Cytology of the bone marrow of rats in experimental model of toxic hemolytic anemia

Гемолитические анемии составляют примерно 5% всех анемий [7]. Приобретенные токсические гемолитические анемии в последнее время становятся чрезвычайно актуальны в связи с постоянно возрастающими антигенными нагрузками [2, 7, 8]. В настоящее время все еще остается немало спорных вопросов, касающихся патогенеза и патоморфологии приобретенных гемолитических анемий, ответы на которые могут дать только экспериментальные исследования, в связи с чем разработка новых экспериментальных моделей приобретенных гемолитических анемий является актуальной задачей.

Цель исследования : создание модели приобретенной токсической гемолитической анемии путем введения экспериментальным животным 2-бутоксиэтанола и изучение ее миелограммы и иммунологии.

Материалы и методы

В эксперименте задействовано 40 животных – нелинейных белых крыс (самцов и самок) четырехмесячного возраста, с массой тела 150–200 г, содержащихся в стандартных условиях экспериментально-биологической клиники – вивария (свободный доступ к пище и воде и 12–14 часовой световой день). Все эксперименты выполнены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. N 755) и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18.III.1986 (Текст изменен в соответствии с положениями Протокола (ETS № 170), после его вступления в силу 2 декабря 2005 года; Лиссабонский договор о внесении изменений в Договор о Европейском союзе и Договор об учреждении Европейского сообщества вступили в силу 1 декабря 2009 года).

Моделирование приобретенной токсической гемолитической анемии осуществляли по оригинальной методике (Способ моделирования приобретенной токсической гемолитичсеской анемии в эксперименте. Приоритетная справка от 11 июля 2013 г.) путем однократного интраперитонеального введения лабораторному животному 2-бутоксиэтанола (ВЕ) в эмпирически выбранной дозировке 20 мг/кг массы тела (4 мг на животное). 2-Бутоксиэтанол (C6H14O2) – широко используемый во многих отраслях промышленности реагент; к настоящему времени в условиях in vitro установлено, что метаболиты 2-бутоксиэтанола являются сильными гемолитическими ядами; Ghanayem B.I., Sullivan Ch.A., 1993, проведено исследование in vitro, в котором определяли влияние BE на эритроциты из 10 видов млекопитающих, включая человека; в исследованиях была установлена видовая специфичность в отношении развития гемолитической анемии под действием бутоксиэтанола [4]. Однако способа экспериментального моделирования приобретенной

токсической гемолитической анемии с использованием 2-бутоксиэтанола в литературе не найдено. Сформировано 2 экспериментальных группы по 20 животных в каждой: I группа – интактные животные, находящиеся в стандартных условиях вивария, II группа – введение ВЕ.

Ежедневное наблюдение за животными включало в себя регистрацию поведения, внешнего вида, физиологических функций. До начала эксперимента и по его окончании у животных исследовали показатели периферической крови: количество эритроцитов, ретикулоцитов, концентрацию гемоглобина. Перед началом эксперимента забирали венозную кровь у животных в количестве 60–100 мкл для получения индивидуальной эритромассы с целью использования ее в последующих иммунологических исследованиях и проб сыворотки. На 10 сутки проведения эксперимента животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии и осуществляли забор аутопсийного материала для последующего гистологического исследования (селезенка, тимус, пейеровы бляшки), а также забор венозной крови для получения сыворотки и постановки реакции агглютинации. Из костного мозга бедренной кости готовили мазок, фиксировали и окрашивали по Майн-Грюнвальду, Романовскому-Гимзе и микроско-пировали под иммерсией, подсчитывая по 500 клеток в мазке. Статистический анализ выполнен при помощи программного пакета Biostat.

Гистологическое исследование выполнено в соответствии со стандартными методиками с использованием окраски гематоксилином и эозином [Ромейс Б., 1954; Лилли Р., 1969]. Визуализацию и фотосъемку микропрепаратов проводили на микроскопе Micros (Австрия) в программе Scope Photo. Количественный анализ изображений осуществляли в программе ImageJ. Проводя гистометрический анализ ткани селезенки, определяли относительный объем белой пульпы, используя функцию «Сетка».

