрессии эффлюксных белков при платинорезистентном РЯ и выраженного лечебного эффекта при ингибировании их активности [10, 11] свидетельствует о малой изученности кон- кретных форм участия белков-транспортеров в развитии лекарственной резистентности. Остается открытым вопрос о соотношении эффлюкса противоопухолевых химиопрепаратов и транспорта эндогенных проопухолевых факторов, о динамике пролиферативных и транспортных процессов [12]. Не исследована роль не связанных с изменением генов регуляторных нарушений, развивающихся на различных структурно-функциональных уровнях организма, которые могут проявляться не только в виде резких сдвигов тех или иных показателей, но и в изменении динамики их соотношений и корреляционных связей на фоне терапии [13, 14]. Все вышесказанное обусловливает целесообразность проведения комплексного исследования, направленного на уточнение информативности ИГХ характеристик карцином яичников и их статистических связей для прогноза динамики чувствительности опухолей к лекарственной терапии с использованием препаратов платины.

Целью исследования явилось определение информативности иммуногистохимических показателей серозных карцином яичников и их статистических связей после неоадъювантного лечения для оценки развития резистентности опухолей к платиносодержащим режимам адъювантной полихимиотерапии (АПХТ).

Материал и методы

Ретроспективно изучены ИГХ показатели в ткани опухолей яичников у больных РЯ IIIC–IV стадии постменопаузального возраста (49–72 года), у которых был отмечен положительный эффект на неоадъювантную полихимиотерапию (НАПХТ), позволивший перейти к этапу хирургического лечения в объеме оптимальной циторедукции и последующей АПХТ. По данным гистологического исследования у всех пациенток наблюдалась серозная карцинома высокой степени злокачественности (high grade). Больным проводилось 3 курса НАПХТ карбоплатином и паклитакселом. Схема АПХТ также включала карбоплатин и паклитаксел, количество курсов варьировало от 4 до 6. Всем пациенткам проводились стандартные клиниколабораторные исследования в соответствии с клиническими рекомендациями [15], включая определение концентрации сывороточных маркеров СА-125 и Не-4. Всем больным исследован мутационный статус генов BRCA 1/2 с помощью метода HRM-PCR (High Resolution Melt Polymerase chain reaction) и секвенирования по Сэнгеру.

Больные были распределены на 2 группы в зависимости от сроков развития рецидива заболевания, по которому определялась чувствительность опухоли к платиносодержащим режимам АПХТ [15]. В группу больных с опухолями, сохранившими чувствительность к АПХТ (платиночувствительные опухоли), вошло 59 женщин, у которых рецидив РЯ развился в сроки, превышавшие 6 мес с момента окончания последнего курса АПХТ. Группу больных с опухолями, резистентными к платиносодержащим режимам АПХТ (платинорезистентные опухоли), составили 22 пациентки, у которых прогрессирование отмечено на фоне проведения АПХТ или в течение 6 мес после ее завершения. Четвертая стадия РЯ выявлена у 17 (29 %) больных с платиночувствительными опухолями и у 7 (32 %) пациенток с платинорезистентными карциномами. Больные исследованных групп не имели значимых различий по распространенности процесса, возрасту, характеру и выраженности сопутствующих заболеваний.

В последние годы для оценки ответа распространенного РЯ на химиотерапию часто используется система CRS (Chemotherapy Response Score), предусматривающая оценку изменений в ткани большого сальника на фоне НАПХТ. Имеются противоречивые данные об информативности показателей CRS в отношении прогноза платиноре-зистентности, а также отмечается недостаточная стандартизация методических подходов при их определении [16]. В силу этого мы сочли целесообразным использовать традиционные критерии лечебного патоморфоза и сосредоточиться на изменениях в опухолях яичников как при оценке лечебного патоморфоза НАПХТ, так и при выявлении связи резистентности с особенностями экспрессии ИГХ показателей. В результате при гистологическом исследовании опухолевой ткани в обеих группах после НАПХТ отмечены четко выраженное нарушение структуры опухоли и уменьшение ее площади на 30 % и более, а также другие признаки, указывающие на лечебный патоморфоз II или III степени по Г.А. Лавниковой [17].

В ткани серозных карцином яичников, полученных после проведения НАПХТ, с помощью ИГХ методов проводили сравнительное изучение пролиферативной активности (Ki67), а также экспрессии белка эксцизионной репарации ДНК ERCC1 и двух белков семейства АВС-транспортеров – Pgp и BCRP. Для этого использовали поликлональные кроличьи антитела к Pgp (или MDR1, 1:600) и ERCC1 (1:300) фирмы Affinity Biosciences, поликлональные кроличьи антитела к Ki67 (1:200, Diagnostic BioSystem), моноклональные мышиные антитела к BCRP (клон JF0994, 1:300, Hangzhou HuaAn Biotechnology Co.Ltd.). Срезы докрашивали гематоксилином Карацци, для заключения использовали витрогель. Оценка результатов ИГХ реакции проводилась с применением светового микроскопа «AxioLab.A1» (Германия) при ×10, ×20 и ×40.

