Иммуногистохимическое исследование MSH2, MSH6, PMS2, MLH1 в определении степени злокачественности аденокарциномы толстой кишки

Использование иммуногистохимических методов для исследования системы репарации неспаренных нуклеотидов имеет свои особенности и ограничения. В основном мутация MMR-генов сопровождается деградацией соответствующего белка и отрицательной иммуногистохимической реакцией. Иммуногистохимия, однако, не способна дифференцировать белок с миссенс-мутацией от дикого типа белка. Около 30 % случаев мутаций в MLH1 носят миссенс-характер, которые приводят к потере его функции, но сохраняют антигенные свойства [9]. Однако MMR-протеины функционируют в виде гетеродимеров [4]. MSH2 димеризуется с MSH6, образуя функциональный комплекс MutSα38, а MLH1 димеризуется с PMS2, формируя MutLα [3]. MLH1 – облигатный партнер PMS2, соответственно, нарушение структуры MLH1 приводит к разрушению димера и потере экспрессии второго белка. Однако мутации PMS2 и MSH6 не обязательно приводят к деградации их партнеров, потому что MLH1 и MSH2 могут альтернативно связываться с MSH3, MLH3 и PMS1. Тем не менее иммуногистохимическое исследование PMS2 позволяет выявлять миссенс-мутации MLH1, даже в условиях его антигенной сохранности [10]. Мутации же данных генов во всех исследованных случаях сопровождаются выпадением экспрессии исследованных генов, но не наоборот. Это связано с тем, что в ряде случаев негативная иммуногистохимическая реакция является отражением гиперметилирования исследованного гена.

Микросателлитная нестабильность связана с нарушением функций генов MSH2, MLH1, PMS2 и MSH6, которые в норме осуществляют репарацию неспаренных нуклеотидов ДНК [5–7]. В наших предыдущих исследованиях во всех случаях с негативной реакцией хотя бы на один из исследованных маркеров (MLH1, PMS2, MSH2, MSH6) наблюдалась микросателлитная нестабильность [1]. В настоящее время известно, что микро-сателлитная нестабильность – это независимый прогностический фактор, определяющий степень злокачественности рака толстой кишки [2].

Таблица 1

Характеристика антител к белкам генов репарации неспаренных нуклеотидов ДНК

Антитело	Характеристика	Разведение	Фирма-производитель
MSH6	Кроличье, клон EPR3945	1:200	Abcam
MSH2	Мышиное, клон 25D12	1:20	DBS
PMS2	Мышиное, клон MOR4G	1:40	Novocastra Leica
MLH1	Мышиное, клон ES05	1:25	Novocastra Leica

Материал и методы

В исследование вошли 39 больных аденокарциномой толстой кишки, из них 26 женщин и 13 мужчин. Средний возраст составил 59 лет. Распределение по гистологической дифференцировке: умереннодифференцированная аденокарцинома – 28 (72 %), высокодифференцированная аденокарцинома – 3 (8 %), низкодифференцированная аденокарцинома – 5 (12 %), муцинозная аденокарцинома – 3 (8 %) случая.

Иммуногистохимическое исследование проводилось по стандартному протоколу: срезы с парафиновых блоков наносились на поли-L-лизиновые стекла с последующей инкубацией их при температуре 35–37°С в условиях термостата с целью плотного их прикрепления. Затем выполнялась депарафинизация материала в ксилоле, отмывка в 96 % и 70 % этиловых спиртах, дистиллированной воде. После этого проводилась демаскировка антигенов при температуре 96°С в буфере Antigen Retrieval Solution (DAKO), pH 9,0. Последовательно выполнялись ингибирование эндогенной пероксидазы 3 % перекисью водорода, инкубация первых антител к MSH2, MSH6, PMS2, MLH1 (табл. 1); выявление комплекса антиген – антитело осуществлялось при помощи системы визуализации DakoEnVision и диаминобензидина в качестве хромогена.

Окрашивание ядер осуществлялось при помощи гематоксилина Майера (инкубация была уменьшена в сравнении со стандартным протоколом). Оценивалась только ядерная реакция. Внутренним контролем была нормальная слизистая оболочка, прилежащая к аденокарциноме. Экспрессия считалась утраченной в случае, если более 50 % раковых клеток демонстрировали негативную реакцию. Отдельно отмечались случаи со сниженной экспрессией (менее 90 % клеток с позитивной реакцией).

Результаты исследования и обсуждение

Из 39 исследованных случаев в 6 (15 %) наблюдениях было выявлено выпадение экспрессии как минимум одного из исследованных маркеров (MSH2, MSH6, PMS2, MLH1) (рис. 1). В 4 случаях наблюдалась отрицательная иммуногистохимическая реакция на MLH1 и PMS2, а в 2 наблюдениях – на MSH6 и MSH2. Данный результат показывает, что 15 % изученных аденокарцином толстой кишки можно считать сцепленными с микросателлитной нестабильностью высокой степени (MSI-H). По данным N.M. Lindor et al. [8], при проведении исследования MSI и MMR с использованием иммуногистохимии и ПЦР потеря экспрессии MSH2 и MLH1 в 100 % случаев сопровождается микро-сателлитной нестабильностью высокой степени. В наших предыдущих исследованиях мы получили аналогичные результаты [1]. Это особенно важно, потому что, согласно современной классификации ВОЗ, считается, что аденокарцинома толстой кишки с MSI-H имеет низкую степень злокачественности, независимо от ее гистологической дифференцировки [2]. В наших наблюдениях из 6

Рис. 1. Иммуногистохимическое исследование MSH6, MLH1 в аденокарциноме толстой кишки: а) интенсивная ядерная реакция на MSH6 в клетках аденокарциномы; б) выпадение экспрессии MLH1 в аденокарциноме (верхняя часть фотографии) в сравнении с сохранной ядерной реакцией в нормальной слизистой оболочке (нижняя часть снимка). ×200

Таблица 2

Распределение изученных случаев аденокарциномы толстой кишки по степени злокачественности в зависимости от использования критерия микросателлитной нестабильности

Вид аденокарцином толстой кишки Определение степени злокачественности без учета MSI (только гистологическая дифференцировка) Определение степени злокачественности с учетом MSI Низкой степени злокачественности (lowgrade) 31 (79 %) 35 (90 %) Высокой степени злокачественности (highgrade) 8 (21 %) 4 (10 %) случаев с косвенными признаками MSI-H 3 аденокарциномы были низкодифференцированными, 1 – муцинозной, 2 – умереннодифференцированными. Таким образом, без учета MSI четыре (10 %) случая из 39 были бы ложно расценены как опухоли высокой степени злокачественности (табл. 2).

Заключение

Иммуногистохимическое исследование генов репарации ДНК совместно с оценкой гистологической дифференцировки опухоли может быть использовано для определения степени злокачественности аденокарциномы толстой кишки. Если использовать для определения степени злокачественности данной опухоли только гистологическую дифференцировку, то в 10 % случаев она будет оценена неверно.