По окончании эксперимента проводили реакцию агглютинации сывороткой животных аутологичных эритроцитов, полученных в начале эксперимента в соответствии с Инструкцией по применению диагностикума клещевого энцефалита сухого для РТГА, РСК, РРГ и РТНГА Минмедпрома СССР; 1990. Пробы инкубировали в течение 2 час. при температуре +4° С и затем – в течение 30 минут при температуре +37° С (для выявления действия тепловых и холодовых антител). Результаты реакции оценивали общепринятым способом и выражали с учетом log-нормального распределения данных в виде log2-обратных титров антител. Статистический анализ полученных данных выполнен при помощи программного обеспечения Biostat.

Результаты

Во время проведения эксперимента не отмечено случаев гибели животных. У животных, подвергнутых внутрибрюшинному введению 2-бутоксиэтанола, к 30

суткам эксперимента отмечалась тенденция к гиперплазии эритроидного ростка, что проявлялось в увеличении индекса созревания эритрокариоцитов – 2,7 ± 0,03 в сравнении с контрольной группой – 1,2 ± 0,08 (p < 0,05). При этом лейкоэритробластическое соотношение у животных опытной группы составило 1,29 ± 0,012, контрольной – 1,48 ± 0,042 (p > 0,05), то есть не отличалось от средних нормальных показателей [3, 5]. Полученные данные могут свидетельствовать о том, что при токсической гемолитической анемии, как и при любой другой гемолитической анемии, костный мозг стремится компенсировать потерю эритроцитов стимуляцией эритропоэза, но в условиях токсического воздействия эта стимуляция оказывается неэффективной.

При проведении анализа показателей периферической крови в опытной группе к концу эксперимента выявлено статистически значимое снижение концентрации гемоглобина и уменьшение количества эритроцитов по сравнению с исходными данными. Результаты исследования количества ретикулоцитов в мазках: интактные животные: 1,429 ± 0,192% до начала эксперимента, 1,787 ± 0,235% по окончании эксперимента; (p > 0,05); введение ВЕ: 1,488 ± 0,115% до начала эксперимента, 4,322 ± 0,127% по окончании эксперимента (p < 0,05).

Результаты реакции агглютинации: I группа – отсутствие агглютинации во всех лунках планшета; II группа – средние значения 6,2 ± 0,15. Таким образом, присутствие антител к собственным эритроцитам выявлено в группе с введением BE, то есть введение бутоксиэтанола провоцирует развитие аутоиммунной реакции, направленной в отношении собственных эритроцитов.

Гистологическое строение ткани тимуса животных I группы соответствовало видовой норме. Гистологическое исследование ткани тимуса животных II группы выявило участки гибели лимфоцитов как в корковом, так и в мозговом слоях. При этом у 40% животных в корковом слое гибель лимфоидных клеток была более выражена, чем в мозговом, что обеспечило наличие феномена инверсии слоев, также у 40% животных группы гибель лимфоцитов отмечалась как в корковом, так и в мозговом слое тимуса, что морфологически выражалось в исчезновении инверсии. У 20% животных этой экспериментальной группы строение долек не было нарушено, но на этом фоне отмечались участки гибели лимфоцитов, в основном, в корковом веществе. У четырех животных группы (20%) в дольках отмечалось замещение лимфоидной ткани жировой тканью. Также в кортикальном и медуллярном слоях у всех животных группы выявлялись участки кол-лагенизации стромы.