Для определения экспрессии Ki67 подсчитывали процентное содержание окрашенных в результате ИГХ реакции опухолевых клеток, приходящихся на 100 опухолевых клеток. В соответствии с традиционным способом оценки значения 0–20 % расценивали как низкие, 21–50 % – как умеренные

Рис. 1. Микрофото. Различная выраженность экспрессии белка ERRC-I в серозных карциномах яичников, ×200. А – отсутствие экспрессии; Б – низкая экспрессия, 1+; В – высокая экспрессия, 2+. Примечание: микрофото выполнены авторами

Fig. 1. Microphoto. Different expression of ERRC-I protein in serous ovarian carcinomas, ×200. A – lack of expression; B – low expression, 1+; C – high expression, 2+. Note: created by the authors

и 51–100 % – как высокие. Аналогичным образом, но с применением более подробной градации, оценивали экспрессию маркеров Pgp, BCRP и ERCC1: 1 (0–10 %), 2 (11–50 %), 3 (50–74 %), 4 (>75 %). При этом выраженность экспрессии ИГХ параметров в клетке определяли также полуколичественно по интенсивности окрашивания: 1+ – низкая, 2+ – умеренная, 3+ – высокая. Экспрессия считалась положительной при оценке не менее 2 по каждой из двух указанных шкал. На рис. 1 представлены микрофотографии ткани серозных карцином яичников у больных с различной выраженностью экспрессии ИГХ маркеров на примере белка эксцизионной репарации ДНК ERCC1.

Межгрупповые сравнения показателей проводили с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни (U-критерий) и критерия согласия Пирсона χ2. В силу важности выявления критических величин, имеющих прогностическое значение, при анализе вариационных рядов обращали внимание на минимальные и максимальные значения рассматриваемых показателей (xmin – xmax) [18]. Статистические связи между исследованными показателями оценивали с помощью рангового коэффициента корреляции Спирмена (с оценкой его статистической значимости) и общепринятой градации выраженности («тесноты») связи на «слабую», «умеренную», «заметную» и «высокую», определяемой абсолютным значением коэффициента (шкала Чеддока). Использовали пакет программ «Statistica 13.3» (StatSoft Inc., США).

Исследования проведены с соблюдением «Этических принципов проведения научных медицинских исследований с участием человека» и в соответствии с «Правилами клинической практики в Российской Федерации».

Результаты и обсуждение

Медиана продолжительности безрецидивного периода у больных с платиночувствительными опухолями составила 19 мес, у больных с платинорезистентными опухолями – 5,2 мес (р=0,00001 Log-Ranktest). Также в исследуемых группах более чем в 2 раза различались показатели 3-летней общей выживаемости: у больных с чувствительностью к АПХТ – 51 %, у больных с резистентным течением – 23 % (p<0,05). Межгрупповые различия в выраженности токсических осложнений АПХТ не отмечены.

При молекулярно-генетическом исследовании у больных с платинорезистентным течением заболевания случаев мутаций в генах BRCA 1/2 не выявлено. У пациенток с опухолями, сохранившими чувствительность к АПХТ с карбоплатином, не наблюдались герминальные мутации в гене BRCА2 . В гене BRCA1 мутации выявлены у 8 из 59 таких больных (13 %). Эти мутации относились к 4 патогенным типам – 5382insC, 300T>G (C61G), 2080delA и c.1960A>T. При этом наиболее часто (n=4) встречалась минорная для российской популяции мутация 300T>G(C61G). В одном случае наблюдалась мутация Asp 1344del с неопределенным клиническим значением. Таким образом, в ходе исследования не отмечено связи между развитием платинорезистентности серозных карцином яичников на этапе АПХТ и наличием герминальных мутаций в генах BRCA 1/2 больных РЯ.

При изучении ИГХ показателей состояния ткани серозных карцином яичников после НАПХТ в целом выявлены признаки более высокого уровня пролиферации (Ki67), а также более высокой активности белков ERCC1, Pgp и BCRP у больных при развития резистентности к препаратам платины на этапе АПХТ (табл. 1, 2). В то же время у больных с платиночувствительными карциномами также отмечены случаи выраженной экспрессии исследуемых факторов, а у пациенток с платинорезистентными карциномами нередко встречались случаи сниженной экспрессии того или иного фактора. В наибольшей степени это

Таблица 1/Table 1

Характеристики пролиферативной активности после НАПХТ в серозных карциномах яичников, продемонстрировавших в дальнейшем различную чувствительность к платиносодержащим режимам АПХТ

Characteristics of proliferative activity in serous ovarian carcinomas after NAPCT, which further demonstrated different sensitivity to platinum-containing APCT regimens