У 4-х животных группы (20%) в мозговом слое тимуса выявлялись кистозно-расширенные тимусные тельца. У 70% животных в корковом слое долек также выявлялись эпителиальные канальцы, выстланные кубическими эпителиальными клетками. У всех животных, подвергнутых внутрибрюшинному введению ВЕ, в ткани

тимуса выявлялись в большом количестве тучные клетки – крупные клетки с базофильными гранулами, нередко имеющие неправильную форму. Тучные клетки обнаруживали, в основном, в междольковой соединительной ткани, в соединительной ткани перегородок внутри долек вблизи кровеносных сосудов, но также и в паренхиме тимуса – в корковом веществе долек, в участках гибели лимфоидных клеток.

Таким образом, у животных, которым интраперитонеально был введен ВЕ с целью моделирования приобретенной токсической гемолитической анемии, гистологически мы выявляли признаки акциденталь-ной инволюции тимуса, сопровождающей, по Г. Селье, острый стресс.

Строение ткани селезенки интактных животных соответствовало видовой норме; относительный объем белой пульпы в селезенке здоровых крыс составляет в среднем 30,18 ± 2,69%. В селезенке животных опытной группы выявлено значительное уменьшение относительного объема белой пульпы (16,33 ± 0,55%; p < 0,05 по сравнению с контрольной группой). У всех животных обнаружен выраженный гемосидероз красной пульпы, а также ее обеднение клеточными элементами (100%) на фоне полнокровия синусоидных капилляров (80%). Как в красной, так и в белой пульпе выявлялись очаги гибели лимфоидных клеток. Таким образом, при исследовании селезенки животных, подвергнутых введению ВЕ, мы наблюдали те же закономерности, что и при исследовании ткани тимуса – редукцию лимфоидной ткани, соответствующую реакции организма на стресс.

При исследовании стенки тонкой кишки животных контрольной группы отмечается типичное строение всех оболочек; в собственной пластинке слизистой оболочки подвздошной кишки определяются агрегированные лимфоидные узелки (пейеровы бляшки). У всех животных опытной группы в лимфоидной ткани собственной пластинки слизистой оболочки тонкой кишки выявлена коллагенизация соединительной ткани, ее избыточное образование, и участки гибели лимфоцитов. То есть, при введении ВЕ мы наблюдали редукцию лимфоидной ткани в пейеровых бляшках, что не противоречит существующим данным в учении о стрессе, поскольку при остром стрессе наблюдается уменьшение лимфоидной ткани не только в тимусе и селезенке, но и лимфатических узлах, а пейеровы бляшки по сути являются аналогами лимфатических узлов.

Обсуждение полученных данных

Известно, что при токсических, в частности, лекарственно-индуцированных гемолитических анемиях наблюдается эритроидная гиперплазия костного мозга [6]. Тем не менее, современные исследования свидетельствуют и о том, что при гемолитических анемиях, вызванных сильнодействующими токсическими веществами, стимуляция эритропоэза на ранних сроках формирования гемолитической анемии со временем сменяется его подавлением, что сопровождается уменьшением числа пролиферирующих эритроидных клеток-предшественников, несмотря на повышение секреторной активности адгезирующих миелокариоцитов, увеличение эритропоэтической активности сыворотки крови, усиление формирования эритроидных гемопоэтических островков и ускорение созревания кроветворных клеток [9]. По-видимому, эта тенденция, установленная в отношении фенилгидразиновой токсической гемолитической анемии [9], справедлива и для модели токсической гемолитической анемии, вызванной введением 2-бутоксиэтанола.

Выводы

• 1.    Внутрибрюшинное введение экспериментальным животным гемолитического яда – 2-бутоксиэтанола к 30 суткам эксперимента не сопровождается выраженной стимуляцией эритропоэза. Полученные результаты можно объяснить токсическим действием 2-бутоксиэтанола.

• 2.    При введении 2-бутоксиэтанола в центральных и периферических органах иммуногенеза отмечается редукция лимфоидной ткани, соответствующая реакции организма на стресс.

• 3.    Интраперитонеальное введение бутоксиэтанола провоцирует развитие аутоиммунной реакции, направленной в отношении собственных эритроцитов.